一种HTCP荧光探针及其用途

本发明涉及物质定量检测，尤其是指一种htcp荧光探针及其用途。

背景技术：

1、生命系统中的物质变化和能量转换是由众多化学反应共同作用的结果。氧化还原反应是一种重要的细胞生化反应，参与能量产生、信号转导、增殖、分化、凋亡等多种生理和病理过程。机体中氧化物质含量异常高时不仅对dna和蛋白质造成严重破坏，还会引发一系列疾病，如炎症、动脉粥样硬化、神经退行性疾病和癌症。为了减轻氧化损伤和维持氧化还原动态平衡，抗氧化剂起着关键作用。体内起氧化还原作用的物质很多，其中，半胱氨酸、过氧化氢是重要的氧化还原性物质。

2、半胱氨酸（cys）是生物硫醇之一，它是一种半必需氨基酸（aa），因为它可以从饮食中获得，也可以通过硫磺途径降解蛋氨酸而产生。在哺乳动物的饮食中，半胱氨酸被认为是含硫氨基酸的代表。在我们体内最丰富的形式是l-半胱氨酸。在人体血浆中，半胱氨酸浓度水平为240-360μm，在人体内的生物过程中起着重要的作用。它参与催化许多重要的代谢反应，是维持体内氧化还原平衡过程中的关键调节物质，同时参与蛋白质合成，转录后修饰，以及体内代谢重金属的解毒过程。半胱氨酸含量失常时会对机体产生严重影响，可作为许多疾病的生物标志物，如生长迟缓、帕金森症、心血管疾病等。因此，定量检测生物体中半胱氨酸浓度具有重要的应用价值。目前用来定量检测生物硫醇的传统方法主要包括高效液相色谱（highperformanceliquidchromatography,hplc）、滴定分析、质谱学（massspectrometry,ms）和电位法（electrochemicalmethod,em），然而这些分析方法操作复杂，成本较高；相较之下，荧光技术具有灵敏度高、检测限低、实时检测、简单、经济等优点，得到了广泛应用。研究表明，已报道的半胱氨酸荧光探针主要基于裂解、环化、michale加成反应和其他反应机理，同时以丙烯酸酯、α,β-不饱和酮基为识别基团实现对半光氨酸的检测。

3、但以上探针仍存在如合成繁琐、斯托克斯位移小、选择性不高、灵敏度欠缺、生物适应性差、响应时间较长等不足，因此，在探针的设计中，需要考虑高选择性、高灵敏度、高光学稳定性、大斯托克斯位移、近红外区发射和良好的溶解性等。

4、迄今为止，各种用于不同领域的新型荧光探针不断被人们发掘，但到目前为止以羟基三氰基吡咯（htcp）（分子式如下）为受体检测生物小分子的荧光探针少有报道。因而此方向值得进行深入研究。

5、

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供一种htcp荧光探针及其用途，基于分子内电荷转移（ict）机制设计合成了三种以htcp为受体的荧光探针，各探针对其分析物均具有较高的选择性和灵敏度；初步验证了探针的光学性质及其识别性能，为氧化还原性物质的定量测定和浓度监测提供了新的途径。

2、为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

3、一种htcp荧光探针，基于htcp分别合成了“off-on”荧光探针htcp-cys、小分子近红外荧光探针bpin-h2o2及小分子近红外荧光探针phbpin-h2o2；

4、所述“off-on”荧光探针htcp-cys的具体合成方法如下：

5、；

6、所述小分子近红外荧光探针bpin-h2o2的具体合成方法如下：

7、；

8、所述小分子近红外荧光探针phbpin-h2o2的具体合成方法如下：

9、。

10、优选地，合成所述“off-on”荧光探针htcp-cys具体包括以下步骤：

11、s11，htcp的合成及表征：向圆底烧瓶中加入1,1,3-三氰基-2-氨基-1-丙和2,3-丁二酮，加去离子水搅拌均匀后，再缓慢加入naoh溶液，室温搅拌7h，反应完成后直接抽滤，然后用dcm洗，滤渣经冷冻干燥后得白色粉末，即为产物；通过1hnmr、13cnmr进行表征；

12、s12，htcp中间体的合成及表征：向烧瓶中加入htcp，对羟基苯甲醛和乙酸铵，加入无水乙醇，置于磁力搅拌器上常温反应5h；反应完成后，在烧杯中加入大量石油醚，用吸管将反应液吸入石油醚中，重结晶析出橙红色结晶即为中间体；随后进行抽滤，干燥后得到纯净的中间体；通过1hnmr、13cnmr进行表征；

13、s13，探针htcp-cys的合成及表征：向烧瓶中加入htcp中间体，用无水乙腈溶解后，于冰浴中加入三乙胺，溶液变为紫色；搅拌两分钟后加丙烯酰氯，溶液变黄且有大量白烟，反应15min后取出反应瓶，随后用硅胶柱层析进行纯化，以二氯甲烷/甲醇作流动相进行洗脱，用旋转蒸发仪去除洗脱剂，真空干燥，得黄色固体；通过1hnmr、13cnmr和esi-ms进行表征。

14、优选地，合成所述小分子近红外荧光探针bpin-h2o2具体包括以下步骤：

15、s21，htcp的合成及表征：向圆底烧瓶中加入1,1,3-三氰基-2-氨基-1-丙和2,3-丁二酮，加去离子水搅拌均匀后，再缓慢加入naoh溶液，室温搅拌7h，反应完成后直接抽滤，然后用dcm洗，滤渣经冷冻干燥后得白色粉末，即为产物；通过1hnmr、13cnmr进行表征；

16、s22，探针bpin-h2o2的合成及表征：取4-甲酰基苯硼酸频哪醇酯，htcp，乙酸铵置于圆底烧瓶中，加入的无水乙醇中，混合物在室温下搅拌6h；反应完成后，通过柱色谱法纯化，使用二氯甲烷/甲醇作为流动相进行洗脱，得到黄色固体；通过1hnmr、13cnmr和esi-ms进行表征。

17、优选地，合成所述小分子近红外荧光探针phbpin-h2o2具体包括以下步骤：

18、s31，htcp的合成及表征：向圆底烧瓶中加入1,1,3-三氰基-2-氨基-1-丙和2,3-丁二酮，加去离子水搅拌均匀后，再缓慢加入naoh溶液，室温搅拌7h，反应完成后直接抽滤，然后用dcm洗，滤渣经冷冻干燥后得白色粉末，即为产物；通过1hnmr、13cnmr进行表征；

19、s32，化合物3的合成：取对羟基苯甲醛，4-溴甲基苯硼酸频哪醇酯，碳酸钾置于圆底烧瓶中，加入无水乙腈，在80℃下回流7h；反应完后用水和乙酸乙酯萃取，收集有机层浓缩之后得到化合物3；

20、s33，取化合物3，htcp，乙酸铵加入无水乙醇中，混合物在室温下搅拌6h，反应完成后，通过柱色谱法纯化，使用二氯甲烷/甲醇作流动相进行洗脱，得到黄色固体；通过1hnmr、13cnmr和esi-ms进行表征。

21、上述任意一项所述的一种htcp荧光探针的用途，基于htcp的“off-on”荧光探针htcp-cys应用于半胱氨酸的检测；基于htcp的小分子近红外荧光探针bpin-h2o2应用于h2o2的检测；基于htcp的小分子近红外荧光探针phbpin-h2o2应用于h2o2的检测。

22、本发明的有益效果：

23、（1）本发明设计并合成了基于htcp的“off-on”荧光探针htcp-cys，并成功地将其应用于半胱氨酸的检测。该探针通过“ict”机制对半胱氨酸进行特异性地响应。半胱氨酸与探针的丙烯酸酯基团成环离去，o-加长了共轭结构，从而导致荧光信号的变化。探针的荧光强度与分析物浓度具有较好的线性、选择性和较低的检出限（40.36nm）。

24、（2）本发明设计并合成了基于htcp的小分子近红外荧光探针bpin-h2o2，并成功地将其应用于h2o2的检测。该探针以硼酸酯基为响应基团，与过氧化氢发生氧化反应，使共轭结构延长，导致探针的发射波长发生变化，对h2o2进行特异性地响应。探针的荧光强度与分析物浓度具有较好的线性、选择性和较低的检出限（102.02nm）。

25、（3）本发明设计并合成了基于htcp的小分子近红外荧光探针phbpin-h2o2，并成功地将其应用于h2o2的检测。该探针以芳基硼酸酯基为响应基团，与过氧化氢发生氧化反应，使共轭结构延长，导致探针的发射波长发生变化，对h2o2进行特异性地响应。探针的荧光强度与分析物浓度具有较好的线性、选择性和较低的检出限（310.93nm）。

26、综上所述，本发明基于分子内电荷转移（ict）机制设计合成了三种以htcp为受体的荧光探针，各探针对其分析物均具有较高的选择性和灵敏度；初步验证了探针的光学性质及其识别性能，为氧化还原性物质的定量测定和浓度监测提供了新的途径。