一种甘油三酯生物传感器、纳米金导电复合材料及其制备方法与流程

本发明属于新型功能材料与生物传感检测，尤其是涉及到一种甘油三酯生物传感器、纳米金导电复合材料及其制备方法。

背景技术：

1、甘油三酯（tg）是由一个甘油和三个脂肪酸分子组成的酯，主要来源于膳食脂肪，在能量和转运体的代谢中起着重要作用。甘油三酯和胆固醇体内含量偏高极易导致动脉粥样硬化、高血压和冠状动脉等一系列的心血管疾病。因此，检测甘油三酯及其代谢对了解代谢性疾病的机制具有重要意义。传统检测脂质代谢的方法，如染色法、比色法或荧光法以及质谱法都已经得到应用，但每种方法都有其局限性。这些方法或需要昂贵的仪器或复杂的样品预处理，不广泛使用，不适合用于即时检测。生物传感器由于成本相对较低、易于使用和良好的选择性，是很有前途的测定甘油三酯的方法。

2、甘油三酯生物传感器的原理是通过脂肪酶（lp）与甘油三酯发生水解反应形成脂肪酸和甘油，甘油在甘油激酶（gk）和甘油-3-磷酸氧化酶（gpo）的作用下发生氧化还原反应转化为磷酸二羟基丙酮，反应中产生的电信号与对应的甘油三酯浓度呈现一定的线性相关关系，最终由检测系统算法将浓度信号转化为电信号，从而实现对甘油三酯的定量测定。

3、目前基于不同电极材料和酶固定化方法的各种类型的生物传感器已被证明用于测定甘油三酯。

4、如图4所示，甘油三酯生物传感器主要包含：基板、工作电极、参比电极、滴酶区、上盖片、进样口。所述工作电极和参比电极用于分别测量电流值；还包括位于基板一端的滴酶区，其中工作电极和参比电极并列设置且都穿过滴酶区，滴酶区和进样口连接，配置有上盖片用于覆盖靠近滴酶区的电极和滴酶区。使用所述甘油三酯生物传感器时，首先将样品滴在进样口上，进入生物传感器；生物传感器插入电化学工作中进行测试。

5、中国发明专利申请cn 108344788 a公开了一种基于金纳米笼的电化学生物传感器的制备方法制备，此方法制备的传感器虽然表现出可用的检测性能，但它们仍存在线性范围窄、检测限低（浓度仅能从100-300mg/dl）、热稳定性差、不适用于商品化应用等缺点。

技术实现思路

1、本发明的目的之一是提供一种甘油三酯生物传感器及其制备方法，以提高生物传感器的检测限和灵敏度。

2、为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

3、一种甘油三酯生物传感器的制备方法，包括如下步骤：

4、步骤（1）：将纳米金导电复合材料喷墨打印沉积在甘油三酯生物传感器的滴酶区上，之后干燥1h~5h；其中打印层数为2-10层；

5、步骤（2）：将干燥之后的甘油三酯生物传感器放置在含有交联剂的气氛中，而后室温干燥10min~60min；

6、步骤（3）：将酶涂料印刷在滴酶区上，干燥5min~30min后，依次贴上亲水膜和双面胶，得到甘油三酯生物传感器；

7、在每克质量的酶保护剂浆料加入2ku~10ku的脂肪酶、0.1ku~3ku的甘油激酶、0.1ku~3ku的磷酸甘油氧化酶、10mg~300mg的电子介体，得到酶涂料；

8、每份质量的酶保护剂浆料包括：1-5份ph为6~8的缓冲液溶液，1-3份镁盐、0.01-1份atp或atp二钠、1-10份高分子填充剂、1-10份成膜剂、1-5份血红素，66-95份去离子水；

9、所述纳米金导电复合材料的制备方法，包括以下步骤：

10、s1、按重量份数，将1-5份稳定剂、5-20份苯乙烯混合，在偶氮二异丁腈的作用下发生水浴反应；后加入0.1-5份含不饱和键磺酸盐共聚，得到的产物离心洗涤后干燥，得到聚苯乙烯-聚磺酸钠微球；

11、s2、将1-5份3,4-乙烯二氧噻吩、0.1-2份聚苯乙烯-聚磺酸钠微球、1-10份haucl4·3h2o和0.01-1份硼氢化钠混合，充分反应，得到纳米金导电复合材料。

12、优选的，步骤（1）中所述的喷墨打印的层数为2-6层，干燥的温度在20℃~30℃之间，干燥时间在1~3h。

13、干燥程度过大、干燥温度过大，会引起纳米材料的氧化，因此需要对干燥的时间和温度予以控制。

14、优选的，所述的交联剂为戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯中的一种或多种，交联时间为5min~40min。

15、进一步优选为戊二醛，所述戊二醛的分子量比较小，容易形成气氛。且其分子结构中的醛基能更好固定酶，以及酶中的血红素。

16、优选的，所述缓冲液为tris-hcl、pipes、mops、acse体系中的任意一种或几种。

17、优选的，所述镁盐为天冬氨酸镁、甘氨酸镁、氯化镁中的任意一种或几种。

18、所述镁盐进一步优选为天冬氨酸镁或甘氨酸镁，多肽类的物质对酶起到一定的保护作用。

19、优选的，所述高分子填充剂为羟甲基纤维素、羟乙基纤维素、黄原胶中的任意一种或几种。

20、所述高分子填充剂进一步优选为黄原胶，黄原胶的粘度比较大，能对纳米材料起到保护作用。

21、优选的，所述成膜剂为聚乙烯基吡咯烷酮、三甲基硅氧基硅酸酯、丙烯酸树脂与二甲基硅氧烷共聚物。

22、优选的，所述电子介体为铁氰化钾、三氯六氨合钌、二茂铁中的任意一种或几种。

23、本发明的目的之二是要求保护上述制备方法制备的甘油三酯生物传感器。

24、本发明的目的之三是要求保护一种纳米金导电复合材料及其制备方法。

25、所述纳米金导电复合材料的制备方法，包括以下步骤：

26、s1、按重量份数，将1-5份稳定剂、5-20份苯乙烯混合，在偶氮二异丁腈的作用下发生水浴反应；后加入0.1-5份含不饱和键磺酸盐共聚，得到的产物离心洗涤后干燥，得到聚苯乙烯-聚磺酸钠微球；

27、s2、将1-5份3,4-乙烯二氧噻吩、0.1-2份聚苯乙烯-聚磺酸钠微球、1-10份haucl4·3h2o和0.01-1份硼氢化钠混合，充分反应，得到纳米金导电复合材料。

28、本发明首先采用分散聚合法首先通过偶氮二异丁腈引发苯乙烯发生聚合反应形成均一稳定的聚苯乙烯微球（ps），而后在引发剂的作用下使微球表面磺基化从而使聚苯乙烯微球富含离子电荷，增加微球的导电性。

29、然后3,4-乙烯二氧噻吩（edot）本身在含不饱和键磺酸盐的作用下可以具有一定的还原性且自发聚合形成聚噻吩（pedot），本发明引入聚苯乙烯-聚磺酸钠微球，通过微球的大比表面积同时具有带磺酸基团的增加聚合物材料的导电性，利用硼氢化钠还原haucl4·3h2o可以快速使被还原的纳米金颗粒吸附在ps-pss微球上，经搅拌反应后，edot发生聚合包被在聚苯乙烯-聚磺酸钠微球表面，强化au/聚苯乙烯-聚磺酸钠微球的稳定性，形成稳定的导电au/pedot-ps-pss纳米导电复合材料。

30、优选的，所述稳定剂和苯乙烯在有机溶剂中反应。

31、优选的，所述有机溶剂为乙醇、甲醇、乙醚、丙酮中的一种或几种。

32、在本发明中，有机溶剂的体系才能使得制备得到的是纳米级粒径的微球，水体系中反应也能进行，但反应得到的分子团聚更多，只能形成微米和毫米级的较大分子的聚合物。

33、优选的，所述稳定剂为聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、海藻酸钠。

34、所述1-5份稳定剂在制备得到的均一稳定的纳米微球中起到非常重要的作用，稳定剂的重量份数过少，就会形成微米和毫米级的较大分子的聚合物，稳定剂的重量份数过多，产物的杂质过多，纯度不够，提纯复杂。

35、优选的，所述含不饱和键磺酸盐为聚乙烯磺酸钠。

36、优选的，所述水浴反应中还加入0.05-5份引发剂。

37、优选的，所述引发剂为偶氮二异丁腈、

38、优选的，所述水浴反应的温度在50℃~80℃，反应时间在3h~6h。

39、优选的，所述磺酸盐共聚过程需要加入0.1-1份2号引发剂。

40、优选的，所述2号引发剂为过硫酸钾。

41、优选的，所述干燥的温度在30℃~60℃，干燥至恒重。

42、优选的，所述离心洗涤的洗涤剂为超纯水、乙醇、甲醇、乙醚、丙酮中的任意一种或几种。

43、优选的，所述1-5份3,4-乙烯二氧噻吩、0.1-2份聚苯乙烯-聚磺酸钠微球还可以和1-11份金属还原剂反应，制备得到金属/pedot-ps-pss纳米复合材料。

44、优选的，所述金属还原剂为纳米镁粉或纳米铜粉。

45、本发明还要求保护上述制备方法制备的纳米金导电复合材料。

46、本发明的目的之四是要求保护上述制备方法制备的纳米金导电复合材料在制备葡萄糖生物传感器、尿酸生物传感器、血酮生物传感器中的应用。

47、下面对本发明做进一步的解释：

48、本发明在传感器中加入au/pedot-ps-pss导电纳米金复合材料后，使得氧化还原反应的电子转移速率加快，有利于反应的快速发生，因此传感器的灵敏度大大提高。同时通过ps形成微纳米球在ps的基础上掺杂了pss，形成了ps-pss带电荷的纳米微球，大大增加了比表面积，使之可以吸附更多的纳米金材料，而后在纳米金ps-pss导电微球表面形成pedot导电聚合物包被层，进一步强化入au/pedot-ps-pss导电纳米金复合材料的稳定性，同时又可以利用pedot导电的特性提高材料的电催化性能。

49、而在酶保护剂浆料中加入了血红素，灵敏度得到进一步提升，这是由于血红素可以与氧分子结合，与氧结合之后的珠蛋白结构发生变化，这种变化使得第二个氧分子相比于第一个氧分子更容易寻找血红素结合，而它的结合会进一步促进第三个氧分子的结合，以此类推，形成协同效应促进了氧化还原反应的电子转移。因此，灵敏度有较大的改善。

50、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

51、（1）本发明通过分散聚合法制备聚苯乙烯-聚苯乙烯磺酸微球，利用微球的大比表面积的特性在微球上利用edot和硼氢化钠还原氯金酸使纳米金沉积在微球表面制备au/pedot-ps-pss纳米复合材料。通过将纳米复合材料喷墨打印在电极上，接着在电极滴酶区形成交联层用于固定酶，然后印刷酶层。制备的传感器在0.63mmol/l~6.13mmol/l的范围内线性度为0.9946，平均灵敏度达到3952na/mm，在连续25天的60℃中的老化传感器电流与常温电流偏差在±5%范围内，具有较好的线性度和检测限、较高的灵敏度以及良好的热稳定性。

52、（2）本发明通过在酶涂料中添加血红素，利用血红素铁卟啉化合物的特性，具有4个吡咯基的配位螯合物，充当磷酸甘油氧化酶的辅基，既可以与氧结合促进电子传递又可以作为蛋白类的酶保护剂，提高传感器的热稳定性。