本发明涉及细胞打印技术领域，具体涉及一种高精度高速度连续3d打印方法。
背景技术：
boland等于2003年提出“细胞打印”技术的概念，该技术利用传统增材制造的原理与方法，以生物材料、生长因子及活性细胞为材料，进行人工组织与器官等复杂结构的可控制造。在“细胞打印”过程中，将细胞(或细胞聚集体)、溶胶(水凝胶的前驱体)和生长因子的混合液同时置于打印机的喷头中，由计算机控制含细胞液滴的沉积位置，通过由点到线，由线到面，由面成体的方式逐层完成三维多细胞水凝胶类器官结构体的构建。与传统的组织工程技术相比，“细胞打印”的优势主要有:(1)可同时构建有生物活性的二维或三维“多细胞/材料”体系；(2)有望精确实现不同细胞在三维复杂结构体内的按需、可控、均匀种植；(3)可构建细胞生长所需的三维微结构环境。
细胞打印技术为制造可供临床移植的人工组织或器官提供了新的思路和技术方法。同时，也有助于推动生物学、药学等领域的基础研究与创新，如3d打印的体外三维组织模型可用于研究肿瘤细胞的生长机理、代谢综合症中糖的代谢和新药的研发等。
目前的细胞打印方法主要包括喷墨打印技术、微挤出成型技术以及激光辅助打印技术等。这些方法在细胞活性、多细胞打印等方面均取得了较大的进展，但主要挑战在于无法以较低的成本制造出与细胞及细胞外基质尺度相近的微观结构环境，从而精确调控细胞的分化生长与组织再生。
技术实现要素：
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一，本发明的目的在于提供一种高精度高速度连续3d打印方法，能够在基板上快速、并按要求打印各种精细的细胞图案以及三维细胞/凝胶微结构体系。
本发明提出的一种高精度高速度连续3d打印方法，一种高精度高速度连续3d打印方法，包括以下步骤：
1)根据想要打印的细胞图案或三维细胞凝胶结构在计算机上编制出控制平台移动的程序，然后在20μm～200μm之间选择要打印的图案的线宽，从而确定平台移动的速度：1mm/s～500mm/s；
2)配置用于3d打印的细胞/生长因子/生物材料的混合溶液，将配置好的混合溶液在孔径为10μm的过滤网中往复过滤，所使用的生物材料包括光交联的明胶或聚乙二醇、可钙离子交联的海藻酸钠、可温度交联的胶原蛋白或聚乙烯醇，或者这些材料相互混合后的复合材料，其质量浓度介于0.5％～10％之间；所使用的细胞包括肝细胞、心肌细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、或具有多向分化功能的干细胞，细胞在混合溶液中的浓度为1×105～5×107个/ml；所使用的生长因子包括血管内皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、骨形态发生蛋白、或这些生长因子的混合物，生长因子在混合溶液中的浓度为0.05～1μg/ml；
3)将配置好的细胞/生长因子/生物材料的混合溶液吸入装有金属喷头的注射器内，金属喷头的内孔径为100～1000μm，通过精密注射泵控制注射器使混合溶液的打印流量为20～1000μl/h，将金属喷头与直流高压电源的正极相接，将接收板固定金属喷头下方的移动平台上，并接地，其中接收板采用厚度为0.1～1mm的导电材料，导电材料包括导电玻璃、金属板、硅片，调整接收板与金属喷头的距离为1～5mm；
4)打开高压直流电源开关，调整电压幅值介于0.5～20kv，从而在金属喷头与接收板之间形成稳定的高压静电场，混合溶液在高电场的作用下形成材料射流，启动移动平台的运动程序，从而使材料射流在接收板上形成预先设计的图案或结构，并根据生物材料的交联方式通过光照、改变温度、钙离子处理方式使材料射流快速原位形成细胞/水凝胶；
5)待第一层图案或结构制造完成后，通过采用不同的细胞与材料混合溶液，重复步骤4)的过程，实现三维复杂细胞/水凝胶复合结构的打印。
上述步骤均在无菌环境下进行。
与现有技术相比较，本发明中的有益效果是：
本发明可将图案的分辨率从大于200μm提高到20～30μm。其次，通过改变移动速度来观察打印图案分辨率的实验，得到分辨率关于移动速度的变化规律，这意味着可以通过改变平台的移动速度在一个细胞图案上得到不同的线宽。最后，由于可以得到分辨率很高的图案(最高为20μm)，而单个细胞的直径约为10～40μm，能够通过改变单位体积细胞悬浮夜中的细胞个数来获得单个细胞分布的细胞图案。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例1
一种高精度高速度连续3d打印方法，包括以下步骤：
1)根据想要打印的细胞图案或三维细胞凝胶结构在计算机上编制出控制平台移动的程序，选择40μm作为需要打印的图案的线宽，从而确定平台移动的速度为60mm/s；
2)配置用于3d打印的细胞/生长因子/生物材料的混合溶液，所使用的生物材料为海藻酸钠与pva，其质量浓度分别为0.5％和6％；所使用的细胞为成纤维细胞，细胞在混合溶液中的浓度为2×106个/ml，生长因子在混合溶液中的浓度为1μg/ml；
3)将配置好的细胞/生长因子/生物材料的混合溶液吸入装有金属喷头的注射器内，金属喷头的内孔径为500μm，通过精密注射泵控制注射器使混合溶液的打印流量为60μl/h，将金属喷头与直流高压电源的正极相接，将接收板固定金属喷头下方的移动平台上，并接地，其中接收板采用方阻为4ω、厚度为0.7mm的ito导电玻璃，调整接收板与金属喷头的距离为1.75mm；
4)打开高压直流电源开关，调整电压幅值为1.9kv，从而在金属喷头与接收板之间形成稳定的高压静电场，混合溶液在高电场的作用下形成材料射流，启动移动平台的运动程序，从而使材料射流在接收板上形成预先设计的图案或结构，并根据生物材料的交联方式通过钙离子处理方式使材料射流快速原位形成细胞/水凝胶；
5)待第一层图案或结构制造完成后，可通过采用不同的细胞与材料混合溶液，重复步骤4)的过程，实现三维复杂细胞/水凝胶复合结构的打印。
上述步骤均在无菌环境下进行。
本实施例的有益效果为：所制造的单根直线细胞/凝胶结构如所示，是实施例1中所产生的单根直线细胞/凝胶结构中的小点儿是成纤维细胞，线宽在40μm左右。
实施例2
一种高精度高速度连续3d打印方法，包括以下步骤：
1)根据想要打印的细胞图案或三维细胞凝胶结构在计算机上编制出控制平台移动的程序，选择150μm作为需要打印的图案的线宽，从而确定平台移动的速度为5mm/s；
2)配置用于3d打印的细胞/生长因子/生物材料的混合溶液所使用的生物材料为pva和ⅱ型鼠尾胶原蛋白，其质量浓度分别为8％和0.5％；所使用的细胞为血管内皮细胞，细胞在混合溶液中的浓度为1×107个/ml，生长因子在混合溶液中的浓度为0.05μg/ml；
3)将配置好的细胞/生长因子/生物材料吸入装有金属喷头的注射器内，金属喷头的内孔径为200μm，通过精密注射泵控制注射器使混合溶液的打印流量为20μl/h，将金属喷头与直流高压电源的正极相接，将接收板固定金属喷头下方的移动平台上，并接地，其中接收板采用方阻为4ω、厚度为0.5mm的ito导电玻璃，调整接收板与金属喷头的距离为1.75mm；
4)打开高压直流电源开关，调整电压幅值为3kv，从而在金属喷头与接收板之间形成稳定的高压静电场，混合溶液在高电场的作用下形成材料射流，启动移动平台的运动程序，从而使材料射流在接收板上形成预先设计的图案或结构，并根据生物材料的交联方式通过改变温度方式使材料射流快速原位形成细胞/水凝胶；
5)待第一层图案或结构制造完成后，可通过采用不同的细胞与材料混合溶液，重复步骤4)的过程，实现三维复杂细胞/水凝胶复合结构的打印。
上述步骤均在无菌环境下进行。
本实施例的有益效果为：所制造的单根直线细胞/凝胶结构中的小点儿是成纤维细胞，线宽在100μm左右。
实施例3
一种高精度高速度连续3d打印方法，包括以下步骤：
1)根据想要打印的细胞图案或三维细胞凝胶结构在计算机上编制出控制平台移动的程序，选择20μm作为需要打印的图案的线宽，从而确定平台移动的速度为500mm/s；
2)配置用于3d打印的细胞/生长因子/生物材料的混合溶液，所使用的生物材料为明胶溶液，其质量浓度分别为5％；所使用的细胞为成干细胞，细胞在混合溶液中的浓度为1×105个/ml，生长因子在混合溶液中的浓度为0.5μg/ml；
3)将配置好的细胞/生长因子/生物材料的混合溶液吸入装有金属喷头的注射器内，金属喷头的内孔径为1000μm，通过精密注射泵控制注射器使混合溶液的打印流量为1000μl/h，将金属喷头与直流高压电源的正极相接，将接收板固定金属喷头下方的移动平台上，并接地，其中接收板采用方阻为4ω、厚度为0.1mm的ito导电玻璃，调整接收板与金属喷头的距离为5mm；
4)打开高压直流电源开关，调整电压幅值为20kv，从而在金属喷头与接收板之间形成稳定的高压静电场，混合溶液在高电场的作用下形成材料射流，启动移动平台的运动程序，从而使材料射流在接收板上形成预先设计的图案或结构，并根据生物材料的交联方式通过改变温度处理方式使材料射流快速原位形成细胞/水凝胶；
5)待第一层图案或结构制造完成后，可通过采用不同的细胞与材料混合溶液，重复步骤4)的过程，实现三维复杂细胞/水凝胶复合结构的打印。
上述步骤均在无菌环境下进行。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。