一种3D生物打印制备具有仿生微环境NAFLD模型的方法及NAFLD模型与流程

本发明属于生物制造，涉及一种3d生物打印制备具有仿生微环境nafld模型的方法及nafld模型。

背景技术：

1、疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(nash)及其相关的肝硬化和肝细胞癌，其中nash已成为肝衰竭和肝移植的重要原因。但目前尚无一款nash特效药获得批准上市，缺乏仿生体外模型是相关领域研究滞缓的重要原因。现有nafld体外模型多2d培养单细胞模型，少数3d培养组织中细胞种子与体内真实情况相差较大，且未考虑机械力等物理微环境和细胞化学微环境，使得体外药物筛选和机制研究与最终实际情况存在出入。

2、具有nafld病理生理特征的仿生体外模型成为亟待解决的应用需求。利用3d生物打印构建肝脏相关体外模型是当前肝脏体外模型构建的重点之一，有望利用3d生物打印制备具有仿生微环境nafld模型。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术关于nafld模型的不足，提供一种3d生物打印制备nafld模型的方法，该nafld模型具有仿生细胞种子细胞、化学微环境和力学等物理微环境，为体外药物筛选和基础研究提供更接近人体的平台。

2、本发明的一个目的通过以下技术方案来实现：

3、一种3d生物打印制备具有仿生微环境nafld模型的方法，包括以下步骤：

4、将生物墨水注入打印机中，待生物墨水变成胶状后，利用3d生物打印机打印模型，然后进行光交联，得到肝脏生物模型，加入诱导剂进行诱导处理，得到nafld模型；

5、所述生物墨水包括：甲基丙烯酰化明胶(gelma)、肝脏脱细胞外基质、引发剂和混合细胞，所述混合细胞包括：人转分化肝样细胞(human induced hepatocyte-like cell，hihep)、人肝星形细胞(lx-2)、人脐静脉内皮细胞(huvec)和人单核细胞白血病(thp-1)细胞。

6、优选地，将生物墨水注入打印机中，随即放入0～10℃环境5～50min，生物墨水变成胶状。

7、本发明在生物墨水中加入hihep、lx-2、huvec和thp-1形成细胞微环境，有利于诱导生成nafld模型，尤其加入hihep，是制备仿生nafld模型的关键所在。

8、优选地，所述引发剂为光引发剂。进一步优选，所述引发剂为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(lap)。

9、优选地，所述生物墨水中，甲基丙烯酰化明胶的含量为7～12wt％，肝脏脱细胞外基质的含量为0.8～1.5wt％，引发剂的含量为0.125～0.5wt％，混合细胞的浓度为3×106～8×106个细胞/ml。

10、优选地，人转分化肝样细胞、人肝星形细胞、人脐静脉内皮细胞、人单核细胞白血病细胞的数量比为(6～8)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：1。

11、优选地，所述生物墨水的制备方法包括以下步骤：将甲基丙烯酰化明胶溶液、肝脏脱细胞外基质母液混合，之后加入引发剂溶液和混合细胞悬浮液，混合均匀后，得到生物墨水。

12、优选地，所述混合在35～38℃下进行。

13、优选地，上述生物墨水的制备方法中，甲基丙烯酰化明胶溶液的浓度为15～30wt％，肝脏脱细胞外基质母液的浓度为10～30wt％，引发剂溶液的浓度为1～2wt％。

14、将人转分化肝样细胞、人肝星形细胞、人脐静脉内皮细胞、人单核细胞白血病细胞分别进行细胞培养，然后混合制成混合细胞悬浮液。人单核细胞白血病细胞在细胞培养后混合前，加入佛波酯(pma)诱导12～36h，将细胞由悬浮状态转变为贴壁状态。

15、四种细胞的细胞培养的方法和培养基不做特别限制，本领域技术人员了解的培养方法和培养基都是可用的。

16、优选地，3d生物打印机的打印平台温度为5～10℃，3d生物打印机的打印环境温度为10～18℃。

17、优选地，打印后进行光交联10～60s，进一步优选为20～50s；优选为蓝光交联，蓝光的波长可以为460～480nm。

18、优选地，经光交联后，肝脏生物模型的硬度为2～20kpa，进一步优选为7～15kpa。

19、优选地，所述诱导剂包括油酸、棕榈酸、转化生长因子β(tgf-β)和脂多糖(lps)。

20、优选地，所述诱导剂中，油酸的浓度为200～400μmol/l，棕榈酸的浓度为150～250μmol/l，tgf-β的浓度为0.5-2ng/ml和lps的浓度为0.5-1μg/ml。

21、优选地，所述诱导剂以肝组织培养基为基础溶液，另添加油酸、棕榈酸、tgf-β和lps。肝组织培养基的成分不作特别限定，任意能用于体外培养肝组织的培养基均在本发明的保护范围内。

22、优选地，加入诱导剂进行诱导处理5～7天。

23、本发明的另一个目的通过以下技术方案来实现：

24、一种具有仿生微环境nafld模型，其由上述方法制备而得。

25、仿生微环境包括细胞、化学和物理微环境。

26、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

27、1、3d生物打印模型具有良好的细胞种子，包括来源于人的诱导肝细胞和nafld形成必不可少的多种间质细胞，能更好模拟了nafld细胞特征；

28、2、优化的诱导方案充分模拟了nafld发生发展过程中存在的炎症和肠道菌群等化学因素，经过优化后的诱导方案诱导得到的模型更接近体内情况；

29、3、利用3d生物打印创建了符合nafld患者基质硬度的特征，模拟了病理物理微环境，更好的促进了nafld形成；

30、4、本发明利用3d生物打印以及诱导方案成功制备了具有仿生微环境nafld模型。

技术特征：

1.一种3d生物打印制备具有仿生微环境nafld模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述引发剂为苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物墨水中，甲基丙烯酰化明胶的含量为7～12wt％，肝脏脱细胞外基质的含量为0.8～1.5wt％，引发剂的含量为0.125～0.5wt％，混合细胞的浓度为3×106～8×106个细胞/ml。

4.根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于，人转分化肝样细胞、人肝星形细胞、人脐静脉内皮细胞、人单核细胞白血病细胞的数量比为(6～8)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：1。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物墨水的制备方法包括以下步骤：将甲基丙烯酰化明胶溶液、肝脏脱细胞外基质母液混合，之后加入引发剂溶液和混合细胞悬浮液，混合均匀后，得到生物墨水。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，3d生物打印机的打印平台温度为5～10℃，3d生物打印机的打印环境温度为10～18℃；

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导剂包括油酸、棕榈酸、转化生长因子β和脂多糖。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述诱导剂中，油酸的浓度为200～400μmol/l，棕榈酸的浓度为150～250μmol/l，转化生长因子β的浓度为0.5-2ng/ml和lps的浓度为0.5-1μg/ml。

9.根据权利要求1或7或8所述的方法，其特征在于，加入诱导剂进行诱导处理5～7天。

10.一种具有仿生微环境nafld模型，其特征在于，其由权利要求1所述的方法制备而得。

技术总结
本发明属于生物制造技术领域，涉及一种3D生物打印制备具有仿生微环境NAFLD模型的方法及NAFLD模型。所述方法包括以下步骤：将生物墨水注入打印机中，待生物墨水变成胶状后，利用3D生物打印机打印模型，然后进行光交联，得到肝脏生物模型，加入诱导剂进行诱导处理，得到NAFLD模型；所述生物墨水包括：甲基丙烯酰化明胶、肝脏脱细胞外基质、引发剂和混合细胞，所述混合细胞包括：人转分化肝样细胞、人肝星形细胞、人脐静脉内皮细胞和人单核细胞白血病细胞。本发明利用3D生物打印以及诱导方案成功制备了具有仿生微环境NAFLD模型。

技术研发人员：毛一雷,杨华瑜,王亚南,孙乐家
受保护的技术使用者：宁波长都生物科技有限责任公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/6