用于打印芯纤维的系统和方法与流程

用于打印芯纤维的系统和方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2018年9月19日提交的美国临时专利申请序列号62/733,548的申请日的优先权权益，该申请的公开内容以引用方式整体并入本文。
技术领域
3.本发明涉及用于产生实心或中空纤维结构的系统和方法，并且涉及根据数字文件对此类结构的三维(3d)打印。在一些实施方案中，所打印的纤维包含活细胞。


背景技术：

4.组织工程领域长期以来一直在寻求制造能够使用多种材料和方法来模仿和/或替代活器官和活组织的可存活合成结构。缺乏预先图案化的脉管系统是限制当前组织工程策略成功的主要因素之一，并且当前无法制造包含可与宿主组织整合的内源性、工程化的脉管系统或营养通道的厚组织构建体是阻止生成和/或植入更大的、可存活的和/或代谢活性组织的主要技术障碍。
5.3d打印(一种增材制造形式)已被应用来直接根据数字文件创建三维对象，其中逐层构建对象以实现期望的三维结构。应用这些3d打印技术来形成中空血管图案的最初工作主要集中在打印和随后消除牺牲材料。例如，bertassoni等人使用了一种物理方法，即从光交联丙烯酸酯化水凝胶(诸如gelma)的周围铸件中移除模板化琼脂糖(lab chip 14:2202(2014))。打印的琼脂糖纤维显示出与gelma的极少结合，但必须手动移除，遗憾的是，这既耗时又困难，并且还要求浇铸的水凝胶比琼脂糖纤维更结实。
6.一种替代方法涉及由材料打印牺牲纤维网络，然后可经由增溶或液化将其移除。例如，wu等人通过在pluronic f127
‑
二丙烯酸酯凝胶贮存器中挤出牺牲pluronic f127细丝来打印3d可灌注血管树，以在打印期间提供支持(adv mater.2011；23:h178
–
183)。对周围的丙烯酸酯改性的pluronic f127
‑
二丙烯酸酯进行光固化后，可通过将温度降至其临界胶束温度以下来使未改性的pluronic f127通道液化，从而留下可灌注的通道。在类似方法中，lee等人在含有人脐静脉内皮细胞(huvec)的明胶周围沉积胶原蛋白支持基质层(biomaterials.2014；35:8092
–
8102)。打印后，明胶熔化，这有助于“激活”huvec细胞接种到周围胶原蛋白上。还打印了其他各种牺牲材料，包括miller等人采用的“碳水化合物玻璃”作为牺牲材料，显示了随后对中空网络的灌注(nat mater.2012；11:768
–
774)。
7.然而，迄今为止，pluronic f127在降低的温度下的液化特性使其成为最常用的牺牲材料，而kolesky和同事们已成功地将其与多种支持材料结合使用，以形成血管化的厚组织构建体。(adv mater.2014；26:3124
–
3130)(pluronic f127和载有细胞的明胶
‑
甲基丙烯酸酯(gelma)的共同打印通道结构；proc natl acad sci u s a.2016；113:3179
–
3184)(与凝血酶混合的pluronic f127被称为“血管墨水”，用于间接打印载有细胞的明胶
‑
纤维蛋白原生物墨水内的牺牲通道)。然而，值得注意的是，牺牲性材料(诸如pluronic f127)在较高浓度下具有细胞毒性，并且尚不清楚液化的pluronic对周围组织区域的影响，因为不太可
能将其从中空通道中完全移除。
8.牺牲中空纤维图案的较新替代方法是使用聚集的激光束来热消融预铸件(或打印的)组织结构内的区域。随着激光束的移动，激光束留下中空隧道，该技术可相对较快，可以高分辨率在3d中对分支的中空管进行图案化，该分辨率可能小至直径为10um
‑
20um的毛细血管。使用双光子激光可增加光束的穿透深度，这也有助于降低离焦光的强度，从而降低对消融通道外区域的光毒性。
9.还尝试了在较大组织内直接对中空管进行生物打印。例如，gao等人证明了使用同轴针在藻酸盐纤维芯中使用氯化钙交联溶液生成和打印中空藻酸盐纤维的能力。将打印喷嘴配置用于钙溶液的内部流动与藻酸盐溶液(即，生物墨水)的外部流动，从而形成具有内源性可灌注微通道的构建体。在这种方法中，将中空微通道打印到台架上，该台架逐渐降低到钙浴溶液中进行二次交联。(biomaterials.2015；61:203
–
215.)。hinton等人开发了一种液体浸没打印的替代方法，它采用挤出方法，即使用多种水凝胶进行牺牲明胶微粒浴中支持的直接结构打印，以便于交联。(sci adv.2015；1:e1500758)。
10.然而，遗憾的是，用于中空纤维网络的常规3d生物打印的上述系统、设备和材料具有许多缺点，阻碍了它们的更实际、更有效和更广泛的实施。如上面所指出的，手动(物理)移除牺牲材料是不切实际的、不一致的、耗时的，并且对于较小血管来说可能是不可能的。另外，用牺牲材料图案化血管通道限制了以轴向方式围绕中空通道来图案化细胞和/或生物材料的能力。很难想像可以如何使用这种技术来制造例如图案化的通道网络，这些通道模仿真实小动脉的结构，小动脉在血管内皮细胞的内层周围具有平滑肌细胞。
11.对于激光消融，穿透深度仅限于1mm
‑
2mm，并且需要不会散射光束的光学透明的材料，而大多数细胞化的组织是不透明的并且会发生光散射。最后，对于牺牲材料的挤出打印，牺牲纤维的直径(以及随后通道的内径)由挤出针的直径决定。该直径是固定的，因此没有机会动态地改变组织的不同区域中通道的管腔直径。
12.因此，需要能够在3d组织内部分配和图案化中空通道的系统和设备，其具有促血管生成的生物墨水和精确地沿轴向且平行于通道布置的不同细胞类型。该技术应与细胞生存力相容，并且在单个组织构建体内，打印通道的内径应可从毛细血管到较大血管动态地改变。例如，可能希望在附接有灌注设备的组织的开口处具有较大直径的血管，然后减小管腔直径以对组织内部的较小血管建模。改变血管直径也可能是调节流量变化和疾病(诸如动脉粥样硬化)局限性的有用工具。本发明解决了这些和其他未满足的需求。


技术实现要素：

13.本发明的各方面包括用于产生实心或中空纤维结构以及用于根据数字文件产生三维(3d)结构的系统和方法。在一些实施方案中，所打印的纤维包含活细胞。如本文首次证明的，使用芯
‑
壳方法直接打印中空纤维可生成具有不同直径的中空纤维以及多个壳，并且可以精确的轴向和平行布置将不同的细胞类型装载到不同的壳中，以生成具有多个细胞层的中空血管。另外，在连续打印的同时，可沿着通道的长度对血管壁的组成(细胞类型和生物材料组成)进行修改。
14.本发明的各方面包括一种用于产生纤维结构的打印头，该打印头包括：分配通道，该分配通道包括具有第一直径的近侧端部和具有第二直径的远侧端部；分配孔口，该分配
孔口定位于分配通道的远侧端部处；芯通道，该芯通道具有第三直径，该芯通道在分配通道的近侧端部处与分配通道会聚，其中芯通道的第三直径小于分配通道的第一直径和第二直径；第一壳通道，该第一壳通道在分配通道的近侧端部处的第一流体聚集交汇处与芯通道和分配通道会聚；鞘流通道，该鞘流通道在定位于第一流体聚集交汇处和分配通道的远侧端部之间的鞘流体交汇处与分配通道会聚，其中在鞘流体交汇处，分配通道的直径从所述第一直径增加到所述第二直径；其中芯通道、第一壳通道和鞘流通道与分配通道流体连通。
15.在优选的实施方案中，打印头被配置为通过芯通道分配不可交联材料。在替代实施方案中，打印头被配置为通过芯通道分配可交联材料以形成实心纤维。
16.在一些实施方案中，第一壳通道包括多个(例如，两个、三个、四个或更多)第一壳子通道，该多个第一壳子通道经由设置在打印头内的第一流体聚集室朝向分配通道会聚。在一个实施方案中，从第一流体聚集交汇处到鞘流体交汇处的分配通道的第一直径与第一流体聚集交汇处的直径基本上相同。在优选的实施方案中，第一流体聚集室包括锥形截头形状，该锥形截头形状配置为将流体朝向分配通道聚集，并且在第一流体聚集室的出口处，第一直径基本上等于截头的最小直径。
17.在一些实施方案中，打印头还包括至少第二壳通道，该第二壳通道在定位于第一流体聚集交汇处和鞘流体交汇处之间的第二流体聚集交汇处与分配通道会聚。在一些实施方案中，第二壳通道包括多个第二壳体子通道，该多个第二壳体子通道经由第二流体聚集室朝向分配通道会聚。在优选的实施方案中，第二流体聚集室包括锥形截头形状，该锥形截头形状配置为将流体朝分配通道聚集，并且在第二流体聚集室的出口处，第一直径基本上等于截头的最小直径。
18.在一些实施方案中，打印头还包括第三壳通道、第四壳通道，第五壳通道和/或第六壳通道，该第三壳通道、第四壳通道、第五壳通道和/或第六壳通道在定位于第二流体聚集交汇处和鞘流体交汇处之间的第三流体聚集交汇处、第四流体聚集交汇处、第五流体聚集交汇处和/或第六流体聚集交汇处与分配通道会聚。在一些实施方案中，第三壳通道、第四壳通道、第五壳通道和/或第六壳通道各自包括多个子通道，该多个子通道经由第三流体聚集室、第四流体聚集室、第五流体聚集室和/或第六流体聚集室朝向分配通道会聚。在优选的实施方案中，第三流体聚集室、第四流体聚集室、第五流体聚集室和/或第六流体聚集室包括锥形截头形状，该锥形截头形状配置为使流体朝向分配通道聚集，并且在室的出口处，第一直径等于截头的最小直径。
19.在一些实施方案中，鞘流通道包括多个鞘流子通道，该多个鞘流子通道经由鞘流体室朝向分配通道会聚。在一个实施方案中，从鞘流体交汇处到分配孔口的分配通道的第二直径与鞘流体室的直径基本上相同。在优选的实施方案中，鞘流体室包括锥形截头形状，该锥形截头形状被配置为使流体朝向分配通道聚集，并且在室的出口处，第二直径等于截头的最小直径。
20.在一个实施方案中，鞘流通道包括鞘流体输入孔口和控制阀；优选地，其中打印头被配置为通过鞘流通道分配鞘流体。在一些实施方案中，鞘流体包含化学交联剂。在一些实施方案中，鞘流体包含水性溶剂。
21.在一个实施方案中，打印头包括至少两个芯子通道，该至少两个芯子通道会聚以形成具有第三直径的流体聚集入口。在示例性实施方案中，第一芯子通道包括鞘流体输入
孔口和控制阀，并且第二芯子通道包括缓冲溶液输入孔口和控制阀。
22.在一个实施方案中，第一壳通道围绕芯通道同心地设置。在示例性实施方案中，芯通道的远侧端部包括设置在打印头中的第一壳通道内的管(例如，由塑料、玻璃或金属制成)。在一些实施方案中，芯通道的远侧端部包括管，该管具有配置为适配到第一壳通道的一部分中的外部和配置为与芯通道对准的内表面(在管中限定中空空间)。
23.在另一实施方案中，本发明的打印头包括：分配通道，该分配通道包括具有第一直径的近侧端部和具有第二直径的远侧端部；分配孔口，该分配孔口定位于分配通道的远侧端部处；芯通道，该芯通道具有第三直径，该芯通道在分配通道的近侧端部处与分配通道会聚，其中芯通道的第三直径小于分配通道的第一直径和第二直径；壳通道，该壳通道围绕芯通道的远侧端部同心地设置，并且在分配通道的近侧端部处的第一流体聚集室处与芯通道和分配通道会聚；鞘流通道，该鞘流通道包括多个鞘流子通道，该多个鞘流子通道在鞘流体室处与分配通道会聚，其中在鞘流体交汇处，分配通道的直径从所述第一直径增加到所述第二直径；其中芯通道、第一壳通道和鞘流通道与分配通道流体连通。在示例性实施方案中，芯通道的远侧端部包括设置在打印头中的第一壳通道内的管。
24.在优选的实施方案中，打印头被配置为通过芯通道分配不可交联材料。
25.在一些实施方案中，打印头还包括延伸尖端，该延伸尖端包括管，该管具有配置为适配到分配通道的一部分中的外部配置为与分配通道对准的内表面(在管中限定中空空间)。
26.在一个示例性实施方案中，第三直径介于约0.1mm和2mm之间，更优选地介于约0.4mm和1.0mm之间，最优选地为约0.7mm。在示例性实施方案中，第一直径介于约0.2mm和3mm之间，更优选地介于约1mm和2mm之间，最优选地为约1.5mm。在示例性实施方案中，分配通道的第二直径介于约0.3mm和3.5mm之间，更优选介于约1.5mm和2.5mm之间，最优选地为约2mm。因此，在一个示例性实施方案中，直径从流体聚集入口处的约0.7mm逐渐增加到分配通道的近侧端部处的约1.5mm，增加到分配通道的远侧端部处的约2.0mm。
27.在另一示例性实施方案中，第三直径介于约0.4mm和1mm之间，更优选地介于约0.6mm和0.8mm之间，最优选地为约0.7mm。在示例性实施方案中，第一直径介于约1mm和2mm之间，更优选地介于约1.3mm和1.7mm之间，最优选地为约1.5mm。在示例性实施方案中，分配通道的第二直径介于约1.5mm至2.5mm之间，更优选地介于约1.8mm至2.2mm之间，最优选地为约2mm。因此，在一个示例性实施方案中，直径从流体聚集入口处的约0.7mm逐渐增加到分配通道的近侧端部处的约1.5mm，增加到分配通道的远侧端部处的约2.0mm。
28.本发明的各方面包括一种用于产生纤维结构的系统，该系统包括：打印头，该打印头包括分配通道，该分配通道包括具有第一直径的近侧端部和具有第二直径的远侧端部；分配孔口，该分配孔口定位于分配通道的远侧端部处；芯通道，该芯通道具有第三直径，该芯通道在分配通道的近侧端部处与分配通道会聚，其中芯通道的第三直径小于分配通道的第一直径和第二直径；第一壳通道，该第一壳通道在分配通道的近侧端部处的第一流体聚集交汇处与芯通道和分配通道会聚；鞘流通道，该鞘流通道在定位于第一流体聚集交汇处和分配通道的远侧端部之间的鞘流体交汇处与分配通道会聚，其中在鞘流体交汇处，分配通道的直径从所述第一直径增加到所述第二直径；其中芯通道、第一壳通道和鞘流通道与分配通道流体连通。
29.在一些实施方案中，打印头被配置为通过芯通道分配不可交联材料；接收表面，该接收表面用于接收从打印头分配的第一材料层；以及定位部件，该定位部件用于在3d空间中定位打印头的分配孔口，其中定位部件可操作地联接到打印头。
30.在一些实施方案中，系统还包括可编程控制处理器，该可编程控制处理器用于控制定位部件并且用于控制通过打印头的一种或多种流体的流量。在一些实施方案中，系统还包括流体移除部件，该流体移除部件被配置为移除从打印头分配的过量流体。在一些实施方案中，流体移除部件包括多孔膜，该多孔膜被配置为允许过量流体通过。在一些实施方案中，流体移除部件包括吸收性材料。在一些实施方案中，流体移除部件包括真空，该真空被配置为抽出过量流体。在一些实施方案中，在接收表面下方施加真空。在一些实施方案中，在接收表面上方施加真空。在一些实施方案中，通过打印头上的一个或多个真空通道施加真空。在一些实施方案中，该一个或多个真空通道位于打印头上的分配孔口附近。
31.在一些实施方案中，系统还包括压力控制部件，该压力控制部件被配置为调节通过打印头的一种或多种流体的流量。在一些实施方案中，系统还包括与打印头流体连通的一个或多个流体贮存器。在一些实施方案中，流体贮存器包含鞘溶液。在一些实施方案中，鞘溶液包括被配置为固化输入材料的交联溶液。在一些实施方案中，交联溶液包含二价阳离子。在一些实施方案中，二价阳离子为ca++。在一些实施方案中，流体贮存器包含缓冲溶液。在一些实施方案中，缓冲溶液可与输入材料混溶。在一些实施方案中，流体贮存器包含输入材料。在一些实施方案中，输入材料包含可交联材料，例如水凝胶。在一些实施方案中，水凝胶包含藻酸盐。在一些实施方案中，藻酸盐为解聚的藻酸盐。在一些实施方案中，输入材料包含一个或多个活细胞。在一些实施方案中，输入材料包括细胞外基质材料。在一些实施方案中，输入材料包括活性剂。
32.在一些实施方案中，打印头被配置为通过分配通道产生恒定的质量流量。在一些实施方案中，系统还包含交联组分。在一些实施方案中，交联组分包括uv灯。在一些实施方案中，交联组分位于分配孔口附近。
33.本发明的各方面包括一种用于生成固化的纤维结构的方法，该方法包括：提供一种用于产生纤维结构的系统，该系统包括：打印头，该打印头包括分配通道，该分配通道包括具有第一直径的近侧端部和具有第二直径的远侧端部；分配孔口，该分配孔口定位于分配通道的远侧端部处；芯通道，该芯通道具有第三直径，该芯通道在分配通道的近侧端部处与分配通道会聚，其中芯通道的第三直径小于分配通道的第一直径和第二直径；第一壳通道，该第一壳通道在分配通道的近侧端部处的第一流体聚集交汇处与芯通道和分配通道会聚；鞘流通道，该鞘流通道在定位于第一流体聚集交汇处和分配通道的远侧端部之间的鞘流体交汇处与分配通道会聚，其中在鞘流体交汇处，分配通道的直径从所述第一直径增加到所述第二直径；其中芯通道、第一壳通道和鞘流通道与分配通道流体连通。
34.在一些实施方案中，打印头被配置为通过芯通道分配不可交联材料；接收表面，该接收表面用于接收从打印头分配的第一材料层；定位部件，该定位部件用于在3d空间中定位打印头的分配孔口，其中该定位部件可操作地联接到打印头；可编程控制处理器，该可编程控制处理器用于控制定位部件并且用于控制通过打印头的一种或多种流体的流量；第一流体贮存器，该第一流体贮存器包含第一输入材料；第二流体贮存器，该第二流体贮存器包含缓冲溶液；以及第三流体贮存器，该第三流体贮存器包含鞘溶液，其中鞘溶液包括交联溶
液；其中流体贮存器与打印头流体连通；使第一输入材料通过分配通道；将第一输入材料与交联组分交联以生成固化的纤维结构；以及从打印头的分配孔口分配固化的纤维结构。
35.在优选的实施方案中，该方法包括同时通过芯通道分配缓冲溶液和/或鞘流体，通过一个或多个壳通道分配一种或多种输入材料，以及通过鞘流通道分配鞘流体以在打印的纤维中形成中空芯。
36.在一些实施方案中，芯通道中的不可交联材料包括缓冲溶液，并且鞘流通道中的鞘流体包括化学交联剂，并且在鞘流体交汇处发生接触以固化分配通道中的可交联材料的料流的外表面。
37.在一些实施方案中，芯通道中的不可交联材料包括化学交联剂，并且鞘流通道中的鞘流体包括水性溶剂，并且在第一流体聚集交汇处发生接触以固化分配通道中的可交联材料的料流的内表面。
38.在一些实施方案中，芯通道中的不可交联材料包括化学交联剂，并且鞘流通道中的鞘流体包括化学交联剂，并在第一流体聚集交汇处且发生接触以固化可交联材料的料流的内表面，并且在鞘流体交汇处发生接触以固化分配通道中的可交联材料的料流的外表面。
39.在一些实施方案中，一种方法还包括：用待打印的平面结构对可编程控制处理器进行编码；以及在接收表面上沉积固化的纤维结构的第一层以打印平面结构。
40.在一些实施方案中，一种方法还包括：用待打印的3d结构对可编程控制处理器进行编码；以及在平面结构的顶部沉积固化的纤维结构的后续层以打印3d结构。
41.在一些实施方案中，一种系统还包括包含第二输入材料的第四流体贮存器，并且一种方法包括生成包含第二输入材料的固化纤维结构。在一些实施方案中，一种方法还包括同时分配第一输入材料和第二输入材料以生成包含第一输入材料和第二输入材料的混合物的固化纤维结构。
42.在替代实施方案中，可分别在芯通道和壳通道中使用相同或不同的可交联材料来制造实心芯
‑
壳纤维。在前一实施方案中，交联剂可借助于扩散来使芯材料交联，诸如藻酸盐水凝胶被一种或多种交联剂交联，或者替代地可在光的存在下交联。在后一实施方案中，芯通道包含可交联材料，该可交联材料可在从打印头分配后的一段时间内固化，而壳通道包括不同的可交联材料，该材料在打印时固化。
附图说明
43.图1是本发明的打印头设计的水平实施方案中的流型的图示。
44.图2示出并标识了本发明的打印头设计的水平实施方案中的微流体通路的关键部件。
45.图3是本发明的打印头设计的竖直实施方案中的流型的图示。
46.图4示出并标识了本发明的打印头设计的竖直实施方案中的微流体通路的关键部件。
47.图5是本发明的打印头设计的替代水平实施方案中的流型的图示。
48.图6示出并标识了本发明的打印头设计的替代实施方案中的微流体通路的关键部件。
49.图7是包括多个壳通道的本发明的打印头设计的替代竖直实施方案中的流型的图示。
50.图8示出并标识了包括多个壳通道的本发明的打印头设计的替代竖直实施方案中的微流体通路的关键部件。
51.图9示出并标识了包括嵌入式芯壳通道的本发明的打印头设计的替代竖直实施方案中的微流体通路的关键部件。
52.图10示出了包括嵌入式芯壳通道的本发明的打印头设计的分解图。
53.图11a
‑
f示出了通过本文所述的方法、组合物和/或设备的实施方案制备的中空纤维。a示出了围绕芯轴缠绕的中空纤维。b示出了围绕芯轴缠绕的流体填充的中空纤维。c是打印的中空纤维的端视图。d示出了使用单根连续中空纤维打印的大型结构。该结构的壳是透明的，并且芯填充有色溶液。e是通过本文所述的方法、组合物和/或设备的实施方案制备的中空纤维的显微镜图像。f是通过本文所述的方法、组合物和/或设备的实施方案制备的实心纤维的显微镜图像。
具体实施方式
54.本发明的各方面包括用于制备纤维结构以及用于根据数字文件制备三维(3d)结构的系统和方法。在一些实施方案中，所打印的纤维包含活细胞。
55.定义：
56.为了解释本说明书的目的，将应用以下定义，并且在适当时，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。如果所述任何定义与以引用方式并入本文的任何文档相抵触，则以下文所述定义为准。
57.如本文所用，术语“位移”是指第一材料或流体从给定位置移除第二材料或流体的能力。例如，在一些实施方案中，缓冲溶液被配置为使输入材料从分配通道内的位置(例如，从分配通道的近侧端部)位移。在一些实施方案中，位移为瞬时位移，其在小于约一秒钟，诸如约900毫秒、800毫秒、700毫秒、600毫秒、500毫秒、400毫秒、300毫秒、200毫秒或100毫秒或更短的时间内发生。
58.如本文所用，术语“可混溶的”是指两种不同液体在组合时形成均质混合物的能力。
59.如本文所用，术语“质量流量”是指每单位时间内通过给定位置的物质的质量。如本文所用，术语“恒定质量流量”是指每单位时间内保持恒定的质量流量。
60.如本文所用，术语“固化的”是指材料在沉积时保持其形状保真度和结构完整性的固态或半固态。如本文所用，术语“形状保真度”是指材料保持其三维形状而无显著扩展的能力。在一些实施方案中，固化材料是能够保持其三维形状约30秒或更长时间，诸如约1分钟、10分钟或30分钟或更长时间，诸如约1小时、10小时、24小时或48小时或更长时间的材料。如本文所用，术语“结构完整性”是指材料在载荷(包括其自身重量)下保持在一起，同时抵抗断裂或弯曲的能力。
61.在一些实施方案中，固化组合物是一种弹性模量大于约5千帕斯卡(kpa)、10kpa、15kpa、20kpa或25kpa，更优选大于约30kpa、40kpa、50kpa、60kpa、70kpa、80kpa或90kpa，还更优选大于约100kpa、110kpa、120kpa或130kpa的固化组合物。优选的弹性模量范围包括约
5pa、10pa、15pa、20pa、25pa或50pa至约80kpa、100kpa、120kpa或140kpa。根据本发明，可根据输入材料的预期功能有利地改变输入材料的弹性模量。在一些实施方案中，较低的弹性模量用于支持细胞生长和迁移，而在其他实施方案中，可使用非常高的弹性模量。
62.如本文所用，术语“天然藻酸盐聚合物”是指已从一种或多种天然来源(例如，一种或多种褐海藻类或海藻)中分离和纯化的藻酸盐聚合物。
63.如本文所用，术语“解聚”是指将聚合物链断裂成单体或其他较小单元。
64.如本文所用，术语“水凝胶”是指包含水和亲水性聚合物链的网络或晶格的组合物。
65.如本文所用，术语“鞘流体”或“鞘溶液”是指在材料通过流体通道时至少部分地用来将材料包封或“入鞘”的流体。在一些实施方案中，鞘流体包含水性溶剂，例如水或甘油。在一些实施方案中，鞘流体包含化学交联剂。交联剂的非限制性示例包括二价阳离子(例如，ca
2+
、ba
2+
，sr
2+
等)、凝血酶和改变ph的化学品，诸如碳酸氢钠。
66.如本文所用，术语“过量的鞘流体”是指从分配孔口分配的鞘流体的一部分，并且不形成使用本文提供的系统或方法的一个或多个实施方案打印的纤维结构的一部分。例如，过量的鞘流体可用于润滑材料(例如，水凝胶)通过打印头中的分配通道并通过分配孔口的通道。一旦从分配孔口中分配出来，过量的鞘流体可能从分配材料层的表面流出，并流到接收表面上，过量的鞘流体在此处收集或汇集。
67.如本文所用，术语“通道长度”是指当从第一位置到第二位置追踪流体通道时行驶的线性距离。
68.如本文所用，术语“会聚角”是指在会聚的两个流体通道之间形成的角度。
69.打印头：
70.本发明的各方面包括可用于制备一个或多个中空纤维结构的打印头。根据本发明的实施方案的打印头包括位于共同的壳体或外壳内的多个互连的流体通道，并且被配置为制备包括一种或多种输入材料的中空纤维结构。在一些实施方案中，打印头被配置为制备固化的中空纤维结构。在一些实施方案中，打印头被配置为制备包括活细胞的固化的中空纤维结构。
71.在一些实施方案中，打印头包括具有远侧端部和近侧端部的分配通道。根据本发明的实施方案的分配通道可具有范围为约1mm至约100mm，诸如约5mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm、55mm、60mm、65mm、70mm、75mm、80mm、85mm、90mm或约95mm的通道长度。根据本发明的实施方案的分配通道可具有范围为约10μm至约5mm，诸如约25μm、50μm、75μm或100μm，或诸如约0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1.0mm、2.0mm或3.0mm的宽度或直径。根据本发明的实施方案的分配通道可具有范围为约10μm至约5mm，诸如约25μm、50μm、75μm或100μm，或诸如约0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1.0mm、2.0mm或3.0mm的深度。根据本发明的实施方案的分配通道可具有任何合适的横截面形状，例如圆形、椭圆形、正方形或矩形横截面形状。
72.在一些实施方案中，分配通道包括分配孔口。在一些实施方案中，分配孔口定位于分配通道的远侧端部处。根据本发明的实施方案的分配孔口可具有范围为约10μm至约5mm，诸如约15μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、45μm、50μm、55μm、60μm、65μm、70μm、75μm、80μm、85μm、90μm、95μm或100μm，或诸如约150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm、500μ
m、550μm、600μm、650μm、700μm、750μm、800μm、850μm、900μm或950μm的直径。根据本发明的实施方案的分配孔口可具有任何合适的横截面形状，例如圆形、椭圆形、正方形或矩形横截面形状。
73.在一些实施方案中，打印头还包括延伸尖端，该延伸尖端包括用于从打印头分配材料的孔口。这种延伸尖端便于材料的精确分配及其在封闭区域中的沉积，该封闭区域诸如例如多孔板(例如，标准微量滴定板、多孔板或具有6个、24个、96个或更多个孔的微孔板)或培养皿中的孔。在一些实施方案中，延伸尖端包括管(例如，由塑料、玻璃或金属制成)，该管具有配置为适配到分配通道的一部分中的外部和配置为与分配通道对准的内表面(在管中限定中空空间)。可将延伸尖端插入分配通道中，从而延长分配通道的长度，这便于将从延伸尖端中的孔口分配的材料沉积到封闭空间诸如孔板插入物或培养皿中。
74.根据本发明的实施方案的打印头包括一个或多个芯通道。在某些实施方案中，一个或多个芯通道在分配通道的近侧端部处与分配通道会聚。在一些实施方案中，芯通道与分配通道以范围为约0度至约180度，诸如约5度、10度、15度、20度、25度、30度、35度、40度、45度、50度、55度、60度、65度、70度、75度、80度、85度、90度、95度、100度、105度、110度、115度、120度、125度、130度、135度、140度、145度、150度、155度、160度、165度、170度或175度的会聚角会聚。根据本发明的实施方案的芯通道可具有任何合适的通道长度。在一些实施方案中，芯通道具有范围为约100μm至约100mm，诸如约1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm、55mm、60mm、65mm、70mm、75mm、80mm、85mm、90mm或95mm的通道长度。根据本发明的实施方案的芯通道可具有范围为约10μm至约5mm，诸如约25μm、50μm、75μm或100μm，或者诸如约0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1.0mm、2.0mm或3.0mm的宽度或直径。根据本发明的实施方案的材料通道可具有范围为约10μm至约5mm，诸如约25μm、50μm、75μm或100μm，或者诸如约0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1.0mm、2.0mm或3.0mm的深度。
75.在一些实施方案中，打印头包括至少两个芯子通道，这些芯子通道会聚以形成具有第三直径的第一流体聚集入口。在一些实施方案中，打印头包括范围为3个至10个的多个芯子通道，诸如4个、5个、6个、7个、8个或9个材料通道。根据本发明的实施方案的芯通道可具有任何合适的横截面形状，例如圆形、椭圆形、正方形或矩形横截面形状。在一些实施方案中，打印头被配置为通过芯通道分配不可交联材料。
76.根据本发明的实施方案的打印头包括至少第一壳通道。在某些实施方案中，第一壳通道在第一流体聚集交汇处在分配通道的近侧端部处与芯通道和分配通道会聚。在一些实施方案中，第一壳通道与分配通道以范围为约0度至约180度，诸如约5度、10度、15度、20度、25度、30度、35度、40度、45度、50度、55度、60度、65度、70度、75度、80度、85度、90度、95度、100度、105度、110度、115度、120度、125度、130度、135度、140度、145度、150度、155度、160度、165度、170度或175度的会聚角会聚。根据本发明的实施方案的壳通道可具有任何合适的长度。在一些实施方案中，壳通道具有范围为约100μm至约100mm的范围内，诸如约1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm、55mm、60mm、65mm、70mm、75mm、80mm、85mm、90mm或95mm的通道长度。根据本发明的实施方案的壳通道可具有范围为约10μm至约5mm，诸如约25μm、50μm、75μm或100μm，或诸如约0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1.0mm、2.0mm或3.0mm的宽度或直径。根据
本发明的实施方案的壳通道可具有范围为约10μm至约5mm，诸如约25μm、50μm、75μm或100μm，或者诸如约0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1.0mm、2.0mm或3.0mm的深度。根据本发明的实施方案的壳通道可具有任何合适的横截面形状，例如圆形、椭圆形、正方形或矩形横截面形状。
77.在某些实施方案中，第一壳通道围绕芯通道的远侧端部同心地设置。在一个示例性实施方案中，芯通道的远侧端部包括设置在打印头中的第一壳通道内的管，如图9和图10所示。适用于这种管的材料包括金属(例如，不锈钢、黄铜、钛和铬镍铁合金)、玻璃、熔融石英和塑料(例如，聚碳酸酯、聚醚醚酮(peek)和聚四氟乙烯(ptfe))。在一些实施方案中，芯通道的远侧端部包括管，该管具有配置为适配到第一壳通道的一部分中的外部和配置为与芯通道对准的内表面(在管中限定中空空间)。
78.根据本发明的实施方案的打印头包括鞘流通道。在某些实施方案中，鞘流通道在定位于第一流体聚集交汇处和分配通道的远侧端部之间的鞘流体交汇处与分配通道会聚。在一些实施方案中，鞘流通道与分配通道以范围为约0度至约180度，诸如约5度、10度、15度、20度、25度、30度、35度、40度、45度、50度、55度、60度、65度、70度、75度、80度、85度、90度、95度、100度、105度、110度、115度、120度、125度、130度、135度、140度、145度、150度、155度、160度、165度、170度或175度的会聚角会聚。在一些实施方案中，分配通道的近侧端部与鞘流体交汇处之间的距离在约10μm至约100mm的范围内，诸如约25μm、50μm、75μm或100μm，或诸如约1mm、5mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm、55mm、60mm、65mm、70mm、75mm、80mm、85mm、90mm或95mm。在一些实施方案中，分配通道的远侧端部与鞘流体交叉处之间的距离在约10μm至约100mm的范围内，诸如约25μm、50μm、75μm或100μm，或诸如约1mm、5mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm、55mm、60mm、65mm、70mm、75mm、80mm、85mm、90mm或95mm。
79.根据本发明的实施方案的鞘流通道可具有任何合适的长度。在一些实施方案中，鞘流通道具有范围为约100μm至约100mm，诸如约1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm、55mm、60mm、65mm、70mm、75mm、80mm、85mm、90mm或95mm的通道长度。根据本发明的实施方案的鞘流通道可具有范围为约10μm至约5mm，诸如约25μm、50μm、75μm或100μm，或者诸如约0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1.0mm、2.0mm或3.0mm的宽度或直径。根据本发明的实施方案的鞘流通道可具有范围为约10μm至约5mm，诸如约25μm、50μm、75μm或100μm，或者诸如约0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1.0mm、2.0mm或3.0mm的深度。在一些实施方案中，鞘流通道包括两个或更多个鞘流子通道。在一些实施方案中，鞘流通道分成范围为3个至10个的多个鞘流子通道，诸如4个、5个、6个、7个、8个或9个。在一些实施方案中，两个或更多个鞘流子通道在鞘流体交汇处与分配通道会聚。根据本发明的实施方案的鞘流通道可具有任何合适的横截面形状，例如圆形、椭圆形、正方形或矩形横截面形状。
80.根据本发明的实施方案的流体通道一般包括一个或多个输入孔口，通过该一个或多个输入孔口可将流体引入到通道中。在一些实施方案中，流体通道包括配置为调节通过流体通道的流体的流量的控制阀。在一些实施方案中，输入孔口和控制阀之间的通道长度在约100μm至约100mm的范围内，诸如约1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm、55mm、60mm、65mm、70mm、75mm、80mm、85mm、
90mm或95mm。在一些实施方案中，控制阀与通道和分配通道会聚的位置之间的通道长度在约100μm至约100mm的范围内，诸如约1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm、55mm、60mm、65mm、70mm、75mm、80mm、85mm、90mm或95mm。
81.根据本发明的实施方案的打印头可由任何合适的材料制成，包括但不限于塑料(例如，聚合物材料)、玻璃、金属、陶瓷或它们的任何组合。在一些实施方案中，打印头包括对光(例如，紫外线(uv)光)至少部分透明的材料。在一些实施方案中，打印头完全由透明材料制成。在某些实施方案中，打印头的包围或直接邻近分配通道的一部分包含对光部分或完全透明的材料。此类打印头可与配置为与光能交联的输入材料(例如，可光交联输入材料)一起使用。
82.本发明的各方面包括光模块，该光模块被配置为将可光交联输入材料暴露于电磁辐射以便交联该输入材料。根据本发明的实施方案的光模块可被集成到打印头中，或者可以是打印系统的单独部件。在一些实施方案中，当输入材料位于分配通道内时，光模块使输入材料暴露于光。在一些实施方案中，在从分配通道分配输入材料之后，光模块使输入材料暴露于光。在一些实施方案中，打印头包括多个光模块，其中第一光模块被配置为在输入材料位于分配通道内时使输入材料暴露于光，并且第二光模块被配置为在从分配通道分配输入材料之后使输入材料暴露于光。
83.在一些实施方案中，光模块可关于波长、强度、曝光时间或它们的任何组合进行调谐。在一些实施方案中，光模块包括一个或多个任选地接合的衰减滤波器，其中衰减滤波器在接合时调节光强度。在一些实施方案中，光模块被配置为发射uv光，其中从模块发射的光的波长在约10nm至约400nm的范围内，诸如约20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、125nm、150nm、175nm、200nm、225nm、250nm、275nm、300nm、325nm、350nm或375nm。在一些实施方案中，作为非限制性示例，合适的uv光源包括uv灯、uv荧光灯、uv led、uv激光器或它们的任何组合。
84.如上所述，本发明的各方面包括一种打印头，该打印头包括分配通道，其中一个或多个材料通道和缓冲溶液通道在分配通道的近侧端部处会聚。本发明的打印头被配置为与一种或多种可交联材料同时分配缓冲溶液和/或鞘流体，以便在打印的纤维中形成中空芯。在一些实施方案中，打印头被配置为保持通过分配通道的恒定质量流量。以这种方式，本发明的打印头被配置为便于一种或多种输入材料(或一种或多种输入材料的混合物)和缓冲溶液和/或鞘流体通过分配通道的平稳连续流动。
85.如上所述，本发明的附加方面包括一种打印头，该打印头包括分配通道，其中一个或多个鞘流通道在定位于第一流体聚集交汇处和分配通道的远侧端部之间的鞘流体交汇处与分配通道会聚。在使用本发明的打印头时，流过分配通道的输入材料既可从内部，通过流过芯通道的鞘流体进行交联，也可从外部，通过流过鞘流通道的鞘流体进行交联。
86.在优选的实施方案中，一种打印头包括：分配通道，该分配通道具有近侧端部和远侧端部；分配孔口，该分配孔口定位于分配通道的远侧端部处；两个壳通道，该两个壳通道在分配通道的远侧端部处与分配通道会聚，其中每个壳通道具有在约30度至60度之间，更优选地在约40度至50度之间，最优选地约45度的会聚角；芯通道，该芯通道在分配通道的近侧端部处与分配通道会聚，其中芯通道具有0度的会聚角；以及鞘流通道，该鞘流通道分为
两个鞘流子通道，其中鞘流子通道在鞘流体交汇处与分配通道会聚并且具有在约30度至60度之间，更优选地在约40度之间50度，最优选约45度的会聚角。
87.在另一优选的实施方案中，一种打印头包括：分配通道，该分配通道具有近侧端部和远侧端部；分配孔口，该分配孔口定位于分配通道的远侧端部处；四个壳通道，该四个壳通道在分配通道的远侧端部处与分配通道会聚，其中每个壳通道具有在约20度至90度之间的会聚角；芯通道，该芯通道在分配通道的近侧端部处与分配通道会聚，其中芯通道具有0度的会聚角；以及鞘流通道，该鞘流通道分为两个鞘流子通道，其中鞘流子通道在鞘流体交汇处与分配通道会聚并且具有在约30度至60度之间，更优选地在约40度之间50度，最优选约45度的会聚角。
88.打印系统：
89.本发明的各方面包括被配置为与本发明的打印头协同作用以执行本发明的方法的打印系统和相关联的部件。在一些实施方案中，打印系统包括单个打印头，如本文所述。在一些实施方案中，打印系统包括多个打印头，诸如2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个单独的打印头，如本文所述。在一些实施方案中，打印头与打印系统流体隔离，使得打印过程所涉及的所有流体在打印头内保持隔离，并且在打印过程期间仅与打印系统的接收表面(如下所述)接触。在一些实施方案中，打印头被配置为可操作地联接到打印系统，而不使打印过程所涉及的流体与打印系统的部件接触。在一些实施方案中，可在打印过程之前、之中和/或之后将一个或多个打印头移除和/或添加到打印系统。因此，在一些实施方案中，本发明的打印头是本发明的打印系统的模块化部件。
90.在一些实施方案中，打印系统包括接收表面，在该接收表面上沉积从打印头的分配孔口所分配的第一材料层。在一些实施方案中，接收表面包括实心材料。在一些实施方案中，接收表面包括多孔材料。例如，在一些实施方案中，多孔材料的孔隙率足以允许流体从中通过。在一些实施方案中，接收表面是基本上平坦的，从而提供可在其上沉积第一分配材料层的平坦表面。在一些实施方案中，接收表面具有与待打印三维结构相对应的形貌，从而便于具有非平坦第一层的三维结构的打印。
91.在一些实施方案中，接收表面包括真空部件，该真空部件被配置为向接收表面施加来自一个或多个真空源的抽吸。在一些实施方案中，接收表面包括一个或多个真空通道，该一个或多个真空通道被配置为向接收表面施加抽吸。在一些实施方案中，包括真空部件的接收表面被配置为在执行打印过程之前、期间和/或之后从接收表面抽出过量流体。
92.在一些实施方案中，接收表面为非细胞毒性表面，打印系统将一个或多个纤维结构分配到该非细胞毒性表面上。在一些实施方案中，打印系统包括打印机台架。在一些实施方案中，接收表面为打印机台架的表面。在一些实施方案中，接收表面是与打印机台架分离但被附连到打印机台架或由打印机台架支撑的部件。在一些实施方案中，接收表面是平坦的或基本上平坦的。在一些实施方案中，接收表面是平滑的或基本上平滑的。在一些实施方案中，接收表面既是基本上平坦的又是基本上平滑的。在一些实施方案中，接收表面被配置为适应打印结构的形状、尺寸、纹理或几何形状。在一些实施方案中，接收表面控制或影响打印结构的尺寸、形状、纹理或几何形状。
93.在一些实施方案中，接收表面包括一个或多个模块化部件，该一个或多个模块化部件被配置为可操作地联接到打印系统，但可与打印系统分离。在一些实施方案中，接收表
面为一次性接收表面。在一些实施方案中，接收表面被配置用于灭菌。在一些实施方案中，打印系统的整个流体路径是一次性的，这意味着打印系统的与打印过程所涉及的一种或多种流体接触的所有部件都是一次性的，并且可从打印系统中移除并且可更换为干净的部件。
94.在一些实施方案中，接收表面被配置为可操作地联接到一个或多个不同的接收器皿。例如，在一些实施方案中，接收表面包括圆形部分，该圆形部分的尺寸设计成可操作地联接到圆形接收器皿(例如，培养皿)。在一些实施方案中，接收表面包括正方形或矩形部分，该正方形或矩形部分的尺寸设定成可操作地联接到正方形或矩形接收器皿(例如，多孔板(例如，六孔板))。根据本发明的实施方案的接收表面可具有任何合适的尺寸或几何形状以容纳合适的接收器皿。
95.在一些实施方案中，打印系统包括温度调节部件，该温度调节部件被配置为调节接收表面的温度。在一些实施方案中，温度调节部件将接收表面的温度调节和/或维持在环境温度。在一些实施方案中，温度调节部件调节和/或维持打印头、打印机台架、接收表面、输入材料和/或流体(例如，鞘溶液和/或缓冲溶液)的温度。
96.在一些实施方案中，温度调节部件包括加热元件。在一些实施方案中，温度调节部件包括加热器。在一些实施方案中，温度调节部件包括辐射加热器、对流加热器、导电加热器、风扇加热器、热交换器或它们的任何组合。在一些实施方案中，温度调节部件包括冷却元件。在一些实施方案中，温度调节部件包括冷却剂、冷却液体、冰或它们的任何组合的容器。在一些实施方案中，温度调节部件包括辐射冷却器、对流冷却器、导电冷却器、风扇冷却器或它们的任何组合。
97.在一些实施方案中，温度调节部件被配置为将温度调整到范围为约0℃至约90℃，诸如约1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃或85℃的设定点。
98.在一些实施方案中，打印系统通过相对于打印机台架或适于接收打印材料的接收表面移动打印头来实现特定的几何形状。在其他实施方案中，打印系统通过相对于打印头移动打印机台架或接收表面来实现特定的几何形状。在某些实施方案中，打印系统的至少一部分被保持在无菌环境中(例如，保持在生物安全柜(bsc)内)。在一些实施方案中，打印系统被配置为完全适合无菌环境。
99.在一些实施方案中，接收表面接收从分配孔口所分配的并且从分配孔口分配的一个或多个材料层流出的过量流体(例如，过量的鞘流体和/或过量的缓冲溶液)。
100.在一些实施方案中，系统包括用于从沉积有从打印头的孔口分配的纤维结构的接收表面移除过量流体(例如，过量鞘流体和/或过量缓冲溶液)，并且任选地从分配的纤维结构的表面移除过量流体的部件。在打印期间，过量流体可能会收集或“汇集”在接收表面上或分配的纤维结构的表面上。这种汇集可能会干扰沉积过程。例如，汇集的鞘流体可能导致分配的纤维从其在正打印的3d结构中的预期位置滑落。因此，在一些实施方案中，通过流体移除部件从接收表面以及任选地从分配的纤维结构的表面移除过量的鞘流体可改善三维结构的增材制造。
101.可通过从接收表面或从一个或多个分配纤维层的表面上吸出过量流体，通过允许或便于从那些表面上蒸发过量流体来从那些表面上移除过量流体，或者在其中接收表面是
多孔的实施方案中，可通过将过量流体拉过多孔表面来移除过量流体。在一些实施方案中，接收表面包括多孔材料，孔的尺寸被设定成便于流体从中通过，并且尺寸被设定成支撑沉积在其上的一个或多个纤维结构层。
102.在一些实施方案中，用于从接收表面以及任选地从分配的纤维结构的表面移除过量流体的部件可包括在配置为将材料分配到多孔板或培养皿中的系统中。在一些实施方案中，打印床上的接收表面包括吸收性材料或与吸收性材料相邻放置，该吸收性材料便于从接收表面吸收过量流体。例如，可将具有由多孔膜材料或任何其他多孔膜基材制成的基底的孔板插入物放置在吸收性材料例如海绵的顶部或附近。吸收性材料的作用是从接收表面吸走过量流体。在其中吸收性材料设置在多孔接收表面下方的实施方案中，可通过多孔接收表面吸出接收表面上的过量流体并将其吸到吸收性材料中，从而防止过量流体汇集在接收表面上。在其中吸收性材料紧邻接收表面的一部分设置或设置在接收表面的一部分上(例如，设置在接收表面的周边上，以免干扰分配的材料的沉积)的实施方案中，可从接收表面中吸出过量的鞘流体并将其吸入吸收性材料中。
103.在一些实施方案中，接收表面包括流体地联接到真空源的一个或多个管，该一个或多个管可提供抽吸以用于从接收表面以及任选地从分配的纤维结构的表面移除过量流体。在此类实施方案中，也可使用实心或多孔的接收表面。在一些实施方案中，打印头被配置为还包括一个或多个真空通道，该一个或多个真空通道各自具有位于分配孔口附近(即，邻近于分配孔口)的孔口。该一个或多个真空通道各自具有入口，该入口被配置为便于与一个或多个真空的流体连通。当打印头与真空流体连通时，该一个或多个真空通道将负压引导到接收表面的正从分配孔口分配材料或已从分配孔口分配材料的区域和/或引导到分配的纤维结构的表面区域的一部分，从而从接收表面以及任选地从分配的纤维结构的表面吸出过量流体，从而消除了流体在接收表面和/或分配的纤维结构上的汇集。
104.在一些实施方案中，该一个或多个真空管至少部分地设置在从打印头突出的一个或多个延伸部中，该延伸部沿与包括分配孔口和分配通道的延伸部大致相同的方向突出。在此类实施方案中，包括真空管的一个或多个延伸部不比包括分配孔口和分配通道的延伸部延伸得更远，以免干扰分配过程。
105.在一些实施方案中，流体移除特征可以是流体组合物本身的特征。例如，鞘流体组合物和/或缓冲溶液组合物可被设计为在从分配孔口分配之后蒸发，从而消除过量流体在接收表面或分配的纤维结构的表面上的汇集。例如，鞘流体的沸点可导致在分配后蒸发，而在分配前保持液态。
106.在一些实施方案中，打印系统包括3d机动台架，该3d机动台架包括用于在三维空间中在打印床上方定位打印头和分配孔口的三个臂，该打印床包括用于接收打印材料的表面。在一个实施方案中，可控制3d机动台架(即，定位单元)以定位竖直臂，该竖直臂沿着3d机动台架的z轴延伸，使得打印头孔口向下。沿着机动台架的x轴延伸的第一水平臂固定到稳定的基础平台。沿着机动平台的y轴延伸的第二水平臂可移动地联接到第一水平臂的上表面，使得第一水平臂和第二水平臂的纵向方向彼此垂直。应当理解，上面相对于臂使用的术语“竖直”和“水平”旨在描述打印头移动的方式，而不必限制臂本身的物理取向。
107.在一些实施方案中，接收表面位于平台的顶部上，该平台联接到第二水平臂的上表面。在一些实施方案中，3d机动台架臂分别由三个对应的马达驱动，并由诸如计算机的可
编程控制处理器控制。在优选的实施方案中，打印头和接收表面可通过3d机动台架沿着笛卡尔坐标系的所有三个主轴线共同移动，并且台架的移动是使用计算机软件定义的。应当理解，本发明不仅限于所描述的定位系统，并且其他定位系统在本领域中是已知的。当从打印头上的分配孔口分配材料时，定位单元以软件控制的模式移动，从而在接收表面上形成第一分配材料层。然后，将附加的分配材料层堆叠在彼此的顶部，以使分配材料层的最终3d几何形状通常是由软件提供的3d几何形状设计的副本。如本领域中已知的，可使用典型的3d cad(计算机辅助设计)软件来形成3d设计或从数字图像生成3d设计。此外，如果软件生成的几何形状包含有关要使用的特定材料的信息，则根据本发明的一个实施方案，可将特定输入材料类型分配给不同的几何位置。例如，在一些实施方案中，打印的3d结构可包括两种或更多种不同的输入材料，其中每种输入材料具有不同的特性(例如，每种输入材料包括不同的细胞类型、不同的细胞浓度、不同的ecm组成等)。
108.本发明的打印系统的各方面包括软件程序，该软件程序被配置为便于以特定图案和特定位置沉积本发明的输入材料，以便形成特定的纤维、平面或3d结构。为了制造此类结构，本发明的打印系统将本发明的输入材料沉积在接收表面上的精确位置上(二维或三维)。在一些实施方案中，打印系统沉积材料的位置由用户输入定义，并且被转换成计算机代码。在一些实施方案中，计算机代码包括可在数字处理设备的中央处理单元(cpu)中执行的、被写入以执行指定任务的指令序列。在一些实施方案中，打印参数(包括但不限于打印纤维尺寸、泵速、打印头定位系统的移动速度以及交联剂强度或浓度)由用户输入定义，并且被转换成计算机代码。在一些实施方案中，打印参数不是由用户输入直接定义的，而是由计算机代码根据其他参数和条件导出的。
109.本发明的各方面包括用于制造组织构建体、组织和器官的方法，该方法包括：计算机模块接收期望组织构建体的视觉表示的输入；计算机模块生成命令系列，其中命令基于视觉表示并且可由本发明的打印系统读取；计算机模块向打印系统提供命令系列；以及打印系统根据命令沉积一种或多种输入材料以形成具有限定的几何形状的构建体。
110.在一些实施方案中，打印系统沉积输入材料的位置由用户输入定义并且被转换成计算机代码。在一些实施方案中，本文所公开的设备、系统和方法还包括非暂时性计算机可读存储介质或以计算机可读程序代码编码的存储介质。在一些实施方案中，计算机可读存储介质是数字处理设备诸如生物打印机(或其部件)的有形部件，或连接到生物打印机(或其部件)的计算机。在一些实施方案中，计算机可读存储介质任选地可从数字处理设备移除。在一些实施方案中，作为非限制性示例，计算机可读存储介质包括cd
‑
rom、dvd、闪存存储器设备、固态存储器、磁盘驱动器、磁带驱动器、光盘驱动器、云计算系统和/或服务等。在某些情况下，程序和指令在存储介质上被永久地、基本上永久地、半永久地或非临时地编码。
111.在一些实施方案中，本文所描述的设备、系统和方法包括软件、服务器和数据库模块。在一些实施方案中，“计算机模块”是与较大计算机系统交互的软件部件(包括代码段)。在一些实施方案中，软件模块(或程序模块)以一个或多个文件的形式出现，并且通常在较大软件系统中处理特定任务。
112.在一些实施方案中，模块被包括在一个或多个软件系统中。在一些实施方案中，模块与一个或多个其他模块集成到一个或多个软件系统中。计算机模块任选地是代码的独立
段，或者任选地是不可单独识别的代码。在一些实施方案中，模块位于单个应用程序中。在其他实施方案中，模块位于多个应用程序中。在一些实施方案中，模块被托管在一台机器上。在一些实施方案中，模块被托管在多台机器上。在一些实施方案中，模块在一个位置中托管在多台机器上。在一些实施方案中，模块在多于一个位置中托管在多台机器上。根据本发明的实施方案的计算机模块允许最终用户使用计算机来执行本文所描述的方法的一个或多个方面。
113.在一些实施方案中，计算机模块包括图形用户界面(gui)。如本文所用，“图形用户界面”是指使用应用程序的输入和输出以及存储信息的分级数据结构或其他数据结构的图形以及文本表示的用户环境。在一些实施方案中，计算机模块包括显示屏。在其他实施方案中，计算机模块经由显示屏呈现二维gui。在一些实施方案中，计算机模块经由显示屏呈现诸如虚拟现实环境的三维gui。在一些实施方案中，显示屏为触摸屏并且呈现交互式gui。
114.本发明的各方面包括一个或多个质量控制部件，该一个或多个质量控制部件被配置为监视和/或调节本发明的打印系统的一个或多个参数，以便确保一个或多个打印纤维具有合适的特性。例如，在一些实施方案中，如果沉积过程进行得太快，则在已分配纤维之后，打印的纤维结构可开始在分配通道内或在分配通道外形成卷曲结构。在一些实施方案中，质量控制部件包括相机，该相机被配置为通过收集打印的纤维结构的一个或多个图像来监视沉积过程，并确定打印的纤维结构是否已经形成卷曲结构。在一些实施方案中，质量控制部件被配置为调节沉积过程的一个或多个参数(例如，以降低压力和/或降低沉积速度)，以便减少或避免由打印的纤维结构形成卷曲结构。
115.本发明的各方面包括一个或多个流体贮存器，该一个或多个流体贮存器被配置为储存流体并通过一个或多个流体通道将流体输送到打印系统(例如，打印头)，该流体通道在打印系统与贮存器之间提供流体连通。在一些实施方案中，打印系统包括与流体通道流体连通的一个或多个流体贮存器。在一些实施方案中，流体贮存器连接到流体通道的输入孔口。在一些实施方案中，流体贮存器被配置成保持范围约100μl至约1l，诸如约1ml、5ml、10ml、15ml、20ml、25ml、30ml、35ml、40ml、45ml、50ml、55ml、60ml、65ml、70ml、75ml、80ml、85ml、90ml、95ml或100ml，或诸如约150ml、200ml、250ml、300ml、350ml、400ml、450ml、500ml、550ml、600ml、650ml、700ml、750ml、800ml、850ml、900ml或950ml的流体。
116.在一些实施方案中，打印系统包括压力控制单元，该压力控制单元流体地联接到一个或多个贮存器。压力控制单元被配置为提供力以使一种或多种流体移动穿过打印系统。在一些实施方案中，压力控制单元经由一个或多个连接管向一种或多种流体提供气压。施加的压力迫使流体经由相应的流体通道从贮存器中流出并进入打印头。在一些实施方案中，可使用替代手段来使流体移动穿过通道。例如，可使用一系列电子控制的注射泵来提供力以使流体移动穿过打印头。
117.在一些实施方案中，打印系统包括光模块(如上所述)，该光模块用于任选地使可光交联输入材料暴露于光以便交联该材料。根据本发明的实施方案的光模块可被集成到打印头中，或者可以是打印系统的部件。
118.输入材料：
119.本发明的各方面包括可用于打印纤维结构的输入材料。在一些实施方案中，输入材料包含水凝胶。水凝胶的非限制性示例包括藻酸盐、琼脂糖、胶原蛋白、纤维蛋白原、明
胶、壳聚糖、透明质酸基凝胶或它们的任何组合。多种合成水凝胶是已知的，并且可用于本文提供的系统和方法的实施方案中。例如，在一些实施方案中，一种或多种水凝胶形成打印的三维结构的结构基础。在一些实施方案中，水凝胶具有支持一种或多种细胞类型的生长和/或增殖的能力，该细胞类型可分散在水凝胶中或在已以三维配置打印后添加到水凝胶中。在一些实施方案中，水凝胶可通过化学交联剂交联。例如，包含藻酸盐的水凝胶可在二价阳离子存在下可交联，包含壳聚糖的水凝胶可使用多价阴离子诸如三聚磷酸钠(stp)交联，包含纤维蛋白原的水凝胶可在酶诸如凝血酶存在下交联，以及包含胶原蛋白、明胶、琼脂糖或壳聚糖的水凝胶可在热或碱性溶液存在下交联。在一些实施方案中，当暴露于可与输入材料混溶的交联剂材料时，可通过经由来自输入材料的溶剂萃取实现的沉淀反应来生成水凝胶纤维。经由沉淀反应形成纤维的输入材料的非限制性示例包括胶原蛋白和聚乳酸。能够形成沉淀介导的水凝胶纤维的交联材料的非限制性示例包括聚乙二醇(peg)和藻酸盐。水凝胶的交联将增加水凝胶的硬度，在一些实施方案中，从而允许形成固化的水凝胶。
120.在一些实施方案中，水凝胶包含藻酸盐。藻酸盐当与二价阳离子接触时形成固化的胶态凝胶(高含水量凝胶或水凝胶)。可使用任何合适的二价阳离子与包含藻酸盐的输入材料形成固化的水凝胶。在藻酸盐离子亲和力系列cd
2+
>ba
2+
>cu
2+
>ca
2+
>ni
2+
>co
2+
>mn
2+
中，ca
2+
是表征最充分的，并且最常用于形成藻酸盐凝胶(ouwerx,c.等人,polymer gels and networks,1998,6(5):393
‑
408)。研究表明，藻酸钙凝胶是经由相邻聚合物链上的聚g嵌段与ca
2+
离子的协同结合而形成，即所谓的“卵盒”模型(isp alginates,第3节:algin
‑
manufacture and structure,in alginates:products for scientific water control,2000,international specialty products:san diego,第4
‑
7页)。富含钙的藻酸盐倾向于形成热稳定、坚固而又易碎的钙凝胶，而富含m的藻酸盐倾向于形成热稳定性较差、较弱但弹性更大的凝胶。在一些实施方案中，水凝胶包含解聚的藻酸盐，如美国临时专利申请号62/437,601中所述，其公开内容以引用的方式全文并入本文。
121.在一些实施方案中，水凝胶可使用自由基聚合反应交联以在分子之间生成共价键。可通过将光引发剂暴露于光(通常是紫外线)，或通过将水凝胶前体暴露于以下化学源来生成自由基：诸如过二硫酸铵(aps)或过二硫酸钾(kps)的自由基与n,n,n,n
‑
四甲基乙二胺(temed)结合，分别作为引发剂和催化剂。光可交联的水凝胶的非限制性示例包括：甲基丙烯酸酯化水凝胶，诸如基于明胶甲基丙烯酸酯(gel
‑
ma)或基于聚乙二醇(二醇)二丙烯酸酯(peg
‑
da)的水凝胶，由于其在暴露于uv光后在自由基存在下交联的能力以及由于其对细胞的惰性而用于细胞生物学。peg
‑
da通常在组织工程中用作支架，因为在室温下聚合反应迅速发生，所需能量低，含水量高、具有弹性并且可定制以包含各种生物分子。
122.附加组分：
123.根据本发明的实施方案的输入材料可包含支持活细胞生存力的多种天然或合成聚合物中的任一种，包括例如层粘连蛋白、纤维蛋白、透明质酸、基于聚乙二醇的凝胶、明胶、壳聚糖、琼脂糖或它们的组合。在特别优选的实施方案中，本发明的生物墨水组合物在生理上是相容的，即有利于细胞生长、分化和通讯。在某些实施方案中，输入材料包括一种或多种生理基质材料或它们的组合。“生理基质材料”是指在天然哺乳动物组织中发现的生物材料。此类生理基质材料的非限制性示例包括：纤连蛋白、血小板反应蛋白、糖胺聚糖
(gag)(例如，透明质酸、6
‑
硫酸软骨素、硫酸皮肤素、4
‑
硫酸软骨素或硫酸角质素)、脱氧核糖核酸(dna)、粘附糖蛋白和胶原蛋白(例如，胶原蛋白i、胶原蛋白ii、胶原蛋白iii、胶原蛋白iv、胶原蛋白v、胶原蛋白vi或胶原蛋白xviii)。
124.胶原蛋白为大多数组织提供拉伸强度，并且多个直径约100nm的胶原蛋白原纤维结合在一起，可生成直径约10μm的强卷曲螺旋纤维。某些组织构建体的生物力学功能是经由胶原纤维的定向排列来实现的。在一些实施方案中，输入材料包含胶原蛋白原纤维。包含胶原蛋白原纤维的输入材料可用于产生形成组织构建体的纤维结构。通过调节纤维结构的直径，可控制胶原原纤维的取向，以期望的方式引导胶原蛋白原纤维的聚合。
125.例如，先前研究表明，不同直径的微流体通道可引导胶原蛋白原纤维的聚合，形成沿着通道的长度取向的纤维，但仅在通道直径为100μm或更小时进行(lee等人，2006年)。在这些定向基质中生长的原代内皮细胞显示为沿胶原蛋白纤维的方向排列。在另一项研究中，martinez等人证明，纤维素珠支架中的500μm通道可引导胶原蛋白和细胞的排列(martinez等人，2012年)。在一些实施方案中，可将输入材料形成为纤维结构，该纤维结构具有范围为约20μm至约500μm，诸如约50μm、约75μm、约100μm、约125μm、约150μm、约175μm、约200μm、约225μm、约250μm、约275μm、约300μm、约325μm、约350μm、约375μm、约400μm、约425μm、约450μm或约475μm的直径。通过调节纤维直径，可控制胶原蛋白纤维在纤维结构内的取向。这样，纤维结构和其中的胶原蛋白纤维因此可被图案化以产生具有期望的胶原纤维布置的组织构建体，这对于在3d打印的结构上赋予期望的生物力学特性是必不可少的。
126.哺乳动物细胞类型：
127.根据本发明的实施方案的输入材料可结合有任何哺乳动物细胞类型，包括但不限于干细胞(例如，胚胎干细胞、成体干细胞、诱导多能干细胞)、生殖细胞、内胚层细胞(例如，肺细胞、肝细胞、胰腺细胞、胃肠道细胞或泌尿生殖道细胞)、中胚层细胞(例如，肾脏细胞、骨细胞、肌细胞、内皮细胞或心脏细胞)和外胚层细胞(皮肤细胞、神经系统细胞或眼细胞)或它们的任何组合。
128.在一些实施方案中，输入材料可包含：成纤维细胞、软骨细胞、半月板纤维软骨细胞、干细胞、骨髓基质(干)细胞、胚胎干细胞、间充质干细胞、诱导多能干细胞、分化干细胞、组织来源的细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、上皮细胞、内皮细胞、成肌细胞、成软骨细胞、成骨细胞、破骨细胞及它们的任何组合。
129.细胞可从供体(同种异体)或受体(自体)获得。细胞也可来自已建立的细胞培养系，或者可以是经过基因工程和/或操纵以获得所需基因型或表型的细胞。在一些实施方案中，也可使用组织块，它们可在同一结构内提供许多不同的细胞类型。
130.在一些实施方案中，细胞可从合适的供体获得，无论是人还是动物，也可从将要植入细胞的受试者获得。哺乳动物物种包括但不限于人类、猴子、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔和大鼠。在一个实施方案中，细胞为人类细胞。在其他实施方案中，细胞可源自动物，诸如狗、猫、马、猴子或任何其他哺乳动物。
131.哺乳动物细胞的适当生长条件在本领域中是众所周知的(freshney,r.i.(2000)culture of animal cells,a manual of basic technique.hoboken n.j.,john wiley&sons；lanza等人principles of tissue engineering,academic press；第2版,2000年5月15日；以及lanza&atala,methods of tissue engineering academic press；第1版,2001
年10月)。细胞培养基一般包含必需的营养素以及任选地附加元素，诸如生长因子、盐、矿物质、维生素等，这些元素可根据进行培养的细胞类型而选择。可选择特定成分来增强细胞生长、分化、特定蛋白质的分泌等。一般来讲，标准生长培养基包括杜尔贝科改良伊格尔培养基(dulbecco's modified eagle medium)低糖(dmem)，其具有110mg/l丙酮酸和谷氨酰胺，补充有10％
‑
20％胎牛血清(fbs)或小牛血清和100u/ml青霉素是适当的，本领域技术人员熟知的各种其他标准培养基也是适当的。生长条件将根据所用哺乳动物细胞的类型和所需的组织而变化。
132.在一些实施方案中，细胞类型特定的试剂可有利地用在与对应的细胞类型一起使用的本发明的输入材料中。例如，可直接从感兴趣的组织中提取细胞外基质(“ecm”)，然后将其溶解并掺入到输入材料中，以生成用于所打印的组织的组织特定输入材料。此类ecm可以容易地从患者样品中获得和/或从诸如zpredicta的供应商处商购获得(rbone
tm
，可从zpredicta.com/home/products获得)。
133.活性剂：
134.在一些方面，根据本发明的实施方案的输入材料可包含至少一种活性剂。此类活性剂的非限制性示例包括tgf
‑
β1、tgf
‑
β2、tgf
‑
β3、bmp
‑
2、bmp
‑
4、bmp
‑
6、bmp
‑
12、bmp
‑
13、碱性成纤维细胞生长因子、成纤维细胞生长因子
‑
1、成纤维细胞生长因子
‑
2、血小板衍生生长因子
‑
aa、血小板衍生生长因子
‑
bb、富血小板血浆、igf
‑
i、igf
‑
ii、gdf
‑
5、gdf
‑
6、gdf
‑
8、gdf
‑
10、血管内皮细胞衍生生长因子、多效蛋白、内皮素、烟酰胺、胰高血糖素样肽
‑
i、胰高血糖素样肽
‑
ii、甲状旁腺激素、肌腱蛋白
‑
c、原弹性蛋白、凝血酶衍生肽、层粘连蛋白、含有细胞结合域的生物肽和含有肝素结合域的生物肽、治疗剂及它们的任何组合。
135.如本文所用，术语“治疗剂”是指作为在受试者体中局部或全身地起作用的生物学、生理学或药理学活性物质的任何化学部分。治疗剂(也称为“药物”)的非限制性示例在诸如merck index、physician’s desk reference和the pharmacological basis of therapeutics的众所周知的文献参考中有所描述，并且它们包括但不限于：药剂；维生素；矿物质补充剂；用于治疗、预防、诊断、治愈或减轻疾病或病症的物质；影响身体结构或功能的物质；或前药，将其置于生理环境后具有生物活性或更强的活性。在一些实施方案中，可使用一种或多种治疗剂，其在植入到受试者后能够从本文所述的输入材料释放到相邻的组织或体液中。治疗剂的示例包括但不限于抗生素、麻醉剂、任何促进再生或组织愈合或者减轻疼痛、感染或炎症的治疗剂或它们的任何组合。
136.附加活性剂可包括但不限于蛋白质、肽、核酸类似物、核苷酸、寡核苷酸、核酸(dna、rna、sirna)、肽核酸、适体、抗体或其片段或部分、抗原或表位、激素、激素拮抗剂、生长因子或重组生长因子及其片段和变体、细胞因子、酶、抗生素或抗微生物化合物、抗炎剂、抗真菌剂、抗病毒剂、毒素、前药、小分子、药物(例如，药物、染料、氨基酸、维生素、抗氧化剂)或它们的任何组合。
137.适于包含在输入材料中的抗生素的非限制性示例包括：氨基糖苷类(例如，新霉素)、安沙霉素类、碳头孢烯、碳青霉烯类、头孢菌素类(例如，头孢唑林、头孢克洛、头孢托伦、头孢比普)、糖肽类(例如，万古霉素)、大环内酯类(例如，红霉素、阿奇霉素)、单内酰胺类、青霉素类(例如，阿莫西林、氨苄西林、氯唑西林、双氯西林、氟氯西林)、多肽类(例如，杆菌肽、多粘菌素b)、喹诺酮类(例如，环丙沙星、依诺沙星、加替沙星、氧氟沙星等)、磺胺类
(例如，柳氮磺胺吡啶、甲氧苄啶、甲氧苄啶
‑
磺胺甲噁唑(复方新诺明))、四环素类(例如，强力霉素、米诺环素、四环素等)、氯霉素、林可霉素、克林霉素、乙胺丁醇、莫匹罗星、甲硝唑、吡嗪酰胺、甲砜霉素、利福平、甲砜霉素、氨苯砜、氯法齐明、奎努普利、甲硝唑、利奈唑胺、异烟肼、磷霉素、夫西地酸或它们的任何组合。
138.抗体的非限制性示例包括：阿昔单抗(abciximab)、阿达木单抗(adalimumab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、巴利昔单抗(basiliximab)、贝伐单抗(bevacizumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、塞妥珠单抗(certolizumab pegol)、达克珠单抗(daclizumab)、依库丽单抗(eculizumab)、依法珠单抗(efalizumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)、英利昔单抗(infliximab)、莫罗单抗(muromonab)
‑
cd3、那他珠单抗(natalizumab)、奥法木单抗(ofatumumab)、奥马珠单抗(omalizumab)、帕利珠单抗(palivizumab)、帕尼单抗(panitumumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、托西莫单抗(tositumomab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、喷替酸阿妥莫单抗(altumomab pentetate)、阿西莫单抗(arcitumomab)、阿替珠单抗(atlizumab)、贝妥莫单抗(bectumomab)、贝利单抗(belimumab)、贝索单抗(besilesomab)、比西单抗(biciromab)、卡纳单抗(canakinumab)、喷替酸卡罗单抗(capromab pendetide)、卡妥索单抗(catumaxomab)、地诺单抗(denosumab)、依决洛单抗(edrecolomab)、依芬古单抗(efungumab)、厄妥索单抗(ertumaxomab)、依他拉西单抗(etaracizumab)、法索单抗(fanolesomab)、芳妥珠单抗(fontolizumab)、吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin)、戈利木单抗(golimumab)、伊戈伏单抗(igovomab)、英西单抗(imciromab)、拉贝珠单抗(labetuzumab)、美泊利单抗(mepolizumab)、莫他珠单抗(motavizumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、莫诺非莫单抗(nofetumomab merpentan)、奥戈伏单抗(oregovomab)、培妥莫单抗(pemtumomab)、帕妥珠单抗(pertuzumab)、罗维珠单抗(rovelizumab)、卢利珠单抗(ruplizumab)、硫索单抗(sulesomab)、替他珠单抗(tacatuzumab tetraxetan)、替非组单抗(tefibazumab)、托珠单抗(tocilizumab)、优特克单抗(ustekinumab)、维西珠单抗(visilizumab)、伏妥莫单抗(votumumab)、扎妥木单抗(zalutumumab)、扎诺莫单抗(zanolimumab)或它们的任何组合。
139.适用于如本文所述的输入材料的酶的非限制性示例包括：过氧化物酶、脂肪酶、直链淀粉、有机磷酸脱氢酶、连接酶、限制性核酸内切酶、核糖核酸酶、dna聚合酶、葡萄糖氧化酶和漆酶。
140.适合与本发明的输入材料一起使用的活性剂的附加非限制性示例包括：细胞生长培养基，诸如杜尔贝科改良伊格尔培养基、胎牛血清、非必需氨基酸和抗生素；生长和形态发生因子，诸如成纤维细胞生长因子、转化生长因子、血管内皮生长因子、表皮生长因子、血小板衍生生长因子、胰岛素样生长因子)、骨形态发生生长因子、骨形态发生样蛋白、神经生长因子和相关蛋白(生长因子是本领域已知的，参见例如rosen&thies,cellular&molecular basis bone formation&repair(r.g.landes co.,austin,tex.,1995)；抗血管生成蛋白，诸如内皮抑素和其他天然衍生或遗传工程蛋白；多糖、糖蛋白或脂蛋白；抗感染药物，诸如抗生素和抗病毒剂、化学治疗剂(即，抗癌剂)、抗排异药、镇痛药和镇痛药组合、抗炎剂、类固醇或它们的任何组合。
141.附加流体：
142.本发明的各方面包括一种或多种缓冲溶液。根据本发明的实施方案的缓冲溶液可与输入材料(例如，水凝胶)混溶，并且不交联输入材料。在一些实施方案中，缓冲溶液包含水性溶剂。缓冲溶液的非限制性示例包括聚乙烯醇、水、甘油、丙二醇、蔗糖、明胶或它们的任何组合。
143.根据本发明的实施方案的缓冲溶液可具有范围为约1mpa
·
s至约5,000mpa
·
s，诸如约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,250、2,500、2,750、3,000、3,250、3,500、3,750、4,000、4,250、4,500或4,750mpa
·
s的粘度。在一些实施方案中，可调节缓冲溶液的粘度，以使其与一种或多种输入材料的粘度匹配。
144.本发明的各方面包括一种或多种鞘流体。根据本发明的实施方案的鞘流体是可至少部分地用于将从分配通道分配的输入材料包封或“入鞘”的流体。在一些实施方案中，鞘流体包括水性溶剂。鞘流体的非限制性示例包括聚乙烯醇、水、甘油、丙二醇、蔗糖、明胶或它们的任何组合。根据本发明的实施方案的鞘流体可具有范围为约1mpa
·
s至约5,000mpa
·
s，诸如约10mpa
·
s、20mpa
·
s、30mpa
·
s、40mpa
·
s、50mpa
·
s、60mpa
·
s、70mpa
·
s、80mpa
·
s、90mpa
·
s、100mpa
·
s、200mpa
·
s、300mpa
·
s、400mpa
·
s、500mpa
·
s、600mpa
·
s、700mpa
·
s、800mpa
·
s、900mpa
·
s、1,000mpa
·
s、1,250mpa
·
s、1,500mpa
·
s、1,750mpa
·
s、2,000mpa
·
s、2,250mpa
·
s、2,500mpa
·
s、2,750mpa
·
s、3,000mpa
·
s、3,250mpa
·
s、3,500mpa
·
s、3,750mpa
·
s、4,000mpa
·
s、4,250mpa
·
s、4,500mpa
·
s或4,750mpa
·
s的粘度。在一些实施方案中，可调节鞘流体的粘度，以使其与一种或多种输入材料的粘度匹配。
145.在一些实施方案中，鞘流体包含化学交联剂。在一些实施方案中，化学交联剂包含二价阳离子。二价阳离子的非限制性示例包括cd
2+
、ba
2+
、cu
2+
、ca
2+
、ni
2+
、co
2+
或mn
2+
。在优选的实施方案中，ca
2+
用作二价阳离子。在一些实施方案中，鞘流体中的二价阳离子的浓度范围为约80mm至约140mm，诸如约90mm、100mm、110mm、120mm或130mm。
146.使用方法：
147.本发明的各方面包括打印线性纤维结构、包括一个或多个纤维结构的平面结构或者包括两个或更多个平面结构层的三维(3d)结构的方法。在一些实施方案中，一种方法首先包括提供针对待打印平面或3d结构的设计。可使用可商购获得的cad软件来形成该设计。在一些实施方案中，该设计包括关于特定材料的信息(例如，对于包括多种材料的异质结构)，该信息将被分配给待打印结构中的特定位置。
148.在一些实施方案中，一种方法包括使用3d打印机，该3d打印机包括：打印头；接收表面，该接收表面用于接收由打印头分配的材料；以及定位单元，该定位单元可操作地联接到接收表面，该定位单元用于在三维空间中在接收表面上方的位置处定位打印头。例如，本文所提供的打印系统的各种实施方案可用于打印平面或3d结构的方法中。
149.该方法的各方面包括提供将由打印头分配的一种或多种输入材料。在一些实施方案中，一种或多种细胞类型与输入材料相容并且任选地分配在输入材料内。在一些实施方案中，鞘流体用作润滑剂，以润滑输入材料在打印头内的移动。在一些实施方案中，鞘流体包含交联剂，以用于在从打印头分配水凝胶之前或时固化水凝胶的至少一部分。
150.该方法的各方面包括将设计传达给3d打印机。在一些实施方案中，可例如通过可
编程控制处理器来实现通信。在一些实施方案中，该方法包括：控制打印头和接收表面在三维空间中的相对定位；以及同时单独地或组合地从打印头分配鞘流体和输入材料。在一些实施方案中，同轴地分配从打印头分配的材料，使得鞘流体包封输入材料。这种同轴布置允许鞘流体中的交联剂固化输入材料，从而产生固化的从打印头分配的纤维结构。
151.在一些实施方案中，一种方法包括：将分配的纤维结构的第一层沉积在接收表面上，该第一层包括由设计指定的纤维结构的布置，迭代地重复沉积步骤；将后续纤维结构沉积到第一和后续层上，从而以设计指定的几何布置逐层沉积分配的纤维结构层，以产生3d结构。
152.在一些实施方案中，多种输入材料(例如，多种水凝胶，其中的至少一些包含一种或多种细胞类型)以受控的序列沉积，从而允许以设计指定的几何布置沉积输入材料和细胞类型的受控布置。
153.在一些实施方案中，一种方法包括从接收表面以及任选地从分配的纤维结构的表面移除过量流体。例如，可在整个打印过程中连续进行移除过量流体的步骤，从而移除过量流体，否则这些过量流体可能会干扰由该设计提供的几何布置中所分配的纤维结构的分层。替代地，可在整个打印过程中与一个或多个沉积步骤顺序地或同时地间歇进行移除过量流体的步骤。在一些实施方案中，通过从接收表面上吸出流体并且任选地从分配的纤维结构的表面上吸出流体来实现过量流体的移除。在一些实施方案中，通过穿过接收表面吸出过量流体来实现过量流体的移除，该接收表面包括尺寸被设定成允许流体通过的孔。在一些实施方案中，通过提供在从分配孔口分配后蒸发的流体来实现过量流体的移除。
154.本发明的各方面包括制造包括一种或多种输入材料的3d结构的方法。该3d结构可用于修复和/或替换受试者受损或病变组织的至少一部分。
155.如上所述，任何合适的二价阳离子可与本发明的方法结合使用以固化可化学交联的输入材料，包括但不限于cd
2+
、ba
2+
、cu
2+
、ca
2+
、ni
2+
、co
2+
或mn
2+
。在优选的实施方案中，ca
2+
用作二价阳离子。在一个优选的实施方案中，使可化学交联的输入材料与包含ca
2+
的溶液接触以形成固化的纤维结构。在一些实施方案中，鞘流体中ca
2+
的浓度范围为约80mm至约140mm，诸如约90mm、100mm、110mm、120mm或130mm。
156.在某些实施方案中，输入材料在小于约5秒，诸如小于约4秒、小于约3秒、小于约2秒或小于约1秒的时间内固化。
157.本发明的各方面包括使用软件工具以图案化的方式沉积一种或多种输入材料以形成固化结构层的方法，该固化结构层形成为多层3d组织结构。在一些实施方案中，多层3d组织结构包括多个哺乳动物细胞。有利地，通过调节本发明的输入材料的组分(例如，哺乳动物细胞类型、细胞密度、基质组分、活性剂)，可使用本发明的方法形成多层3d组织结构，其中多层3d组织结构在三维空间中的任何特定位置都具有精确控制的组分。这样，本发明的方法便于复杂的三维组织结构的制造。
158.在一些实施方案中，该方法包括同时通过芯通道分配缓冲溶液和/或鞘流体，通过一个或多个壳通道分配一种或多种输入材料，以及通过鞘流通道分配鞘流体以在打印的纤维中形成中空芯。
159.在一些实施方案中，芯通道中的不可交联材料包括缓冲溶液，并且鞘流通道中的鞘流体包括化学交联剂，并且在鞘流体交汇处发生接触以固化分配通道中的可交联材料的
料流的外表面。
160.在一些实施方案中，芯通道中的不可交联材料包括化学交联剂，并且鞘流通道中的鞘流体包括水性溶剂，并且在第一流体聚集交汇处发生接触以固化分配通道中的可交联材料的料流的内表面。
161.在一些实施方案中，芯通道中的不可交联材料包括化学交联剂，并且鞘流通道中的鞘流体包括化学交联剂，并在第一流体聚集交汇处且发生接触以固化可交联材料的料流的内表面，并且在鞘流体交汇处发生接触以固化分配通道中的可交联材料的料流的外表面。
162.在替代实施方案中，可分别在芯通道和壳通道中使用相同或不同的可交联材料来制造实心芯
‑
壳纤维。在前一实施方案中，交联剂可借助于扩散来交联芯材料，诸如藻酸盐水凝胶被ca
2+
交联，或者替代地可在光的存在下交联。在后一实施方案中，芯通道包含可交联材料，该可交联材料可在从打印头分配后的一段时间内固化(例如，胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维蛋白原、壳聚糖、弹性蛋白、基质凝胶、甲基丙烯酸酯化明胶、peg二丙烯酸酯等)，而壳通道包含不同的可交联材料，该材料在打印时固化(经由化学或光)。
163.在一个示例性实施方案中，可采用不同浓度的相同的可交联材料(例如，藻酸盐)，其中在壳通道中存在较高的浓度而在芯通道中存在较低的浓度，并且在鞘流通道中使用相同的交联剂(例如，ca
2+
)用于交联这两个层。在该实施方案中，ca
2+
离子将在交联可交联芯材料之前首先扩散通过可交联壳材料。
164.在另一示例性实施方案中，可在壳通道中使用化学可交联材料(例如，藻酸盐)，并且可在芯通道中使用通过热量交联的另一种材料(例如，胶原蛋白)，并且鞘流通道中的化学交联剂将允许打印带有液体芯的实心纤维，然后可将其转移到培养箱或其他热源中，以随后进行芯材料的交联。
165.实用性：
166.在一些实施方案中，使用本文所提供的系统和方法生成的结构可用于药物发现领域，在该领域，例如，确定对各种化合物和组合物的细胞反应是令人感兴趣的。使用本文所提供的系统和方法的实施方案制造的平面和3d细胞培养物的使用可提供相对于传统2d细胞培养物更高度类似于体内细胞和组织条件的实验条件。细胞的3d排列可更密切地模拟体内细胞间相互作用和对外部刺激的反应，并且可使用本文所提供的系统和方法生成的3d结构的异质性允许对组织和潜在器官的研究。使用本文所提供的系统和方法的实施方案制造的载满细胞的3d结构预期可通过提供测试化妆品的替代手段而为化妆品工业提供类似的益处。
167.在一些实施方案中，本文所提供的系统和方法的各个方面与标准孔板技术相容。在本文所提供的方法和系统中，孔板或孔板插入物可与打印床一起使用或用作打印床的一部分。因此，本文所提供的系统和方法的各种实施方案与利用孔板的仪器和实践相容，从而允许它们轻松地集成到现有的工艺料流中。
168.在一些实施方案中，本发明的打印头内的一个或多个流体通道与其他微流体模块相容。例如，已知的微流体模块可在分配孔口的上游包括在本文所提供的系统的打印头中。此类模块可包括例如细胞计数模块、细胞分选模块、细胞分析模块和/或浓度梯度生成模块。
169.在一些实施方案中，可通过向系统中并行添加附加的打印头来增加3d打印的吞吐量。每个打印头都包含打印多材料结构所需的所有元素，因此通过在系统中包括附加打印头，可同时打印多个3d结构。
170.本文所涉及的所有专利和专利出版物均据此全文以引用方式并入。
171.尽管出于清晰理解的目的，上述发明详细地经由图示和示例予以描述，但本领域普通技术人员鉴于本发明的教示显而易知可在不背离所附权利要求书的精神或范围的情况下作出某些变化和修改。
172.lop
tm
支持多材料切换，因此可在连续打印的同时沿着通道的长度修改血管壁的组成(细胞类型和生物材料组成)。这样的一个示例是再现肾小管的生物结构和功能，近侧端部处的壁组成将不同于远侧端部处的壁组成。或者在可灌注的打印3d肝组织中，其中血管壁可在血管的较大开口端处衬有低渗透性的肝门小动脉内皮细胞，并且在血管中进一步衬有更易渗透的窦内皮细胞，其中通道更窄以对窦状隙建模。与肝组织相似，期望研究灌注通道的内容物与一个或多个外壳中通道外部的不同基质细胞类型之间的相互作用。这可用于生成毒性的多组织模型，并结合剪切流的影响。可打印单个组织，其中沿着其长度切换纤维的壳的细胞内容物，以生成经编码的中空纤维，该中空纤维具有与不同器官类型相对应的不同区域。对于非基于微注射器的系统，无法实现壳内容物的这种切换
173.因此，以上仅仅说明本发明的原理。应了解，本领域的技术人员将能够设想各种安排，虽然这些安排未在本文中明确地描述或展示，但是它们体现了本发明的原理并且包括在其精神和范围内。此外，本文所引用的所有示例和条件语言主要意图帮助读者理解本发明的原理和由发明人提供的促进技术的构想，并且应解释为不对此类特别引用的示例和条件构成限制。此外，本文中引述本发明的原理和方面以及其特定示例的所有陈述均意图涵盖其结构等效物和功能等效物。此外，希望此类等效物包括目前已知的等效物和未来待开发的等效物，即不管结构如何，所开发的执行相同功能的任何元件。因此，本发明的范围不意图限于本文所示和所述的示例性方面。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求体现。