用于检测高脂血症易感性的无创检测方法

本发明涉及高脂血症检测，具体为用于检测高脂血症易感性的无创检测方法。

背景技术：

1、高脂血症是指血脂水平过高，可直接引起一些严重危害人体健康的疾病，如动脉粥样硬化、冠心病、胰腺炎等，可分为原发性和继发性两类，原发性与先天性和遗传有关，是由于单基因缺陷或多基因缺陷，使参与脂蛋白转运和代谢的受体、酶或载脂蛋白异常所致，或由于环境因素(饮食、营养、药物)和通过未知的机制而致，继发性多发生于代谢性紊乱疾病(糖尿病、高血压、黏液性水肿、甲状腺功能减退、肥胖、肝肾疾病、肾上腺皮质功能亢进)，或与其他因素年龄性别、季节、饮酒、吸烟、饮食、体力活动、精神紧张、情绪活动等有关，所以为了积极检出、预防和控制血脂异常成为经济发达地区心血管病预防工作的主要内容之一。

2、现有的检测高脂血症时，需要提取大量检测人员的多项数据，检测步骤较为繁琐，没有一个比较全面的检测试剂盒，并且检测范围太广，不仅需要很多专业的技术人员，还会导致检测时需要用到的测序引物以及反应组件过多，成本较高。

技术实现思路

1、(一)解决的技术问题

2、针对现有技术的不足，本发明提供了用于检测高脂血症易感性的无创检测方法，解决了步骤较为繁琐，没有一个比较全面的检测试剂盒，以及检测范围太广，成本较高的问题。

3、(二)技术方案

4、为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：用于检测高脂血症易感性的无创检测盒，包括试剂盒，所述试剂盒内表面两侧均开设有六个滑槽，十二个所述滑槽两两之间分别滑动设置有apob-100测序引物、ldlr测序引物、pcsk9测序引物、abcg5/g8测序引物、lpl测序引物以及备用测序引物；

5、所述试剂盒上端一侧铰接设置有密封盖，所述密封盖内表面一侧靠前端固定设置有第一卡扣，所述第一卡扣内部卡接设置有pcr反应组件，所述密封盖内表面一侧靠后端固定设置有第二卡扣，所述第二卡扣内部卡接设置有pcr产物纯化组件。

6、优选的，用于检测高脂血症易感性的无创检测方法，具体包括以下步骤：

7、s1.基因组提取

8、刮取待检测者的口腔黏膜上皮细胞，并且使用酚氯仿法抽提基因组dna；

9、s2.pcr扩增反应

10、利用试剂盒中的pcr反应组件多一些易感基因进行pcr扩增反应；

11、其中含有下列引物对：

12、(6)apob-100正向引物：gcaggccgaagctgttttg；apob-100反向引物：gcacacgtttcagccactg；

13、(7)ldlr正向引物：tctgcaacatggctagagact；ldlr反向引物：tccaagcattcgttggtccc；

14、(8)pcsk9正向引物：atggtcaccgacttcgagaat；pcsk9反向引物：gtgccatgactgtcacacttg；

15、(9)abcg5/g8正向引物：tggaccaggcagatcctcaaa；abcg5/g8正向引物：ccgttcacatacacctcccc；

16、(10)lpl正向引物：tcattcccggagtagcagagt；lpl正向引物：ggccacaagttttggcacc；

17、s3.扩增产物纯化

18、利用试剂盒中的pcr产物纯化组件进行pcr扩增产物纯化；

19、s4.dna测序反应

20、使用试剂盒的测序反应组件进行dna测序反应；

21、s5.分析处理

22、技术人员对通过试剂盒获得的dna测序图进行分析。

23、优选的，所述s2.pcr扩增反应中，pcr扩增的反应体系为：10×pcr反应缓冲液2.5μl、25mm的dntp混合液0.2μl、5u/μl taq酶0.125μl、dna模板1μl 12～15ng左右、20um正向引物反向引物各0.25μl、ddh2o19.175μl。

24、优选的，所述s2.pcr扩增反应中反应条件为94℃4分钟变性和酶激活，94c 30秒变性，55℃30秒退火，72℃1分钟延长，循环28次，最后72℃延长5分钟以上。

25、优选的，所述s3.扩增产物纯化中，反应体系为总体积25μl，包含pcr产物20μl，1u/μl sap酶0.75μl，10u/μl exoi酶0.375μl，去离子水3.875μl，在abi2720型pcr扩增仪上进行反应，反应条件是37℃、15mi n，72℃、20mi n。

26、优选的，所述s4.dna测序反应中，反应的体系为总体积5μl，包含pcr纯化产物lμl，25％bigdye mix lμl,3.2μm dna测序引物1μl，去离子水2μl，在abi2720型pcr扩增仪上进行反应，反应条件为98℃2mi n，25个循环，96℃、30s，55℃、30s，60℃、4mi n。

27、优选的，所述s4.dna测序反应中，反应结束后加入125mm edta溶液1μl和100％乙醇溶液15μl，于室温下沉淀15mi n；在4c，3600rpm/mi n的转速离心30mi n，轻轻倒去上清液；加入70％乙醇溶液30μl，3600rpm/mi n离心15mi n，轻轻倒去上清液；室温放置20mi n后加入hi di溶液8μl，放入测序仪中。

28、(三)有益效果

29、本发明提供了用于检测高脂血症易感性的无创检测方法。具备以下有益效果：

30、本发明提供了用于检测高脂血症易感性的无创检测方法，本检测方法检测时，主要是基于apob-100、ldlr、pcsk9、abcg5/g8、lpl这五个易感基因去对于高频点位、易感人群进行针对性的检测，从而降低了检测的成本，并且配套设计的试剂盒的设置了相应的五个易感基因的测序引物，原理简单明了，使用方法比较简单，检测速度快、准确率较高，内部还另外设置了单独可选择设置的备用测序引物，从而可根据不同地区的易感基因不同设置更加常见的测序引物作为备用，进一步提高了检测的效率。

技术特征：

1.用于检测高脂血症易感性的无创检测盒，包括试剂盒(1)，其特征在于：所述试剂盒(1)内表面两侧均开设有六个滑槽(13)，十二个所述滑槽(13)两两之间分别滑动设置有apob-100测序引物(2)、ldlr测序引物(3)、pcsk9测序引物(4)、abcg5/g8测序引物(5)、lpl测序引物(6)以及备用测序引物(7)；

2.用于检测高脂血症易感性的无创检测方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的用于检测高脂血症易感性的无创检测方法，其特征在于：所述s2.pcr扩增反应中，pcr扩增的反应体系为：10×pcr反应缓冲液2.5μl、25mm的dntp混合液0.2μl、5u/μltaq酶0.125μl、dna模板1μl12～15ng左右、20um正向引物反向引物各0.25μl、ddh2o19.175μl。

4.根据权利要求2所述的用于检测高脂血症易感性的无创检测方法，其特征在于：所述s2.pcr扩增反应中反应条件为94℃4分钟变性和酶激活，94c30秒变性，55℃30秒退火，72℃1分钟延长，循环28次，最后72℃延长5分钟以上。

5.根据权利要求2所述的用于检测高脂血症易感性的无创检测方法，其特征在于：所述s3.扩增产物纯化中，反应体系为总体积25μl，包含pcr产物20μl，1u/μlsap酶0.75μl，10u/μlexoi酶0.375μl，去离子水3.875μl，在abi2720型pcr扩增仪上进行反应，反应条件是37℃、15min，72℃、20min。

6.根据权利要求2所述的用于检测高脂血症易感性的无创检测方法，其特征在于：所述s4.dna测序反应中，反应的体系为总体积5μl，包含pcr纯化产物lμl，25％bigdyemixlμl,3.2μmdna测序引物1μl，去离子水2μl，在abi2720型pcr扩增仪上进行反应，反应条件为98℃2min，25个循环，96℃、30s，55℃、30s，60℃、4min。

7.根据权利要求2所述的用于检测高脂血症易感性的无创检测方法，其特征在于：所述s4.dna测序反应中，反应结束后加入125mmedta溶液1μl和100％乙醇溶液15μl，于室温下沉淀15min；在4c，3600rpm/min的转速离心30min，轻轻倒去上清液；加入70％乙醇溶液30μl，3600rpm/min离心15min，轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入hidi溶液8μl，放入测序仪中。

技术总结
本发明提供用于检测高脂血症易感性的无创检测方法，涉及高脂血症检测技术领域。用于检测高脂血症易感性的无创检测盒，包括试剂盒，所述试剂盒内表面两侧均开设有六个滑槽，十二个所述滑槽两两之间分别滑动设置有apoB‑100测序引物、LDLR测序引物、PCSK9测序引物、ABCG5/G8测序引物、LPL测序引物以及备用测序引物，所述试剂盒上端一侧铰接设置有密封盖，所述密封盖内表面一侧靠前端固定设置有第一卡扣。通过对各地区相对应的易感基因去对于高频点位、易感人群进行针对性的检测，从而降低了检测的成本，并且配套设计的试剂盒的设置了相应的五个易感基因的测序引物，原理简单明了，使用方法比较简单，检测速度快、准确率较高。

技术研发人员：江龙,周越,胡利娟,杨新雷,胡龙龙,刘越
受保护的技术使用者：南昌大学第二附属医院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16