专利名称：：生物膜深度处理饮用水源苯并芘方法
技术领域：
：本发明涉及深度处理饮用水源苯并芘(BaP)特效菌Fhhh生物膜技术方法。二
背景技术：
：国内外已有深度处理饮用水源的生物膜工程技术，典型的如德国缪尔海姆水厂；法国梅里苏瓦兹水厂；中国上海周家渡水厂等。国际上也有降解苯并芘[benzo(a)pyrene，BaP]的牛寺效菌株，如美国(J.Schneider,1996)Afyco6ac/en'w附s/.RJGII-135，美国(J.A.Rentz,2008)S/W"gowo"氾y朋o汰i/;;"eJAR02等。但是没有深度处理饮用水源BaP的原生质体融合菌株生物膜技术株专利，原生质体融合菌株深度处理BaP目前仍是空白。BaP是一种强致癌性的持久性有机污染物(persistentorganicpollutants,POPs)，如YZNJ饮用水源中含有25种POPs有机污染物，其中BaP达0.024吗/L;经过传统的化学絮凝沉淀处理生产的自来水中BaP为0.022pg/L。饮用水中BaP致癌风险最低阈值为0.0029〃g/L(美国环保局，2008)。国内外已有深度处理饮用水源生物膜工程技术，典型的如德国繆尔海姆水厂；法国梅里苏瓦兹水厂；中国上海周家渡水厂等。但是，未见应用生物膜深度处理饮用水源强致癌污染物苯并芘(BaP)的技术专一利。BaP是一种强致癌性的持久性有机污染物(persistentorganicpollutants,POPs)，如YZNJ饮用水源中含有25种POPs有机污染物，其中BaP达0.024pg/L;经过传统的化学絮凝沉淀处理生产的自来水中BaP为0.022吗/L。饮用水中BaP致癌风险最低阈值为0.0029吗/L(美国环保局，2008)。本发明是为了应用特效菌生物膜技术高效去除饮用水源中BaP，使生产的自来水水中BaP达到饮用水标准，消除及降低饮用水中BaP的致癌风险威胁，保护人体健康o本申请人的中国专利申请号CN02138171.0为两真菌与一细菌原生质体融合的特效菌株，即Fhhh特效菌株，是本申请发明人的原创性科研成果，由白腐真菌(亲株l)真核细胞、土著细菌YZ1(亲株2)原核细胞、酿酒酵母(亲株3)真核细胞的两界细胞原生质体，跨界融合构建而成。通过3个亲本菌株两界细胞的原生质体跨界融合、基因整合、鉴定筛选，从而获得兼具3个亲本菌株优势特征于一体的基因工程Fhhh特效菌株，为深度降解饮用水源BaP提供功能基因的整合资源。国际法公认原生质体融合构建的新物种/菌株，不存在基因污染问题，所以Fhhh特效菌株也不存在基因污染问题。菌株的保藏号是CGMCCNo.0783。(1)Fhhh特效菌液体培养基配方1000ml液体培养基中3gK2HP04;lgKH2P04;0.5gNH4NO3;0.1gNa2SO4;10mgMgS04.7H20;lmgMnS04.4H20;0.5mgCaCl2;lmgFeS04.7H20;5gCH3COONa;5g酵母浸膏；lOg蛋白胨；10g葡萄糖；200g马铃薯浸出汁，调pH至7.0，121QC、103kPa、湿热灭菌20min。最适培养温度33土2Gc;最适pH:7.0。(2)三种固体鉴别培养基(SIM1、SIM2、SIM3)配方固体培养基SM二Fhhh特效菌液体培养基+1.5X琼脂糖。SIM卜SM+100u链霉素/ml(streptomycin,Sm)—真菌亲株只能在SIM1上生长。SIM2:SM+100u制霉菌素/ml(nystatin,Nt)—细菌亲株只能在SIM2上生长。SIM3=SM+Sml00u/ml+Ntl00u/ml(Sm+Nt)—只有跨界融合产物能在SIM3上生长。(3)两次跨界融合Fhhh特效菌株由亲株1白腐真菌(尸/^meroctoetecAo^ospon'wm)、亲株2土著细菌YZ1(5flf"7/";y)、亲株3酿酒酵母(&cc/zaram少ce;ycwev^fle)的3个亲本菌株原生质体跨界融合而成。分别应用蜗牛酶脱去2种真核细胞亲株的细胞壁，应用溶菌酶脱去l种原核细胞亲株的细胞壁，生成原生质体；离心收集原生质体、经过缓冲液清洗，进行真核原核2界细胞的两次跨界融合，最终筛选鉴定获得Fhhh特效菌株。第一次跨界融合生成Fhh(双亲株跨界融合)等量混合亲株1白腐真菌和亲株2土著细菌YZ1的原生质体于聚乙二醇(PEG,MW=6000)和CaCl2、蔗糖配制的诱导液中，进行第一次跨界融合反应。之后离心收集融合产物，经高渗缓冲液清洗离心后，分别涂布于SIM1、SIM2、SIM3三种固体的含有不同抗生素的生化鉴别培养基上，30GC培养7天。能够同时在三种固体培养基上长出的菌落，即为第一次双亲株跨界融合产物Fhh。亲株1白腐真菌只能在SIM1上生长，亲株2土著细菌YZ1，只能在SIM2上生长。第二次跨界融合生成Fhhh(三亲株跨界融合)等量混合第一次跨界融合产物Fhh和皿i酿酒酵母的原生质体于聚乙二醇(PEG,MW=6000)、和CaCl2、蔗糖配配制的诱导液中，进行第二次跨界融合反应。之后经离心后收集融合产物、含蔗糖高渗缓冲液离心清洗后、涂布于三种固体鉴别培养基上。之后反复画线分离纯化出能够同时在SIM1、SIM2、SIM3三种培养基上长出的单菌落。再经扫描电子显微镜(SEM)的摄像确认挑选出不同于Fhh细胞形态的Fhhh单菌落。
发明内容本发明目的是采用生物膜技术高效去除饮用水源中BaP，使生产的自来水水中BaP达到饮用水标准，采用深度处理饮用水源BaP的原生质体融合特效菌生物膜方法，保障饮用水的人体安全健康；尤其是应用原创性的跨界原生质体融合特效菌Fhhh为出发菌株，强化生物膜技术系统深度处理饮用水源BaP的功能。本发明的目的是这样实现的生物膜深度处理饮用水源苯并芘方法，菌落为三亲跨界融合的保存号为CGMCC.0783的菌落。此菌落融合白腐真菌(亲株l)、土著细菌YZ(亲株2)、酿酒酵母(亲株3)三个亲株真核原核细胞的原生质体，通过基因在同一个细胞内的重组整合，构建获得基因工程特效菌株Fhhh。用所述特效菌生物膜反应器深度处理饮用水源苯并芘(BaP)的方法是Fhhh特效菌剂引入装有活性炭载体的柱状反应器中，闷曝溶解氧(DO)Smg/L，驯化挂膜5天，Fhhh在活性炭载体上形成生物膜。之后将饮用水源水引入反应器中，调试处理BaP的工艺参数曝气溶解氧^2mg/L，pH值6.8-8.0，温度30土2GC，48小时内负荷比增加至20m3/1112/11，菌体浓度达2-10g/L，去除化学耗氧量(COD)>10%为挂膜成功的结束标志，之后进入处理运行阶段，稳定运行处理阶段的反冲洗强度为0.02m3/(m、)。原创性的跨界原生质体融合技术构建出的Fhhh特效菌，用于建立深度处理饮用水源BaP的生物膜技术系统。本发明应用原创性的跨界原生质体融合技术，将亲株l一白腐真菌的高降解性、亲株2—土著细菌YZ1的高适应性、亲株3—酿酒酵母的高絮凝性的3高特征，整合构建于Fhhh特效菌株的一个细胞之中。原创建立的深度处理饮用水源BaP的特效菌株Fhhh生物膜技术系统，配套相关的应用技术，在应用上具有持久性。本发明的有益效果(1)生产Fhhh特效菌剂成本低，Sl000元/吨，(2)Fhhh特效菌剂具有三亲株的综合优势，深度处理去除BaP效率^68%。(3)Fhhh生物膜消除致癌风险效益是土著菌1.89倍，是化学絮凝处理法7.50倍。(4)Fhhh来自真核原核菌体核细胞的原生质体融合，不产生新基因及其污染问题。总之，本发明Fhhh特效菌生物膜反应器深度处理饮用水源BaP比土著菌提高效率和节约费用289%，比传统的化学絮凝沉淀法提高处理BaP效率7倍以上；处理出水中BaP为0.007ng/L，达到中国、WHO和欧盟饮用水标准0.01ng/L允容浓度的要求。本发明是原生质体融合原创性特效菌生物滤池，深度处理饮用水源BaP的首例，具有高降解优势，并且性能稳定。四图1为本发明深度处理饮用水源POPs特效菌株生物膜滤池工艺流程示意图五具体实施例方式参见图1深度处理饮用水源BaP特效菌株生物膜滤池工艺流程示意图。Fhhh特效菌剂制备(1)Fhhh特效菌剂液体培养基配方同于Fhhh特效菌液体培养基配方。(2)制备Fhhh特效菌剂工艺参数发酵设备全自控生物反应器；发酵工艺连续稳定发酵系统；发酵温度33±2GC;pH值7.0±1;反应器中溶解氧^2mg/L;矿物盐流量0.001-0.005V/(V.d);菌体浓度2-10g/L;在含C、P、N培养液中培养。表l.发酵生产Fhhh特效菌剂工艺参数<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>特效菌Fhhh生物膜深度处理BaP方法:(1)挂膜驯化将Fhhh特效菌剂引入装有活性炭载体的柱状反应器中，曝气溶解氧(DO)22mg/L，驯化挂膜5天，Fhhh在活性炭载体上形成生物膜。之后将饮用水源水引入反应器中，调试处理BaP的工艺参数曝气溶解氧^2mg/L，pH值6.8-8.0，温度30±2QC，48小时内负荷比增加至20mVm2/11，菌体生物膜浓度达2-10g/L，去除化学耗氧量(COD)210%为挂膜成功的结束标志，之后进入处理运行阶段，稳定运行处理阶段的反冲洗强度为0.02m3/(m2's)。(2)饮用水源水质背景参数见表2。表2.特效菌Fhhh生物膜反应器深度处理饮用水源的水质参数(mg/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>(3)生物膜反应器参数见表3。表3.特效菌Fhhh深度处理饮用水源BaP的生物膜反应器工艺参数参数名称数值参数数值生物膜反应器柱体径高比D/H《1/10混合载体密度Dd，g/cm31.2载体活性碳体积率Vac，％67生物膜载体装量，Vacqs%280载体石英砂体积率Vqs,%33饮用水源水流速，m3/m2/h20活性碳和石英砂粒径Si,mm0.8-1.2水力停留时间HRT，min>6活性碳比表面积Saac，m2/g簡流量Q，(m3/d)800,000石英砂比表面积S叫s，m2/g950溶解氧含量Do，(mg/L)1.5(4)处理结果健康效益特效菌Fhhh深度处理BaP人体健康效益推算结果见表4。表4.Fhhh生物膜反应器深度处理YZNJ饮用水源BaP运行健康参数推算结果序号参数单位Fhhh特效菌YZ土著细菌化学絮凝生物膜反应器生物膜反应器传统工艺1饮用水源水进水流量(Qo)m3/d800,000800,000800,0002饮用水源水进水BaP浓度(So)吗/L0.0240.0240.0243处理出水BaP浓度(Se)Hg/L0.0070.0150.0224去除BaP浓度(ABaP=So-Se)pg/L0.0170.0090.0025降解BaP生物负荷率(SLR)lOV3.021.60—6去除BaP质量(W-ABaPxQox365)pg/年4964x1062628x106584xl067承BaP致癌风险浓度(MRC)Hg/L0.00290.00290.00298BaP诱发1人致癌风险质量(MD)Hg/人/年511xl06511xl06511xl069消除致癌风险人数(HH二W/MD)人/年9.715.14U410致癌死亡风险费支出(//Cm)百万Y/人0.45250.45250.452511消除致癌风险经济效益(E)百万Y/年4.39382.32590.5859—BaP致癌风险浓度(MRC):诱发106人口理论生命周期中人致癌的BaP浓度。**诱发1人致癌每年BaP质量(MD):MD=106x365xl.4xMRC，其中106为100万人口数量，365为每年天数，1.4为每人每天理论饮水1.4升。实施例Fhhh菌株生物膜反应器深度处理YZNJ(长江南京)饮用水源BaP。(1)发酵生产Fhhh特效菌剂发酵生产工艺参数见表l，发酵生产特效菌剂的反应器为B.Braun全自控生物反应器。Fhhh特效菌剂添加巯基乙醇(SH)于4'C保存。(2)保存Fhhh特效菌剂方法在抗氧化剂巯基乙醇终浓度0.1-0.3X。+F,终浓度0.1-0.14%的配方中4QC保存。(3)特效菌Fhhh生物膜反应器深度处理饮用水源BaP工艺实施基因工程菌生物膜反应器中，生物膜反应器径高比D/H《l/10;载体活性碳体积率Vac=67%;载体石英砂体积率Vqs=33%;活性碳和石英砂粒径Si=0.8-1.2mm;活性碳比表面积Saac=1045m2/g;石英砂比表面积Saqs二950m々g;混合载体密度Dd=1.2g/cm3;生物膜载体装量Vacqs^80X。发酵生产Fhhh特效菌剂的工艺参数见表1，建造特效菌Fhhh生物膜反应器的参数见表3。将发酵生产获得的Fhhh特效菌剂引入装有活性炭载体的柱状生物膜反应器中，生物膜反应器基因工程菌挂膜驯化方法，闷曝溶解氧(DO)22mg/L，驯化挂膜5天，使得Fhhh在活性炭载体上形成生物膜。之后将饮用水源水引入反应器中，维持D0^2mg/L，pH值6.8-8.0，温度30士20C，48小时内负荷比增加至20m3/m2/h，Fhhh菌体生物膜达2-10g/L，去除化学耗氧量(COD)WO。/。为Fhhh驯化挂膜成功的结束标志，之后进入处理运行阶段，稳定运行处理阶段的反冲洗强度为0.02m3/(m2*s)。基因工程菌生物膜反应器深度处理饮用水源BaP的稳定运行参数，饮用水源水流速为20m3/m2/h;水力停留时间HRT》6min;溶解氧含量Do为2.0mg/L。(4)特效菌Fhhh生物膜反应器深度处理饮用水源BaP工艺实例总结2007年3-9月于NJBHK水厂进行了《深度处理饮用水源BaP特效菌Fhhh生物膜反应器技术》现场处理研究。其中42天稳定运行结果是Fhhh生物膜反应器中的生物负荷率为3.02><10-6(1"，与国际上降解BaP特效菌株的报道结果相近，处理出水中BaP为0.007吗/L，达到中国、WHO和欧盟的饮用水标准。应用美国国家环保局BaP致癌风险浓度参数推算，Fhhh生物膜反应器运行可以消除致癌风险人数9.71人/年。根据中国人体风险调节法(adjustedhumancapital,AHC)得出NJ地区致癌风险经济付出为0.4525百万元/人，推算Fhhh生物膜反应器消除致癌风险潜在的经济效益达439万元/年，是土著菌的1.89倍，是化学絮凝处理法7.50倍。权利要求1、一种生物膜深度处理饮用水源苯并芘方法，其特征是融合白腐真菌、土著细菌YZ、酿酒酵母三个亲株真核原核细胞的原生质体，通过基因在同一个细胞内的重组整合，构建获得基因工程菌，登记号为CGMCCNo.0783；用所述特效菌生物膜反应器深度处理饮用水源苯并芘的方法是基因工程菌剂引入装有活性炭载体的柱状反应器中，闷曝溶解氧(DO)≥2mg/L，驯化挂膜5天，基因工程菌在活性炭载体上形成生物膜；之后将饮用水源水引入反应器中，调试处理BaP的工艺参数曝气溶解氧≥2mg/L，pH值6.8-8.0，温度30±20C，48小时内负荷比增加至20m3/m2/h，菌体浓度达2-10g/L，去除化学耗氧量(COD)>10％为挂膜成功的结束标志，之后进入处理运行阶段，稳定运行处理阶段的反冲洗强度为0.02m3/(m2·s)。2、由权利要求1所述生物膜深度处理饮用水源苯并芘方法，其特征是制备所述基因工程菌的液体培养基的组成是1000ml中K2HP043g;KH2P04lg;NH4N030.5g;Na2SO40.1g;MgS04.7H2010mg;MnS04'4H20lmg;CaCl20.5mg;FeS04-7H20lmg;CH3COONa5g;酵母浸膏5g;蛋白胨10g;葡萄糖10g;200g马铃薯浸出汁，调pH至7.0;培养方法是在121GC、103kPa、湿热灭菌20min后,接种发酵，培养温度33-37GC;最适pH:7.0，发酵10-25小时。3、由权利要求1所述的生物膜深度处理饮用水源苯并芘方法，其特征是基因工程菌制的保存配方，在抗氧化剂巯基乙醇终浓度0.1-0.3。；+FeS+终浓度0.1-0.14。/。的配方中保存。4、由权利要求1所述的生物膜深度处理饮用水源苯并芘方法，其特征是基因工程菌生物膜反应器中，生物膜反应器径高比D/H《l/10;载体活性碳体积率Vac=67%;载体石英砂体积率Vqs二33X;活性碳和石英砂粒径Si二0.8-1.2mm;活性碳比表面积Saac=1045m2/g;石英砂比表面积Saqs=950m2/g;混合载体密度Dd=1.2g/cm3;生物膜载体装量Vacqs^80%。5、由权利要求1所述的生物膜深度处理饮用水源苯并芘方法，其特征是生物膜反应器基因工程菌挂膜驯化方法，闷曝溶解氧(DO)22mg/L，驯化挂膜5天，基因工程菌在活性炭载体上形成生物膜。6、由权利要求1所述的生物膜深度处理饮用水源苯并芘方法，其特征是基因工程菌生物膜反应器挂膜驯化结束标志，饮用水源水引入反应器中，调试处理BaP的工艺参数曝气溶解氧^2mg/L，pH值6.8-8.0，温度30±2QC，48小时内负荷比增加至20m3/m2/h，菌体浓度达2-10g/L，去除化学耗氧量(COD)>10%为挂膜成功的结束标志。7、由权利要求1所述的生物膜深度处理饮用水源苯并芘方法特效菌株生物膜反应器深度处理饮用水源苯并芘(BaP)的方法，其特征是基因工程菌生物膜反应器深度处理饮用水源BaP的稳定运行参数，饮用水源水流速为20m3/m7h;水力停留时间HRT》6min;溶解氧含量Do为2.0mg/L。全文摘要生物膜深度处理饮用水源苯并芘方法，融合白腐真菌、土著细菌YZ、酿酒酵母三个亲株真核原核细胞的原生质体，通过基因在同一个细胞内的重组整合，构建获得基因工程菌，登记号为CGMCCNo.0783；用所述特效菌生物膜反应器深度处理饮用水源苯并芘的方法是基因工程菌剂引入装有活性炭载体的柱状反应器中，闷曝溶解氧(DO)≥2mg/L，驯化挂膜5天，基因工程菌在活性炭载体上形成生物膜。之后将饮用水源水引入反应器中，调试处理BaP的工艺参数曝气溶解氧≥2mg/L，pH值6.8-8.0，温度30±2℃，48小时内负荷比增加至20m<sup>3</sup>/m<sup>2</sup>/h，菌体浓度达2-10g/L，去除化学耗氧量(COD)＞10％为挂膜成功的结束标志，之后进入处理运行阶段，稳定运行处理阶段的反冲洗强度为0.02m<sup>3</sup>/(m<sup>2</sup>·s)。文档编号C02F3/12GK101381154SQ20081015565公开日2009年3月11日申请日期2008年10月28日优先权日2008年10月28日发明者兵吴,崔益斌,宴张,张徐祥,程树培,赵大勇申请人:南京大学