专利名称：一种重金属镉抗性相关蛋白DbsCzcA及其编码基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物基因工程，和生物修复领域。具体地说，本发明提供了生活在酸性矿山废水(acid mining drainage, AMD)的一种未知微生物所含有的一种对重金属镉抗性的基因即阳离子外排系统蛋白基因(DbsCzcA)的序列，以及该序列推测编码蛋白质分子的氨基酸序列。本发明在提高微生物和植物对重金属镉的抗性方面有着重大的应用价值。
背景技术：
随着矿产资源的开发利用、工业发展，重金属对环境造成的污染日趋严重，土壤重金属污染已经成为一个危害全球环境质量的问题。土壤重金属会影响植物的生长发育，降低农作物的产量和质量，带来了严重的经济损失。此外，受土壤重金属污染的作物在植物体中积累，并通过食物链富集到人体和动物体中，危害人畜健康，引发癌症和其他疾病等。治理重金属污染刻不容缓，各种修复技术和措施正在研究和应用中。各国政府和科学家着力通过两个途径解决这一问题一为利用物理的，化学的方法试图清除土壤或水体的重金属污染二为利用现代生物技术清除污染。自从20世纪80年代以来，生物修复技术因其具有处理费用低、对环境影响小、效率高等优点，越来越受到广大科技人员的广泛关注。生物修复一般分为植物修复、动物修复和微生物修复三种类型，其中植物修复和微生物修复是研究的热点。微生物修复就是利用微生物将环境中的污染物降解或转化为其他无害物质的过程。近年来，基于微生物对重金属的作用机理，以修复有毒有害金属污染或回收有经济价值重金属为目的的生物处理技术日趋成熟。植物修复指利用植物去治理水体、土壤和底泥等介质中的污染的技术。然而用于重金属污染修复的生物往往会受到重金属的毒害，生长缓慢、生物量小，甚至不能生存，所以重金属对植物和微生物的毒害作用是生物修复的主要限制因素。解决生物修复中重金属对生物的毒害作用的根本途径在于研究耐受重金属的分子生物学机制，克隆对重金属耐受的关键基因，通过基因工程手段获得用于生物修复中性能优良的转基因工程生物。由于技术上的原因，直到最近，对微生物基因资源的利用主要局限于可培养微生物。然而，已培养微生物仅占自然界中微生物的不到1%，因此各种生境中的微生物宏基因组是一个巨大而未发掘的基因资源库。极端环境具有丰富的微生物资源，当中许多与逆境和关键生命过程相关的基因在长期的适应进化中获得了更强的耐性潜能，发掘这些抗性基因已成为国际重要的研究热点。酸性矿山废水(AMD)是极端生境微生物学研究的重要系统。AMD来源于采矿活动使含硫矿物(主要为黄铁矿，FeS2)暴露于空气和水中，在微生物催化作用下迅速氧化产酸所致，其PH值一般在1-4左右，而且富含硫酸盐以及Pb、Zn、Cu、 Cd和Ni等重金属，是采矿业面临的最严重环境问题之一。在AMD中生存的原核微生物在长期的进化过程中逐渐形成了一些独特机制，以应对低PH值、高盐度以及高重金属等多种极端环境协迫。因此，AMD生境成为极具特色和丰富的抗逆基因库。镉(Cd)是一种极其重要的工业和环境化学污染物，因其对环境水、空气和土壤的污染而在动植物体内蓄积，最终导致对人类健康的危害，并由于它在体内能长期蓄积，不易排除，故易产生慢性的和远期的病理效应，可损伤许多组织和系统。把生物体内的镉离子快速排出是一种有效的解毒方式。Czc是一种膜结合的蛋白复合体，它通过主动运输把细胞内的Co2+，Zn2+和Cd2+排出到细胞外，从而解除这些重金属离子的毒性。在这个蛋白复合体中，CzcA编码一个阳离子 /质子对流泵，CzcB编码一个亚基与阳离子结合，CzcB主要与Zn2+结合，CzcC与CzcB结合， 使CzcB构象发生改变，能与Co2+和Cd2+结合。，CzcD, CzcE, CzcS和CzcR编码四个CzcCBA 操纵子，对Czc复合体起着调控的作用。但CzcD、CzcE、CzcS和CzcR对这个Czc蛋白复合体的表达并不是必需的。Nies 等发现 CzcR and CzcD 影响 Alcaligenes eutrophus 通过 Czc 重金属外排系统对钴，锌，镉的抗性。Legatzki研究表明Ralstonia metalIidurans的Czc系统与另外两个P型ATP酶相互影响，对提高它对重金属的抵抗力都有一定的作用。在Ralstonia metalIidurans中czcNp启动子控制着Czc复合体的表达,从而决定着它对重金属的抵抗能力。
发明内容
本发明的目的在于提供AMD微生物中的阳离子外排系统蛋白Czck,以及编码该蛋白的新基因，为今后开发基因工程产品奠定物质基础。在本发明的一个方面，提供了一种酸性矿山废水微生物中阳离子外排系统蛋白 DbsCzcA,它为如下蛋白分子(i)或(ii)⑴具有入SEQ ID NO : I所述的氨基酸序列；(ii)在SEQ ID NO 1限定的氨基酸序列经过取代，缺失或叠加一个或几个氨基酸衍生的蛋白质与(i)的蛋白质具有相同的功能。在本发明的另一个方面，提供了一种DNA分子，它包括编码所述的阳离子外排系统蛋白CzcA的核苷酸序列。发明发现DbsCzcA蛋白具有金属镉抗性作用，可以在治理环境镉污染中应用。发明同时保护了该蛋白的编码基因，具有如SEQ ID NO :2所示的序列；以及该基因在治理环境镉污染中的应用。发明用表达DbsCzcA的基因工程菌作为试验对象，发现在镉胁迫下，其镉耐受性大大高于非基因工程菌。在镉离子浓度为200 u M以下时，尤其是150M以下时，仍有较高的
存活率。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果本发明从AMD微生物中克隆了一个新的CzcA基因，并对其对重金属镉的抗性进行了功能分析。通过大肠杆菌转化实验证明该基因可以提高大肠杆菌中对镉的抗性。应用本发明的基因序列或氨基酸序列进行转基因开发基因工程产品面具有重大的应用价值，具体来说可用于培育高生物量的重金属超富集植物或微生物，用于重金属污染土壤和水体的生态修复。
附图I为DbsCzcA在大肠杆菌中的表达时相；其中M :蛋白分子量标准I :携带空载体pET28a的BL21 (DE3)菌株2-9 :携带 pET28a-DbsCzcA 的 BL21(DE3)菌株分别诱导表达 O、1、2、3、4、5、6、7 小时。附图2为表达DbsCzcA的大肠杆菌在不同镉浓度下培养12小时后BL21 (DE3)的生长情况。附图3为表达DbsCzcA的大肠杆菌在150 ii M镉胁迫下的生长曲线。
具体实施例方式实施例IDbsCzcA基因全序列的克隆野外微生物样品采集在云浮铅/锌矿选取不同酸化阶段(以pH为标准)的AMD，使用0. 22 y m的滤膜收集20LAMD里面的细胞。为了保持核酸的完整保存，保存样品冻于液氮中，24小时内带回实验室，并放于-70°C冰箱长期保存。核酸的提取DNA提取采用SET方法，过程如下向SET buffer中加入溶菌酶及蛋白酶K，消化 30min后，15, OOOrpm离心15min后用氯仿抽提2次,用异丙醇沉淀过夜后,75%乙醇清洗2 次，最后溶于灭菌水中。用Qiagen tip-100柱纯化回收基因组DNA,用核酸蛋白分析仪检测 DNA质量及浓度。基因组测序用Roche 公司的 GS FLX Titanium General Library Preparation Kit 制备上机样品。使用Roche 454Genome Seqencer FLX测序仪,通过进行测序,用Pyrobayer软件获取喊基序列。基因组序列分析去除低质量的测序结果后，对基因组进行如下分析序列拼接使用Euler-SR 及 454 公司的 GS De Novo Assembler Software 进行序列拼接。用N50指数评价拼接的效果；基因组注释将拼接好的微生物的全基因组序列用MG和SEED系统进行基因组的注释，发现新的基因。DbsCzcA基因片段的克隆通过PCR方法以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点)，PCR获得一条3kb大小的条带，并克隆到 PCR2. 1(购自invitrogen公司)载体中，序列委托invitrogen公司测定。DbsCzcA基因序列分析测序结果表明CzcA基因大小为3240bp (见SEQ ID NO :2)，编码1079个氨基酸 (见 SEQ ID NO 1) o实施例2DbsCzcA基因的功能分析本实施例中利用大肠杆菌转化实验分析DbsCzcA基因的功能。
构建重组表达载体设计以下一对引物，在DbsCzcA基因5’引入BamHI酶切位点，3’引入XhoI酶切位DbsCzcA-F(SEQ ID NO 3)5’ CGCGGATCCATGCTCAAAGCCATTTTAGCCT3’DbsCzcA-R(SEQ ID NO 4)5’ CCGCTCGAGCTGATCTTCCTCATCCATCTGG3’以PCR2. I-DbsCzcA载体为模板进行PCR。分别将PCR产物和酵母穿梭表达载体 pET28a用BamHI和XhoI进行酶切，将酶切产物回收、连接、并转化大肠杆菌DH5 a。经测序并酶切鉴定，得到了 pET28a-DbsCzcA重组子。蛋白表达将重组子pET28a_DbsCzcA转化大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)，通过PCR验证筛选阳性克隆。挑取含重组质粒的菌体单斑至IOml LB(含Kan50ii g/ml)中37°C过夜培养。 将Iml菌液加入到含100ml LB培养基(含Kan50 y g/ml)，37 °C震荡培养至0D600约为 0. 4-1. 0 (最好 0. 6，大约需 2hr)。加入IPTG至终浓度为ImM进行诱导，每隔I小时收集Iml菌液，离心12000gX60s 收获沉淀，用80iil ddH20重悬，加入20iil 5 X SDS-PAGE上样缓冲液，混匀，沸水浴lOmin。 取上清作为样品做SDS-PAGE分析(见附图I)。转化子对重金属镉抗性的测定挑取含重组质粒的菌体单斑至IOml LB (含Kan 50 U g/ml)中37°C过夜培养。将 IOOul 菌加入至Ij IOml Cd2+浓度分别为 0iiM、50iiM、100iiM、150iiM、200iiM 的 LB 培养基 (含 Kan 50 u g/ml, IPTG ImM)中，37°C、200rpm 震荡培养 12 小时，分别测定 0D600 值。根据实验结果，选取Cd2+浓度为150 PM作为胁迫条件，进行了生长曲线的测定。挑取含重组质粒的菌体单斑至IOml LB (含Kan 50 u g/ml)中37°C过夜培养。将IOOul菌加入到 IOml Cd2+浓度为 150 ii M 的 LB 培养基(含 Kan 50 u g/ml,IPTG ImM)中，37°C、200rpm 震荡培养，每隔2小时测定0D600值。实验结果表明，表达DbsCzcA基因的BL21(DE3)在0-200 ii M Cd2+浓度下都可以正常生长，而空载体对照在Cd2+浓度超过150 u M时便不能生长(见附图2)。在150 ii M Cd2+ 浓度下，表达DbsCzcA基因的BL21 (DE3)在培养过程中都可以生长，而空载体对照的生长一直受到抑制(见附图3)。实验结果说明，DbsCzcA对重金属镉的防御起着重要作用。SEQ ID NO 1MLKAILAFVLTRRPIILLGFAVFIGAGLVAVNKLNIEAYPNPAPVILEITAQAPG LSAEEMERYYTI PMEIGLYSALGIDNIRSTSFYGLSFVRVTFKYGVDFHFAYE QAALALQQNVTLPQNQIPQIQQSSLVGEVYRYQV VGPPHFGLTNLRSVQDffI ILRRLSTIPGVVQVNSffGGTTKEFQVEADLNKLQAYNVTVQQLMAALGNGN INVGG REITIGQQSVNIRGIGLIDDGGADDLTKGYHVDDIEKIVLSQTNGVPVR VRDVAKVRVGF VPRLGIAGRDHDDD IAASIVVMSRVMHTNDIVPKIKAMVE QMNHDGSLPPGVHIEPYYDRLNLVSTTTHTVFHNLIFGCLLVFAIQWIF LGDL KSAIIVGINIPFALLFSIIILVLQGEDANLLSIRAVDFGIIIDSAVILVENIFRNLQA KKEERQRLLNDL SEGQMGHDPTTDRSVDSNVTffTDQLRLIFISSMQINRSVL FSVMITVAAFVPLFTMQGVEGQIFGPMARTYGYA LAGALISSFTITPVLSSFLL RGNIQEVETFLVRHLHNLYIPILRffSIVNRKGVVLSGLLFLILSGILGTRLGSEhTILPALEEGNFWIRASMPLTMGLDAGTEATRKMREILLRHPEVITVVSQHGRPD NGSDASAFSNVELFVPLKPYD QWPSGLTKEKLTQTLQQEFSDALPGVGFNFS QYIQDNVEEALSGVKGANSVKIIGHDLPTLERLAGQVMDQMNHV
EGVADLG ifrvmgqpnlnitidrdkaaryglntgdintviqatmgdavastvlegdrqf nltvrlplqqrdnve
VIGNIKVGYTTPTGGTAFIPLRELATITLDSGASYIYHE TTQRYIPIKF SVRGRDLGSTVSEAQKRIAENIQL PNGYRIIWAGEFEDLEKAKK RLAIIVPISLMLIAVPLYGLFNSARDSMLALLGIPFAVGGGILSLFITGIPFSV SA AIGFISLLGVSVMDRILIITYFNQLRMSGVSPIKALVEASEKRMRPLLMTALSA CIGLFPAAISHGIGSQV QRPLATVVVGGLAIGSLLLLIVVPALHALLLPKEKRS SFG
Kaomdeedq
〔0058〕 SEQ ID NO :2
I--10059U >^00^0 >000>^^^^>000^^00^00^0>0^00>00>000>^^>^0^^> CTGGGGTTTGCTGTGTT TATCGGGGCTGGCCTTGTTGCTGTGMCMACTC MCATCGMGCCTATCCCMCCCGGCACCTGTTATTTTGGM ATTACCGOTCAGGCTCCGGGTCTCTCGGCAGMGMATGGAGCGTTACTATACGATTOOTATGGMATCGGCCTG TATTCGGCGTTGGGTATCGACAATATTCGCTCG ACTTCTTTTTATGGTTTGTCGTTTGTTCGTGTGACGTTCAAAT ATGGGGTT GATTTTCATTTTGCCTACGAGCMGCTGCTTTGGCGCTCCAGCMMTGTC ACCTTGCCGCMMTC AGATTCCTCAGATTCAGCAGTCCAGTCTGGTTGG TGAGGTATATCGTTATCMGTGGTAGGGCCACCGCACTTTGG CTTAACAA ATCTTCGCTCAGTACAAGACTGGATTATCCTGCGTCGCTTATCCACCATCC CCGGAGTGGTTCAAGT CAACAGTTGGGGGGGGACAACCAAGGAATTCCA AGTTGAGGCAGATCTCAACAAACTACAAGCCTACAATGTCACC GTACAAOAGTTGATGGCGGCGCTGGGTAACGGCAATATCAACGTGGGTGGTCGCGA AATCACCATAGGCCAACAG TCGGTCAACATTCGCGGCATCGGCTTGATCG ATGATGGAGGAGCGGATGACCTGACCAAAGGCTACCATGTTGATG ACAT CGAAAAGATTGTCCTGTCACAAACCAATGGGGTTCCAGTTCGAGTTCGGG ATGTCGCTAAAGTCAGGGTTG
GGTTTGTACCCCGACTGGGMTTGCAGGT CGTGATCATGACGATGACATTGCCGCATCCATCGTGGTCATGAGCCG CGT CATGCACACCMCGATATCGTGCCGMGATCMGGCTATGGTAGAGCAG ATGMCCACGACGGCAGTTTGCC TCCAGGAGTTCATATTGAGCCTTACTA CGATCGTTTAAATCTTGTGTCTACTACCACACATACCGTTTTCCATAAT CT GATTTTCGGATGTCTGCTTGTTTTCGCAATTCAATGGATTTTTTTGGGAGA TTTGAAGAGCGCTATCATTGTT GGTATTMCATTCCGTTTGCGCTCCTTTT CAGTATTATCATACTGGTGCTTCMGGAGAGGATGCCMCCTTCTAT CCA TTAGAGCTGTTGACTTCGGTATCATCATCGATTCGGCTGTCATCTTGGTCG AGAATATATTCAGGAATCTAC MGCCMGMAGMGMCGTCAGCGCCT GCTGMTGACCTTTCCGMGGCCMATGGGGCATGACCCCACGACCGA TC GGTCGGTTGATAGCAACGTAACATGGACTGACCAGTTGCGACTTATCTTC ATCAGTTCTATGCAAATCAATCG TTCCGTTCTTTTTTCCGTGATGATTACA GTGGCTGCATTTGTCCCCCTGTTTACTATGCAGGGGGTTGAGGGTCAG ATT TTTGGCCCCATGGCGCGGACCTATGGTTATGCCCTGGCTGGTGCCTTGATT TCGAGTTTTACCATCACACCC GTACTGTCATCCTTTCTGTTGCGCGGCMT ATTCAGGMGTTGMACATTTCTGGTGCGACATCTACATMCTTGT ACAT TCCGATTCTGCGCTGGTCCATTGTGMCCGTMGGGGGTGGTACTGTCGG GACTGCTGTTTCTCATTCTGT CGGGCATTCTGGGGACGCGCTTGGGTTCCG AGTTTCTTCCTGCCTTGGAAGAGGGAAATTTCTGGATTCGCGCTTC MTGC CGCTCACMTGGGGCTGGATGCGGGCACAGMGCCACGCGTMMTGCG CGMATTCTTCTCCGTCACCC TGMGTTATTACGGTGGTTTCACAGCATGG TCGCCCAGATMTGGTAGCGATGCTTCGGCATTTTCCMCGTGGM CTTTT TGTGCCACTCMACCTTATGATCMTGGCCCAGTGGTTTGACCMGGMA ^^0>000>0>0>0^00 CMGMTTTTCAGATGCGTTACCCGGAGTG GGGTTCMTTTTTCACMTATATCCAGGATMTGTTGMGMGCTT TGTC AGGGGTTMAGGGGCCMTTCAGTCMMTCATTGGCCATGACTTGCCM
AGGTCATGGATCMATGMTCATGTTGAG GGGGTTGCTGATCTTGGTATTTTCCGGGTCATGGGGCMCCCMCCT
权利要求
1.一种金属镉抗性相关蛋白DbsCzcA,其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示。
2.权利要求I所述金属镉抗性相关蛋白DbsCzcA在治理环境镉污染中的应用。
3.权利要求I所述金属镉抗性相关蛋白DbsCzcA的编码基因，其特征在于核苷酸序列如 SEQ ID NO:2 所示。
4.权利要求3所述金属镉抗性相关蛋白DbsCzcA的编码基因在治理环境镉污染中的应用。
5.含有权利要求3所述金属镉抗性相关蛋白DbsCzcA的编码基因的表达载体。
6.根据权利要求5所述载体，其特征在于出发载体为pET28a。
7.一种基因工程菌，其特征在于是由权利要求6所述的表达载体转染大肠杆菌得到的。
8.权利要求7所述基因工程菌在治理环境镉污染中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于环境镉污染中的镉离子浓度为200剛以下。
全文摘要
本发明公开了一种金属镉抗性相关蛋白DbsCzcA及其编码基因和应用。该镉抗性相关蛋白DbsCzcA氨基酸序列如SEQIDNO:1所示，其编码基因如SEQIDNO:2所示。通过转化大肠杆菌实验证明该基因在大肠杆菌中的表达可以提高其对重金属镉的抗性。本发明的DbsCzcA编码基因可用于提高微生物和植物对重金属镉的抗性，进一步用于清除环境重金属污染，为生物修复提供性能优良的生物资源。
文档编号C02F3/00GK102603873SQ20121007983
公开日2012年7月25日 申请日期2012年3月22日 优先权日2012年3月22日
发明者俞陆军, 廖斌, 束文圣, 胡敏, 许光远, 谢丽娟, 陈亮 申请人:中山大学