专利名称：具有好氧反硝化性能的睾丸酮丛毛单胞菌及其处理废水的方法
技术领域：
本发明涉及一种采用睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)WXZ-18 CGMCC No.1800菌株在好氧条件下进行生物脱氮处理废水的方法。该菌株对溶解氧的耐受程度强，在10～98％饱和溶解氧条件下，能利用硝酸盐和亚硝酸盐作为电子受体。污水中的硝酸盐和亚硝酸盐可以在好氧环境下被还原为气体产物而使废水脱氮。
背景技术：
在目前已应用的多种脱氮方法中，生物脱氮仍然是废水脱氮处理中的主要手段。传统的废水生物脱氮处理工艺是污水中的有机氮化合物在生化过程中首先转化为氨氮，氨氮在硝化过程中由自养硝化菌将其转化为硝酸盐和亚硝酸盐；在反硝化过程中再由异养反硝化菌将硝酸盐和亚硝酸盐还原转化为气体产物而使废水脱氮。硝化是反硝化过程的前提，但反硝化过程真正达到废水中的含氮化合物脱除的目的。由于硝化菌有强烈的好氧性，硝化过程必须是好氧的；而传统反硝化菌在有氧条件下即以氧作为电子受体，进行有氧呼吸，只有无氧状态时才以硝酸盐或亚硝酸盐作为电子受体，获取合成细胞体的能量，因此传统反硝化菌仅能在缺氧环境下才能进行反硝化。根据传统生物脱氮理论而发展起来的生物脱氮工艺通常将硝化和反硝化分别在好氧区与缺氧或无氧区进行，形成分级硝化反硝化工艺，因而必须分别建造硝化池和反硝池，这样就使得分级式硝化反硝化工艺存在很多不足之处，诸如由于分别建造硝化池和反硝化池，使得建造工艺流程较长、基建投资高，需要向反硝化池补充碳源等。
发明专利“一种好氧生物脱氮方法”，ZL 2003 1 0121374 0，该专利是一种涉及对污水中的含氮化合物通过活性污泥中的微生物在同一反应器内同时进行好氧硝化反硝化的脱氮处理的发明专利，但该专利未涉及活性污泥中微生物的种类；发明专利“一种降解对氯代硝基苯的睾丸酮丛毛单胞菌及其用途”，公开号CN 1616650A，该专利涉及睾丸酮丛毛单胞菌CNB1CGMCC No.1028菌株，该菌株能以对氯代硝基苯为唯一碳源、氮源和能源生长，将对氯代硝基苯完全降解利用，但该专利所指对氯代硝基苯降解并非对一般废水中含氮化合物的降解，因此该专利指出仅适用于生产对氯代硝基苯的工业废水生物处理和对氯代硝基苯污染土壤的生物修复。目前国内外的许多研究报道都已证实，好氧反硝化作用是常规存在的而不是偶然的。事实上，从运河、池塘、土壤和活性污泥中分离出好氧反硝化菌是很有可能的。这些分离出来的菌种属于Proteobacteria门α，β，γ纲的不同的菌属(如Paracoccus，Thiobacillus，Enterobacter，Comamonas，Sphingomonas等)。此外，Lukow从垃圾渗滤液的硝化工段中分离出一株菌TL1，该菌可以同时利用降解氧和硝酸盐，经鉴定该菌属于Zoogloea。Naokia筛得两株反硝化菌，分别为Pseudomonas stutzeri TR2和Pseudomonas sp.K50。H.K.Huang从硝化反硝化污泥中分离出好氧反硝化菌Citrobacter diversus。国内张光亚从土壤中分离出一株好氧反硝化菌HN，经鉴定为Rhodococcus sp.，于爱茸从池塘中分离出一株耐氧反硝化，经鉴定属于Bacillus。
发明内容
本专利涉及的睾丸酮丛毛单胞菌WXZ-18 CGMCC No.1800菌株能在仅以硝酸盐为氮源和能源的条件下生长。该菌株对溶解氧的耐受程度强，在10～98％饱和溶解氧条件下，均能以显著的速度还原硝酸盐和亚硝酸盐，使反硝化能在好氧条件下进行，是一株新发现的好氧反硝化菌。该菌株在有氧条件下进行反硝化作用的特性，可以将其接种于常规好氧硝化污泥中，即可实现含氮废水的同步硝化反硝化作用，可以解决传统废水处理中生物脱氮需要采取缺氧反硝化、好氧硝化分段处理的问题。前面已经介绍废水中氨氮经硝化过程均转变为硝酸盐或亚硝酸盐，因此本发明适用于各种含氮废水的脱氮处理。
本发明的目的在于筛选具有天然生长优势的高效好氧反硝化菌株，并进行菌株测序鉴别比对。将筛选得到的菌株，接种于含不同浓度硝酸盐的废水中，并通过不同反应条件试验(溶解氧，碳氮比，pH值等)，证实菌株有较广泛的适应性。菌株的脱氮能力受碳氮比的影响最大，且碳氮比越高，菌株的脱氮能力越强，因而虽然本发明在碳氮比2～10条件下进行实验，在碳氮比为2～30时，菌株仍然有较强的脱氮能力。对溶解氧的耐受程度强，在10～98％饱和溶解氧条件下，在硝基氮浓度25～250mg/L，碳氮比为2～30，pH5.0～8.0的条件下均能进行有效的好氧脱氮作用。具体地讲，本发明涉及一株睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)WXZ-18 CGMCC No.1800，该菌株的生长细胞、细胞悬浮液菌能以硝酸盐为唯一氮源和能源生长，可在好氧条件下还原硝酸盐为亚硝酸盐，并能够继续在好氧条件下还原亚硝酸盐为气体产物，使废水中氮化合物降低，达到脱氮的目的。
本发明提供的睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)WXZ-18 CGMCC No.1800，于2006年9月7日，在北京保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No.1800。
该菌株具有以下特征(1)菌落特征在BTB平板上培养2～3天后，菌落大小为1～2mm，菌落成圆形，光泽度差，白色，无突起。(2)细胞形态特征适宜于pH中性左右，常温下培养，细胞为杆状，革兰氏染色阴性。(3)睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)WXZ-18 CGMCC No.1800的16SrRNA基因序列特征其16SrRNA具有序列表所示的核苷酸序列，序列长度为1419bp，在Genbank中的登录号为DQ356898。
参照《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)的内容，根据其形态特征和生理生化特征，以及根据其16SrRNA基因序列在Genbank中的检索结果，鉴定该菌株(CGMCC No.1800)为睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)。
该菌株接种于含不同浓度硝酸盐的废水中，选择不同条件如溶解氧，碳氮比，pH值等反硝化条件进行优选，并测定其最大反硝化能力。实验结果表明，该菌株在碳氮比＝2～10，以氮元素含量表示的硝酸盐废水浓度在50～200mg/L，反应转速60～160rpm，相当于溶解氧浓度1.8～7.2mg/L(24～95％饱和溶解氧)，pH＝6.5～7.5的实验范围内，其硝基氮最大去除速率可达到43.2mg NO3--N/L·d，最大4天硝基氮还原率达到56.3％，最大4天总氮去除率达到52.0％；最佳反硝化条件为C/N＝10，NO3--N＝100.9mg/L，160r/min，相当于溶解氧浓度6.0～7.2mg/L(79～95％饱和溶解氧)，pH＝7.5。本发明提供的Comamonas testosteroniWXZ-18 CGMCC No.1800菌株能在硝酸盐废水中生长，在好氧条件下降解利用硝酸盐，并进行反硝化脱氮作用；也可以在如牛肉蛋白胨、营养琼脂等以营养培养基为碳源、氮源中生长。
附图1 Comamonas testosteroni CGMCC No.1800所选四个因素各个水平-硝基氮去除率附图2 Comamonas testosteroni CGMCC No.1800在最优条件下硝酸盐的降解曲线具体实施实例为了更好地理解本发明，通过以下实施实例予以进一步说明，但并非对本发明的限定。
实施例1Comamonas testosteroni CGMCC No.1800菌株好氧反硝化性能的测定方法为了防止模拟废水中带入杂菌，硝酸盐模拟废水I和硝酸盐模拟废水II均在高温灭菌锅0.1MPa中灭活20min。取5ml灭菌后的硝酸盐模拟废水I装入试管中，接入以液体石蜡封保存的纯Comamonas testosteroni CGMCC No.1800菌株样品。将试管置于气浴恒温摇床，恒温保持30℃，摇床转速160r/min进行菌株活化。活化12小时后，以10％的接种量接种到装有200ml硝酸盐模拟废水II的250ml锥形瓶中进行反硝化、脱氮性能测定。为保证锥形瓶中空气与外界气体的交换，以封口膜封口，同样地在30℃、气浴恒温摇床上以160r/min进行摇瓶培养。对于250ml锥形瓶中加入废水200ml的160r/min转速试验，实测反应液溶解氧能够保持在6～7.2mg/L，相当于79～95％的饱和溶解氧。同样条件下，空白废水样品(未接菌株的硝酸盐模拟废水II)作为对比基准试验。
除了初始状态之外，每隔24h用装有0.2μm混合纤维膜的针式过滤器过滤抽取锥形瓶中废水样品5ml，采用离子色谱法测定锥形瓶中废水的硝基氮和亚硝基氮浓度。通过计算硝酸盐去除率和总氮(废水中硝酸盐和亚硝酸盐浓度之和)的去除率分析菌株的反硝化性能和脱氮性能。
硝酸盐模拟废水I(/L)KNO31g；KH2PO41g；FeCl2·6H2O 0.5g；CaCl2·7H2O 0.2g；MgSO4·7H2O 1g；琥珀酸钠8.5g.
硝酸盐模拟废水II(/L)KNO30.6g；KH2PO41g；MgSO4·7H2O 1g；琥珀酸钠2.4g.
实施例2-10不同实验条件、范围确定Comamonas testosteroni CGMCC No.1800菌株的最佳反硝化条件本发明进行9次废水处理试验，优选Comamonas testosteroni WXZ-18 CGMCC No.1800菌株的好氧反硝化反应条件。
废水好氧反硝化四个反应因素分别为溶解氧浓度，通过控制不同转速rpm来实现，转速的三个水平分别为60、100和160rpm，对应溶解氧浓度分别为1.8～3.5mg/L(24～46％饱和溶解氧)、4.2～5.6mg/L(55～74％饱和溶解氧)及6.0～7.2mg/L(79～95％饱和溶解氧)；硝基氮浓度的三个水平分别为50、100和200mg/L左右；碳氮比的三个水平分别为2、6和10；pH的三个水平分别为6.5、7.0和7.5。
按照实施例1方法进行反硝化性能测定，9次试验结果见表1，并作附图1。由附图1可见，碳氮比越大，Comamonas testosteroni WXZ-18 CGMCC No.1800对硝酸盐的去除率越大；当硝酸盐浓度为100mg/L左右时，Comamonas testosteroni WXZ-18 CGMCC No.1800去除硝酸盐的能力对硝酸盐浓度负荷不是很敏感，当硝酸盐浓度达到200mg/L左右时，Comamonas testosteroni WXZ-18 CGMCC No.1800对硝酸盐的去除率将降低；在4.2～5.6mg/L(55～74％饱和溶解氧)的溶解氧条件下，硝酸盐去除率相对最大；pH中性左右对Comamonas testosteroni WXZ-18 CGMCC No.1800的反硝化性能影响很小。
在实验范围内，该菌株的最佳降解条件为C/N＝10，NO3--N＝100.9mg/L，160r/min，pH＝7.5。该条件下，四天平均硝基氮去除速率可达到43.2mgNO3-N/L·d(见附图2)，最大4天硝基氮去除率达到56.3％，最大4天总氮去除率可达到52.0％。
表1实施例2-10的废水好氧脱氮试验条件及脱氮效率
实施例11Comamonas testosteroni CGMCC No.1800的16SrRNA基因的PCR扩增和序列测定将Comamonas testosteroni CGMCC No.1800接种到100μL双蒸水中，沸水浴煮5min，进行菌落PCR扩增。用于16SrRNA PCR反应的引物为一对通用引物，即正向引物为f27(5’-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3’)和反向引物为r1492(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。引物由北京华大中生科技发展有限公司合成。PCR反应体系(50μL)10×Buffer5μL，dNTPs 4μL，引物f27和r1492各1μL，双重蒸馏水39μL，离心混匀后加入DNA模板0.5μL，Taq酶0.5μL。PCR反应程序包括(1)94℃预变性5min；(2)94℃变性1min；(3)50℃退火1min；(4)72℃延伸2min，进行25个循环；最后再次72℃延伸10min。琼脂糖凝胶电泳(1×TAE电泳缓冲液，1％凝胶)分析PCR结果，交由北京华大中生科技发展有限公司进行16SrRNA测序。16SrRNA基因序列长度为1419bp，在Genbank中的登录号为DQ356898，其16SrRNA的核苷酸序列如序列表所示。
<110>北京工商大学<120>具有好氧反硝化性能的睾丸酮丛毛单胞菌及其处理废水的方法<140>2006101408704<141>2006-10-13<160>1<210>1<211>1419<212>DNA<213>睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)<400>1tgctttacct gcagtcgaac ggtaacaggt cttcggatgc tgacgagtgg cgaacgggtg60agtaatacat cggaacgtgc ctagtagtgg gggataacta ctcgaaagag tagctaatac 120cgcatgagat ctacggatga aagcagggga ccttcgggcc ttgtgctact agagcggctg 180atggcagatt aggtagttgg tggggtaaag gcttaccaag cctgcgatct gtagctggtc 240tgagaggacg accagccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc 300agtggggaat tttggacaat gggcgaaagc ctgatccagc aatgccgcgt gcaggatgaa 360ggccctcggg ttgtaaactg cttttgtacg gaacgaaaag cttggggcta atatccccgg 420gtcatgacgg taccgtaaga ataagcaccg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata 480cgtagggtgc aagcgttaat cggaattact gggcgtaaag cgtgcgcagg cggttttgta 540agacagtggt gaaatccccg ggctcaacct gggaactgcc attgtgactg caaggctaga 600gtgcggcaga gggggatgga attccgcgtg tagcagtgaa atgcgtagat atgcggagga 660acaccgatgg cgaaggcaat cccctgggcc tgcactgacg ctcatgcacg aaagcgtggg 720gagcaaacag gattagatac cctggtagtc cacgccctaa acgatgtcaa ctggttgttg 780ggtcttaact gactcagtaa cgaagctaac gcgtgaagtt gaccgcctgg ggagtacggc 840cgcaaggttg aaactcaaag gaattgacgg ggacccgcac aagcggtgga tgatgtggtt 900taattcgatg caacgcgaaa aaccttaccc acctttgaca tggcaggaac ttaccagaga 960tggtttggtg ctcgaaagag aacctgcaca caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg 1020tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgccattag ttgctacatt 1080cagttgagca ctctaatggg actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca 1140agtcctcatg gcccttatag gtggggctac acacgtcata caatggctgg tacaaagggt 1200tgccaacccg cgagggggag ctaatcccat aaagccagtc gtagtccgga tcgcagtctg 1260caactcgact gcgtgaagtc ggaatcgcta gtaatcgtgg atcagaatgt cacggtgaat 1320acgttcccgg gtcttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagcgggtct cgccagaagt 1380aggtagccta accgcaagga gggcgctacc acggcgggt 1419
权利要求
1.具有好氧反硝化性能的睾丸酮丛毛单胞菌及其处理废水的方法，其特征是选用睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)WXZ-18 CGMCC No.1800菌株进行各种含氮废水的好氧反硝化脱氮废水处理。
2.根据权利要求1所述的睾丸酮丛毛单胞菌WXZ-18 CGMCC No.1800，其特征是16SrRNA具有如序列表所示的核苷酸序列，序列长度为1419bp，在Genbank中的登录号为DQ356898。
3.根据权利要求1所述的睾丸酮丛毛单胞菌WXZ-18 CGMCC No.1800菌株，其特征是(1)菌落特征在BTB平板上培养2～3天后，菌落大小为1～2mm，菌落成圆形，光泽度差，白色，无突起。(2)细胞形态特征适宜于pH中性左右，常温下培养，细胞为杆状，革兰氏染色阴性。
4.根据权利要求1所述的睾丸酮丛毛单胞菌WXZ-18 CGMCC No.1800，其特征是该菌株的生长细胞、细胞悬浮液能以硝酸盐为唯一氮源和能源生长，可在好氧条件下还原硝酸盐为亚硝酸盐，并能够继续在好氧条件下还原亚硝酸盐为气体产物，使废水中含氮化合物降低，达到脱氮的目的。
5.根据权利要求4所述的生长条件，其特征包括在硝酸盐废水中生长，在好氧条件下利用硝酸盐作为电子受体进行反硝化脱氮作用；也可以在如牛肉蛋白胨、营养琼脂等以营养培养基为碳源、氮源中生长。
6.根据权利要求1所述的睾丸酮丛毛单胞菌WXZ-18 CGMCC No.1800，其特征是该菌株有较广泛的适应性，对溶解氧的耐受程度强，在10～98％饱和溶解氧条件下，在硝基氮浓度25～250mg/L，碳氮比为2～30，pH5.0～8.0的条件下均能进行有效的好氧脱氮作用。
7.根据权利要求1，5，6所述的睾丸酮丛毛单胞菌WXZ-18 CGMCC No.1800，其特征是在有氧条件下具有广泛适应的反硝化作用特性，可以将其接种于常规好氧硝化污泥中，即可实现含氮废水的同步硝化反硝化作用。
全文摘要
本发明涉及一株具有好氧反硝化性能的睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)WXZ－18 CGMCC No.1800菌株及其应用于废水脱氮处理的方法。该菌株对溶解氧的耐受程度强，在10～98％饱和溶解氧条件下，均能以显著的速度还原硝酸盐和亚硝酸盐，将其接种于活性污泥中富集培养后，可实现好氧反硝化作用。
文档编号C02F3/34GK101016523SQ200610140870
公开日2007年8月15日 申请日期2006年10月13日 优先权日2006年10月13日
发明者汪苹, 翟茜, 项慕飞, 龙雯, 柯国华, 杨志 申请人:北京工商大学