一种手性绿色荧光硅纳米颗粒的制备及在识别检测谷氨酸对映体中的应用

本发明涉及一种水溶性手性绿色荧光硅纳米颗粒的制备，主要用于识别谷氨酸对映体，属于化学化工领域和手性材料领域。

背景技术：

1、氨基酸是生物体内重要的手性生物活性分子，可作为临床常规用药。l-谷氨酸是脊椎动物神经系统中的一种神经递质，控制大脑的认知过程，也是柠檬酸循环的必要化合物。虽然d-谷氨酸已经被报道存在于细菌细胞壁、各种植物，大鼠的肝脏、肾脏和脑组织中，但是它的功能却鲜为人知。因此，区分谷氨酸对映体对于后续研究对映体纯谷氨酸的生理功能具有至关重要的作用，或许可为对映体纯谷氨酸在疾病诊断和医治中的应用提供重要参考。

2、迄今为止，分离谷氨酸对映体的方法有超声场法、固相微萃取、晶体分离技术、毛细管电泳法等。检测谷氨酸对映体的方法有荧光法、电化学法、酶联免疫分析法、微生物实验法以及离子通道传感法等。其中，荧光法因为灵敏度高、分析速度快以及具有非侵入性生物成像潜力等优势引起了广泛关注。目前，区分谷氨酸对映体的手性传感器基本上均为基于有机小分子的化学传感器。然而，它们通常存在合成过程复杂、合成条件严苛、对映纯原料不可获得、在水中的溶解度差等缺点。因此，建立一种基于水溶性手性荧光硅纳米颗粒识别谷氨酸对映体的荧光方法具有非常重要的意义。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种水溶性手性绿色荧光硅纳米颗粒的制备方法，以用于识别谷氨酸对映体。

2、一、水溶性手性绿色荧光硅纳米颗粒（sinps）的制备

3、本发明水溶性手性绿色荧光硅纳米颗粒（sinps）的制备方法，是由左旋多巴和n-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷在水溶液中通过水解聚合反应而得。具体制备工艺为：先将左旋多巴加入去离子水中，在搅拌过程中加入n-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷（damo），于25~105 ℃下反应5~17 h，待反应产物冷却至室温后，将得到的棕色溶液透析5~48 h，即得水溶性手性绿色荧光sinps，并将透析好的溶液储存在4℃的冰箱中备用。

4、所述左旋多巴与n-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷的摩尔比为1:5~1:45。

5、所述透析是在分子截留量为1000 da的透析袋中进行透析。

6、本发明先在去离子水中加入左旋多巴，后加入n-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷，其原因是n-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷为碱性，可以促进左旋多巴溶解。

7、图1为手性绿色荧光sinps的合成机理图。从图1可以看出，damo中含有氨基和乙氧基，左旋多巴中含有羧基。在搅拌过程中，damo中的乙氧基水解为羟基，而氨基将于左旋多巴中的羧基发生脱水反应形成低分子量聚合物。随后，低分子聚合物之间通过氢键作用形成手性绿色荧光sinps。

8、二、手性绿色荧光sinps的结构

9、以实施例3制备的sinps为例，对其结构和性能进行检测。利用荧光光谱和圆二色谱对手性绿色sinps的光学性质进行了测定。利用透射电子显微镜对手性荧光sinps的形貌进行表征。

10、图2为sinps的激发波长和发射波长。可以看出，在390 nm激发波长下，sinps在512nm处表现出最强的荧光发射峰。表明该sinps所发射的荧光是绿光。

11、图3为sinps在不同激发波长下的荧光发射谱图。可以看出，当激发波长从360 nm变化到420 nm时，sinps的最大荧光发射峰位置几乎没有发生改变。表明sinps具有相对均一的粒径。

12、图4为sinps和左旋多巴的圆二色谱图。可以看出，左旋多巴在255nm和273nm左右显示出手性峰。sinps除了在248 nm和270 nm左右显示出手性峰之外，还在325 nm左右处表现出一个明显的手性峰。其中，前两个手性峰源自左旋多巴的固有手性，而325 nm左右的手性峰是由手性sinps中原料的sp2结构域引起的π-π*跃迁，表明手性荧光sinps被成功制备。

13、图5为手性绿色荧光sinps的透射电子显微镜图。从图5可以看出，手性绿色荧光sinps为颗粒状结构，并具有良好的分散性，其平均粒径为3.3 nm。表明手性绿色荧光sinps具有较小的粒径并且拥有良好的分散性。

14、图6为手性绿色荧光sinps在不同浓度nacl中的归一化荧光强度。可以看出，当nacl浓度高达1.0 mol/l时，手性绿色sinps的荧光强度几乎不发生改变，表明手性绿色荧光sinps具有良好的耐盐性。

15、图7为手性绿色荧光sinps在390 nm紫外灯下辐射不同时间的荧光强度。可以看出，当辐射时间长达60 min后，手性绿色sinps的荧光强度几乎不发生改变，表明手性绿色荧光sinps具有优异的抗光漂白性能。

16、图8为手性绿色荧光sinps对hela细胞活性的影响。可以看出，当手性荧光sinps的浓度高达800μg/ml时，hela细胞活性仍然大于85%，表明手性绿色荧光sinps具有良好的细胞兼容性。

17、三、手性绿色荧光sinps对谷氨酸对映体的识别

18、1、手性绿色荧光sinps对谷氨酸对映体的定量检测

19、在1.0 ml tris-hcl缓冲溶液（ph 7.0，10 mm）中加入手性sinps，测得此时荧光强度为 f 0，再加入d-谷氨酸，测得此时荧光强度为 f（荧光强度在激发波长为390 nm，发射波长为512 nm下测得）；并考察手性sinps的荧光减弱信号 f 0/ f值与d-谷氨酸浓度之间的线性关系。图9为加入不同浓度d-谷氨酸后手性sinps的荧光强度（a）及线性关系图（b）。可以看出，随着d-谷氨酸浓度的增加，体系的荧光不断降低。d-谷氨酸浓度在0.01~8mm范围内，手性sinps的荧光减弱信号 f 0/ f值与d-谷氨酸的浓度之间存在以下线性关系： f 0/ f= 0.0102 x+0.641，r2= 0.996，其中， x为d-谷氨酸的浓度。根据该线性关系，即可对d-谷氨酸进行定量检测。该方法的检测限低至3.1 μm，具有较宽的线性范围和较低的检测限。

20、在1.0 mltris-hcl缓冲溶液（ph 7.0，10 mm）中加入手性sinps，测得此时荧光强度为 f 0，再加入l-谷氨酸，测得此时荧光强度为 f（荧光强度在激发波长为390 nm，发射波长为512 nm下测得）。图10为加入不同浓度l-谷氨酸后手性sinps的荧光强度，可以看出，随着l-谷氨酸浓度的增加，体系的荧光强度几乎不发生改变。即l-谷氨酸对手性sinps的荧光信号无影响。结合图9中d-谷氨酸使手性sinps的荧光减弱的现象，可以确定手性sinps能实现谷氨酸对映体的有效辨别，荧光识别差异因子高达9.0，灵敏度高。

21、2、手性绿色荧光sinps对酪氨酸对映体的选择性检测

22、在手性sinps的tris-hcl缓冲溶液中，加入l或d-谷氨酸、l或d-酪氨酸、l或d-赖氨酸、l或d-半胱氨酸、l或d-甲硫氨酸、l或d-丝氨酸、l或d-组氨酸、l或d-苯丙氨酸、l或d-苏氨酸、l或d-异亮氨酸、l或d-亮氨酸、l或d-酒石酸、l或d-丙氨酸、l或d-天冬氨酸、l或d-精氨酸、r或s-扁桃酸、l或d-色氨酸、l或d-氨基丙醇，然后测定体系的荧光强度，测定过程与上述手性sinps对谷氨酸对映体的定量检测过程一致。所有物质的浓度均为10 mmol/l。

23、图11为手性sinps溶液中加入l或d-谷氨酸以及其它干扰物质的荧光强度信号柱状图。其中， f为手性sinps中加入l或d-谷氨酸以及其它干扰物质时测得的荧光强度， f 0为手性sinps的荧光强度。从图11看出，可以使手性sinps的荧光信号表现出明显差异的对映体只有手性谷氨酸，表明本发明对辨别谷氨酸对映体具有良好的选择性。

24、3、手性绿色荧光sinps识别酪氨酸对映体的机理

25、利用密度泛函理论（dft）分析方法计算手性sinps的主要构建单元左旋多巴和l-谷氨酸、d-谷氨酸之间的作用力。dft结果表明，d-谷氨酸和左旋多巴之间的吉布斯自由能（-60.13 kj/mol）小于l-谷氨酸和左旋多巴之间的吉布斯自由能（-54.80 kj/mol），表明d-谷氨酸和左旋多巴之间的作用力强于l-谷氨酸和左旋多巴之间的作用力。因此，手性sinps可有效区分谷氨酸对映体。

26、综上所述，本发明以n-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷和左旋多巴为原料，通过一步法制备了水溶性手性绿色荧光sinps，其制备方法简单、温和、快速，避免了多步且耗时的制备过程。所制备的手性sinps具有良好的热稳定性、较强的耐盐性、较低的毒性和优异的光学性质，手性sinps用于识别谷氨酸对映体时选择性好，灵敏度高，可实现l-谷氨酸和d-谷氨酸的区分检测。