一种上皮组织染色剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种用于上皮组织尤其是肿瘤组织的染色剂组合物，还设及该染色剂 的制备方法。
【背景技术】
[0002] 近年来恶性肿瘤的发病率和死亡率都很高，而死亡率又是和及早诊治息息相关， 怎样及早确诊并进行治疗，是近年来医学界研究的热点。目前确认恶性肿瘤主要是一句病 理细胞学检查和组织学检查，它们是通过细胞形态和组织结构的改变来作出诊断的。而早 期恶性肿瘤病人细胞往往只表现有难W确诊的核酸增加，还没有形态和结构的改变，运就 造成细胞学和组织学漏诊的主要原因。目前针对肿瘤细胞的染色检测技术发展迅速，已经 有多种染色法可W较为准确的检测出细胞的良恶性程度，常见的有乙酸白化反应，舰实验、 叮晚澄巧光染色等。
[0003] 其中亚甲蓝染色法是近年来发展的一种新型肿瘤染色技术，其利用恶性肿瘤细胞 内部一般呈现较强的氧化环境的特点，通过氧化变色来识别恶性肿瘤细胞。亚甲蓝是一种 无毒性的生物染色材料，其氧化型是蓝色，还原状态下无色。目前如何提高亚甲蓝染色法的 识别度是研究的方向。
[0004] 临床研究表明，叶酸受体在大多数肿瘤细胞表明更容易集中，而在正常细胞表面 则相对较少，所W叶酸可W作为肿瘤特异性祀向分子，用于肿瘤的诊断治疗。在酸性条件 下，叶酸和亚甲基蓝分子形成叶酸亚甲基蓝复合物更容易与肿瘤细胞表面的叶酸结合，从 而进入肿瘤细胞。遇到肿瘤细胞内部的氧化环境，还原态的亚甲基蓝被氧化发生变色，从而 达到识别肿瘤细胞的目的。
[0005] CN103483872A设及一种用于肿瘤组织细胞染色剂组合物，包括显色剂，0. 01-5% ; 叶酸《6. 5% ;隐色剂，0. 1-10%袖调节剂《10% ;水，3-95%。其中，显色剂为亚甲基蓝和/ 或二氯酪說酪，隐色剂为还原性试剂，祀向药物制剂为叶酸，W及溶液抑调节剂和水。所述 用于肿瘤细胞染色的染色剂，也可用于肿瘤细胞的检测，本发明还设及所述染色剂组合物 用于肿瘤细胞检测的方法W及用于检测肿瘤细胞的试剂盒W及检测载体。
[0006]CN103808551A公开了一种用于上皮组织病变细胞检测的复合醋酸白溶液诊断试 剂配方、制备工艺及棉签；醋酸白溶液组成和配比是100ml溶液中含4%亚甲基蓝、1%的果 糖、20%的葡萄糖、5%的维C、0. 1-5%的叶酸、5%的蒸馈水、95%二甲基亚讽、1%乙酸。本发明 的优点在于利用虹吸原理将复合醋酸特殊染色溶液或体外诊断试剂与医用妇科大棉签巧 妙结合于一体结构简单，把棉签和染色剂溶液合为一体，减少医生工作强度、操作简单、使 用卫生、方便，储存期长，适用于各类医疗单位作为上皮组织细胞特殊染色和体外诊断特殊 染色时使用。
[0007] W上现有技术都利用亚甲蓝染色技术识别恶性肿瘤细胞，但是在识别率和准确率 上还有待提局。
【发明内容】
[0008] 本发明人经过多年研究，在现有亚甲蓝染色识别技术的基础上，发现添加辣根过 氧化酶可W显著提高亚甲蓝染色识别的准确度，运可能是因为辣根过氧化酶可W促进肿瘤 细胞在细胞内生成氧化物，但是对于正常细胞却不具有促进作用，从而导致亚甲蓝可W发 生更显著的变色，并显著提高识别准确度。
[0009] 本发明人还对常用的叶酸受体进行深入研究，发现了部分叶酸衍生物具有更好的 肿瘤细胞特异祀向效果，尤其是5, 6, 7, 8-四氨叶酸、组氨酸N-乙酷-2-乙二酷氨叶酸、半 脫氨改性叶酸，和叶酸相比，具有更好的肿瘤细胞选择性，准确率也更好。运在现有技术中 也未有记载。
[0010] 本发明公开了一种上皮组织染色剂，所述组合物按照重量百分比计包括W下组 分：叶酸衍生物0. 5-15wt%;亚甲蓝0.02-10wt%;辣根过氧化酶0.l-5wt%;氨基半乳糖 2-lOwt%;N-邻苯二甲酯低聚壳聚糖2-lOwt%;医用级冰醋酸2-6wt%;去离子水余 量。
[0011] 所述叶酸衍生物优选为5, 6, 7, 8-四氨叶酸、组氨酸N-乙酷-2-乙二酷氨叶酸、半 脫氨改性叶酸中的一种或多种。
[0012] 所述氨基-半乳糖也可W用葡萄糖替换。
[0013] 所述上皮组织染色剂的制备方法包括W下步骤：1)将叶酸衍生物溶于含水溶剂 中，静置24-3化；2)将亚甲基蓝放入该溶液中揽拌2-化；3)向该溶液中加入氨基半乳糖和 N-邻苯二甲酯低聚壳聚糖；4)将醋酸溶液加入至溶液PH为5-6。
[0014] 所述染色剂可W用于肿瘤细胞检测的用途。
[0015] 所述染色剂的载体包括脱脂棉签、微囊、纤维膜、滤纸。
[0016] 叶酸的簇基W偶联的方式与其他组分形成叶酸衍生素，而亚甲基蓝极易取代叶酸 衍生物的其他成分而W偶联方式与叶酸簇基连接，因此合适的叶酸衍生物是此试剂能否成 功的第一步。结合了亚甲基蓝的叶酸衍生物被癌细胞的叶酸受体接收，进入癌细胞，亚甲基 蓝被癌细胞中的自由氧氧化，亚甲基蓝变色，从而检测出癌细胞。
[0017] 本发明公开的上皮组织染色剂具有W下优点：所有原料对皮肤、腔道粘膜无刺激 作用，特别适于口诊病人的口腔癌及宫颈癌的筛查；与现有医疗机构自行配制的醋酸白 溶液相比，添加了亚甲蓝的醋酸溶液能对肿瘤细胞进行双重定位，特异性更好；与现有技术 中的叶酸-甲基蓝类染色剂相比，所选叶酸衍生物更易与叶酸受体结合，且糖类衍生物还 原性好，溶解性好，易于制备。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合具体实施例对发明的技术方案进行详细说明。
[001引 实施例1 一种上皮组织染色剂，所述组合物按照重量百分比计包括W下组分成6, 7, 8-四氨叶 酸5wt% ;亚甲蓝0. 5wt% ;辣根过氧化酶0. 1wt% ;氨基半乳糖2wt% ;N-邻苯二甲酯低聚 壳聚糖2wt%;医用级冰醋酸5wt%;去离子水余量。
[0020] 制备方法：1)将5, 6, 7, 8-四氨叶酸溶于含水溶剂中，静置2地；2)将亚甲基蓝放 入该溶液中揽拌化；3)向该溶液中加入辣根过氧化酶、氨基半乳糖和N-邻苯二甲酯低聚壳 聚糖；4)将冰醋酸溶液加入至溶液PH为5。
[00川 实施例2 一种上皮组织染色剂，所述组合物按照重量百分比计包括W下组分：半脫氨改性叶酸lOwt% ;亚甲蓝0. 5wt% ;辣根过氧化酶1wt% ;葡萄糖lOwt% ;N-邻苯二甲酯低聚壳聚糖 5wt%;医用级冰醋酸2wt%;去离子水余量。
[0022] 制备方法：1)将半脫氨改性叶酸溶于含水溶剂中，静置24h;2)将亚甲基蓝放入该 溶液中揽拌化；3)向该溶液中加入辣根过氧化酶、葡萄糖和N-邻苯二甲酯低聚壳聚糖；4) 将冰醋酸溶液加入至溶液PH为6。
[002引 对比例1 不加辣根过氧化酶，其它有效组分和实施例1相同，制备方法也相同。
[0024]对比例2 将5, 6, 7, 8-四氨叶酸替换为叶酸，其它有效组分和实施例2相同，制备方法也相同。 [00巧]本发明中，采用准确度对产品的性能进行表征对比。准确度是指对已经确诊的肿 瘤患者的上皮组织进行染色实验，染色成功的比例即为准确度。准确度越高，发现异常细胞 的能力越强。准确度实验选择1000例确诊的恶性肿瘤患者的组织切片。
[0026] 从W上对比试验结果可W看出，本发明的染色剂具有更高的准确度。取得了更好 的识别效果。辣根过氧化酶有显著的提高肿瘤细胞识别准确率的作用，而本发明优选的叶 酸衍生物也比叶酸有更高的识别准确度。
[0027] 本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概括。本发明的 所有实施方案都只能认为是对本发明的说明而不是限制，凡是根据本发明的技术内容所作 出的任何细微修改或等同替换，都属于本发明的技术方案之内。
【主权项】
1. 一种上皮组织染色剂，其特征在于，所述组合物按照重量百分比计包括以下组 分：叶酸衍生物〇.5-15wt%;亚甲蓝0.02-10wt%;辣根过氧化酶0.1-5wt%;氨基半乳糖 2-10wt%;N-邻苯二甲酰低聚壳聚糖2-10wt%;医用级冰醋酸2-6wt%;去离子水余量。2. 根据权利要求1所述的染色剂，其特征在于，所述叶酸衍生物优选为5, 6, 7, 8-四氢 叶酸、组氨酸N-乙酰-2-乙二酰氨叶酸、半胱氨改性叶酸中的一种或多种。3. 根据权利要求1所述的染色剂，其特征在于，所述氨基-半乳糖也可以用葡萄糖替 换。4. 根据权利要求1所述的染色剂，其特征在于，所述染色剂可以使用载体负载以方便 使用，所述载体包括脱脂棉签、微囊、纤维膜、滤纸。5. 权利要求1-3任一项所述的染色剂的制备方法，包括以下步骤：1)将叶酸衍生物溶 于含水溶剂中，静置24-36h;2)将亚甲基蓝放入该溶液中搅拌2-5h;3)向该溶液中加入氨 基半乳糖和N-邻苯二甲酰低聚壳聚糖；4)将醋酸溶液加入至溶液PH为5-6。6. 如权利要求1-3任一项所述的染色剂用于肿瘤细胞检测的用途。
【专利摘要】本发明公开了一种上皮组织染色剂，所述组合物按照重量百分比计包括以下组分：叶酸衍生物0.5-15wt%；亚甲蓝0.02-10wt%；辣根过氧化酶0.1-5wt%；氨基半乳糖2-10wt%；N-邻苯二甲酰低聚壳聚糖2-10wt%；医用级冰醋酸2-6wt%；去离子水余量，所述叶酸衍生物优选为5,6,7,8-四氢叶酸、组氨酸N-乙酰-2-乙二酰氨叶酸、半胱氨改性叶酸中的一种或多种，本发明公开的上皮组织染色剂具有以下优点：原料对皮肤、腔道粘膜无刺激作用；特异性更好；所选叶酸衍生物更易与叶酸受体结合，且糖类衍生物还原性好，溶解性好，易于制备。
【IPC分类】G01N33/52, G01N1/30, C09B67/42
【公开号】CN105199430
【申请号】CN201510743350
【发明人】李家青, 王峰, 付建成
【申请人】济宁博联生物科技有限公司
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年11月5日