一种提取微量藻液中细胞色素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化工领域，特别涉及一种提取微量藻液中细胞色素的方法。
【背景技术】
[0002] 微藻色素含量是表征微藻生理、代谢状况的重要指标之一，在微藻相关研宄中常 需要测定微藻的色素含量。测定普通培养液中的微藻叶绿素含量的方法较为常见。另外， 有很多情况下微藻也被培养于由一些特殊配制的培养液中（如重水培养液）。在研宄重水 对微藻光合作用的影响（刘楓等，重水对栅藻和卵形藻生长和光合促进作用.核化学与放 射化学，1998年第20卷第1期）、重水生物学同位素效应等项目时（张永波等，满江红鱼腥 藻中氘的生物学同位素效应研宄，1996年，第18卷第4期），都需要把微藻培养于用重水配 制的培养液中。由于重水价格十分昂贵，因此测定大批量重水藻液的众多参数时，每个藻液 样品的体积往往只有几百Ul，且藻细胞的数目很少。此时，如采用常规方法测定微量重水 藻液中色素的含量，就会受到很多限制。
[0003] 叶绿素提取时需要对细胞进行破碎，常用的方法主要包括超声波细胞破碎法、液 氮研磨法、反复冻融法、高压均质破碎法、玻璃珠撞击破碎法等。其中超声波破碎法、氮研磨 法、玻璃珠撞击破碎法和反复冻融法对小粒径微藻细胞的破碎效果往往并不理想；虽然高 压均质破碎法对微藻细胞的破碎效果理想，但该方法的藻液最低处理量要一般都在2ml以 上。因此，目前通用的微藻色素提取方法在用于测定微量藻液（几百y1)中的色素含量时， 存在提取困难、色素提取残留量大、测量误差大等问题。在微藻相关研宄中经常会遇到因藻 液体积有限而不能大量取样的情况，此时就需要有能够处理微量体积藻液的色素提取测定 方法。目前尚未见针对这一问题的相关研宄报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种提取微量藻液中细胞色素的方法。
[0005]本发明提供的提取藻液中细胞色素的方法，包括如下步骤：
[0006] 将藻液用微孔滤膜过滤，收集所述微孔滤膜上的微藻细胞后，加入研磨剂研磨，研 磨完毕后再加入丙酮水溶液进行萃取，静置，将所得上层萃取液用微孔滤膜过滤，收集滤出 液，完成所述藻液中色素细胞的提取；
[0007] 其中，所述藻液为含有微藻细胞的培养液。
[0008] 上述方法中，藻液的使用量不低于0. 1ml，具体为0. 2ml-0. 5ml，更具体为0. 5ml; [0009] 微藻细胞的细胞直径为lym-2ym，微藻细胞在所述藻液中的细胞密度不低于 1X105个 /ml，具体可为 3X10 7个 /ml、1X10 8个/ml或 5X10 6个 /ml。
[0010] 所述微孔滤膜为平板薄纸型滤膜或中空纤维膜。
[0011] 微孔滤膜的孔径为0? 1ym-8ym，具体为0? 1ym-0. 3ym，更具体为0? 22ym或 0? 1 u m〇
[0012] 所述研磨剂为切削作用的颗粒物，选自棕刚玉、金刚砂、玻璃砂、树脂研磨石和硅 胶粉中的至少一种；
[0013] 所述研磨剂的粒径为100目-500目，具体为200目-300目；
[0014] 所述丙酮水溶液中，丙酮的体积百分浓度为90%，丙酮的用量为藻液体积的1-4 倍。
[0015] 所述将藻液用微孔滤膜过滤的步骤的目的是用微孔滤膜将藻液与微藻细胞分离， 并收集微藻细胞。所述过滤具体包括如下步骤：使用吸水性良好的材质从滤膜底部，在室温 下吸取藻液中的液体；所述吸水性良好的材质具体可为吸水纸。
[0016] 所述研磨步骤中，研磨温度为0-4°C;研磨所用装置为研磨钵；
[0017] 所述研磨剂的用量为所述藻液体积的1/20-1/5,具体为1/10 ;
[0018] 所述静置步骤中，时间为5分钟-30分钟，具体为10分钟；
[0019] 所述过滤和收集步骤中，温度均为4°C。
[0020] 所述藻液具体可为含有莱茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii)的藻液、含有蛋 白核小球藻（Chlorellapyrenoidsa)的藻液或含有斜生栅藻（Scenedesmusobliquus)的 藻液，更具体可为莱茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii)的重水培养液、蛋白核小球藻 (Chlorellapyrenoidsa)的重水培养液或斜生栅藻（Scenedesmusobliquus)的重水培养 液；
[0021] 所述藻液中，微藻选自莱茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii)、蛋白核小球藻 (Chlorellapyrenoidsa)和斜生栅藻（Scenedesmusobliquus)中的至少一种。
[0022] 前文所述藻液的使用量及研磨剂和丙酮的用量中，均是以未稀释的藻液为基准。
[0023] 所述细胞色素选自叶绿素a、叶绿素b和胡萝卜素中的至少一种，具体为叶绿素a、 叶绿素b和胡萝卜素。
[0024] 本发明还提供了一种测定藻液中细胞色素含量的方法，包括如下步骤：
[0025] 测定前述方法所得滤出液在450nm、630nm、647nm、664nm和750nm处的吸光值，依 次记为〇D45(l、0D63(I、0D647、0D664、0D75(I，按照公式I至公式III依次得到所述滤出液中叶绿素 a、叶绿素b和胡萝卜素的含量：
[0026] 叶绿素a的含量=12. 12X(OD664_OD750)-1. 58X(OD647_OD750)-〇. 08X(OD630_OD750)
[0027] 公式I
[0028] 叶绿素b的含量=20. 13X(0D647-0D75Q) -5. 03X(0D664-0D75Q)公式II
[0029] 胡萝卜素的含量=3X10X0D45QX1000 + 2500 + 0. 5 公式III
[0030] 所述公式I至公式III中，叶绿素a、叶绿素b的含量的单位均为mg/L，胡萝卜素 的含量的单位为yg/L。
[0031] 所述藻液中，细胞色素的含量为所述叶绿素a、叶绿素b和胡萝卜素的含量之和乘 以稀释倍数。
[0032] 由于在前述方法用丙酮水溶液进行萃取步骤中，萃取的同时即对原藻液进行了稀 释，故在计算原藻液中的细胞色素的含量时，应根据稀释倍数，将滤出液中所得叶绿素a、叶 绿素b和胡萝卜素的含量之和乘以相应稀释倍数。
[0033] 上述测定方法中，所述藻液为含有莱茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii)的 藻液、含有蛋白核小球藻（Chlorellapyrenoidsa)的藻液或含有斜生栅藻（Scenedesmus obliquus)的藻液，更具体可为莱茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii)的重水培养液、蛋 白核小球藻（Chlorellapyrenoidsa)的重水培养液或斜生栅藻（Scenedesmusobliquus) 的重水培养液；
[0034] 所述藻液中，微藻选自莱茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii)、蛋白核小球藻 (Chlorellapyrenoidsa)和斜生栅藻（Scenedesmusobliquus)中的至少一种。
[0035] 所述细胞色素选自叶绿素a、叶绿素b和胡萝卜素中的至少一种，具体为叶绿素a、 叶绿素b和胡萝卜素。
[0036] 综上所述，本发明利用微孔滤膜充分收集微量体积藻液中的藻细胞，在研磨剂辅 助下通过研磨能够有效破碎微藻细胞。实验证实，在使用同一萃取方法萃取色素时，通过本 方法能够有效提高微藻色素含量测定的准确性。与常规微藻色素含量测定方法相比，本发 明具有如下优点：
[0037]1、技术新颖：该方法利用微孔滤膜、吸水材料和研磨剂等对微量藻液中的藻细胞 进行有效收集、除水和破碎。
[0038] 2、简便快捷：该方法对设备和技术的要求较低，不依靠超声波细胞破碎仪、高压均 质机等细胞破碎设备；不需要经过长时间的浸提过程。
[0039] 3、效果显著：该方法较微藻色素含量测定的传统方法相比，能够有效克服现有破 碎细胞法对藻液体积量的最低要求限制，能够显著提高微藻色素含量测定的准确性，同时 减少了丙酮的使用量。
[0040] 因此，本发明是一种人为误差小、稳定性好、结果准确、操作简便的测定微量藻液 中色素含量的方法，在微藻相关源领域具有较好的应用价值。
【具体实施方式】
[0041] 下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施例。所 述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。 下面对本发明做进一步详细描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理 解，而对其不起任何限定作用。
[0042] 下述实施例中，所用莱茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii)购自中科院淡水藻 种库，产品编号为FACHB-359 ;蛋白核小球藻（Chlorellapyrenoidsa)购自中科院淡水藻 种库，产品编号为FACHB-5 ;斜生栅藻（Scenedesmusobliquus)购自中科院淡水藻种库，产 品编号为FACHB-276。
[0043] 下述实施例所用莱茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii)、蛋白核小球藻 (Chlorellapyrenoidsa)、斜生栅藻（Scenedesmusobliquus)的重水培养液中，1L重水 培养液的成分和用量如下：NH4C1 0? 4g、K2HP040. 108g、KH2P040. 108g、MgS04 ? 7H20 0? 156g、 CaCl2 ? 2H20 0? 05g、Tris(碱）2. 42g、饱和盐酸 1. 5ml、H3B0311. 4mg、M