一种重金属镉的荧光检测体系以及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及重金属检测领域，尤其涉及一种可以特异性识别重金属镉的荧光检测 体系。
【背景技术】
[0002] 镉作为人体非必要元素是毒性最强的重金属元素之一，由于工业废物排放、污水 灌溉、大气沉降和长期施用磷肥等原因，成为农田环境中最严重且普查超标率最高的污染 物，农田环境中的镉通过农作物或其他途径进入食物链，通过食物链在人体内富集，对人体 组织和大脑均有很强的毒性。因此，国内外相关机构均制定了严格的限量标准，这对痕量镉 的检测提出了非常高的要求，尤其是快速、低成本、灵敏度高且选择性好的重金属镉检测方 法显得极为重要。
[0003] 目前，国内外镉的分析方法主要包括原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质谱法、 电感耦合等离子发射光谱法、阳极溶出伏安法、高效液相色谱法、酶分析法、生物传感器、免 疫分析法、核酸适配体法、试纸法。传统检测方法中原子吸收光谱法是目前重金属元素镉测 定最常用的方法之一，其中火焰法原子吸收法较石墨炉法检出限要低一至两个数量级，较 适宜应用于镉含量较高的样品（如废水和受污染的水样），而对于镉含量较低的样品，需增 加萃取预富集前处理;石墨炉法检出限低，灵敏度高，但基体干扰严重，较适用于背景值低 的样品分析，不适用于难消解和基体背景值高的样品；电感耦合等离子发射光谱法具有分 析速度快，灵敏度高，准确度精密度高，测定范围广的优点，但不足之处在于设备和操作费 用较高，易污染;高效液相色谱法可实现多元素同时测定，但是络合剂选择有限，给该方法 带来了局限性。且传统方法所需仪器价格昂贵，对操作人员、实验环境、前处理均有较高的 要求，不适合在基层现场实时在线检测。目前，针对重金属镉的快速在线检测快速检测方法 有了较快的发展，其中以酶分析法灵敏度最高，但选择性较差，对单一重金属离子的检测存 在一定的困难，且检测限较高，不适于痕量镉的检测；生物传感器检测重金属的方法发展迅 速，灵敏度、自动化程度高，可应用于环境在线监测，但传感器制作工艺较难，成本相对较 高;试纸法与检测管、试剂盒相比，因其便宜、简便在化学快速检测中应用较多，但试纸或其 他载体都存在着承载反应试剂量有限的问题，检出限相对较高。
[0004] 核酸适配体(aptamer)，又称适体，是应用新型组合化学技术-指数富集配基的系 统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)体 外筛选得到单链寡聚DNA或RNA分子。其特殊而稳定的三维结构，可以通过空间构型互补高 亲和力、高特异性与不同靶物质结合，这种结合方式与抗体和抗原结合类似，但又不同于抗 体，避免了蛋白质在制备和储藏中的缺点，是一种具有很高的选择性、特异性、亲和性的特 殊"化学抗体"，可以区分结构及其相似的物质，因此受到众多国内外学者的极大关注。核酸 适配体检测重金属具有较好的检测稳定性、检测成本低、灵敏度高，具有广泛的应用性。由 于其分子量较小、可化学合成、稳定性好、没有毒性等优点，利用核酸适配体检测重金属是 近年来研究的热点。而目前将核酸适配体应用于重金属检测中最多的还是在Hg 2+和Pb2+的 检测，Cu2+、K+的适配体传感器也有一些文献报道，而将核酸适配体应用于Cd2+的检测有待进 一步研究。
【发明内容】
[0005] 本发明克服现有技术的缺陷，提供了一种可特异性识别重金属镉的荧光检测体 系。
[0006] 具体而言，本发明提供的检测体系中，包含可特异性识别重金属镉的核酸适配体 和荧光染料。
[0007] 所述重金属镉的特异性适配体是一段寡聚核苷酸，其序列为：5 ' -ACCGACCGTGCTGGACTCTGGACTGTTGTGGTATTATTTTTGGTTGTGCAGTATGAGCGAGCGTTGCG-3 ' ；该核 苷酸可以形成发夹型结构，与重金属镉特异性结合，且两端无需其他标记序列，经HPLC纯化 的0嫩单链，用含1禮1%(：1 2(?!18.5)的1〇111111〇1/1的1^(?!17.4)溶液来稀释，再根据所需浓 度用纯水稀释使用。
[000S]同样的方法获得适配体序列的互补链，其序列如下：5 ' -CGCAACGCTCGCTCATACTGCACAACCAAAAATAATACCACAACAGTCCAGAGTCCAGCACGGTCGGT-3' 〇
[0009] 荧光法是一种灵敏度较高的检测方法;然而，本发明通过大量实践发现，对于本发 明的检测对象镉以及选用的特异性适配体而言，如果采用将荧光染料标记到识别配体上的 常规检测手段，可能导致适配体DNA空间结构和特异性结合位点的改变，在适配体识别靶标 重金属镉时，会使检测的特异性和灵敏度受到影响，准确性下降。
[0010] 为了实现本发明预期的灵敏度和准确性，本发明利用非标记的核酸适配体与游离 状态下的荧光染料共同构建检测体系，所述荧光染料独立存在于体系中，无需标记到核酸 适配体上，因此避免了标记型荧光染料对适配体结构和结合性能的干扰，使高特异性的核 酸适配体和高灵敏度的荧光检测发挥协同作用。
[0011] 同时，本发明为了避免游离型荧光染料准确性不佳、结果误差偏大的潜在缺陷，将 荧光染料优选为嵌入式dsDNA荧光染料Picogreen。
[0012] 本发明通过大量实践发现，采用由所述非标记核酸适配体和游离型荧光染料 Pi cogreen构建的体系对重金属镉进行检测，灵敏度高，特异性好，结果准确度高， Picogreen荧光染料可以成功嵌入本发明所述核酸适配体及其互补链构成的双链结构，从 而使引发的荧光强度急剧增加，效果优于其它常用的荧光染料;本发明同时发现，所述检测 体系可以耐受待测环境中一定浓度的盐、尿素、乙醇、氯仿、去垢剂、蛋白等干扰，具有很强 的环境适应性。
[0013] 在所述核酸适配体的基础上，本发明进一步提供了一种重金属镉的荧光检测方 法，所述方法以核酸适配体作为镉的特异性识别分子，以荧光染料作为介质，采用荧光强度 分析法检测镉离子的浓度。
[0014] 所述检测方法的原理如图1所示，当溶液中存在适配体DNA的目标物镉离子时，镉 适配体的构象发生变化，单链DNA "stem-loop"区域形成特定的立体结构，特异性高亲和力 地与镉结合;随后，加入适配体DNA的互补链和Picogreen，互补链将与溶液中没有集合目标 物的游离适配体结合，形成双链DNA，Pic 〇green嵌入双链DNA的双螺旋小沟，并发射出荧光 信号，从而通过对荧光强度的分析来测定目标物镉的浓度，镉的浓度与荧光强度成反比。利 用对溶液的进行吸光度测定，即可通过目标物浓度和吸光度建立线性关系。
[0015] 所述焚光强度的检测波长优选为Ex/Em = 480nm/530nm。
[0016] 具体而言，本发明所述检测方法包括以下具体步骤：
[0017] 在多个已知镉浓度的标准溶液及镉浓度为0的对照溶液中分别加入适配体DNA，混 匀孵化后各自加入所述适配体的互补链DNA，再分别加入荧光染料，充分反应后，分别检测 荧光强度；
[0018] 以标准溶液的镉浓度对数为横坐标，以所述各标准溶液与对照溶液的荧光强度之 比为纵坐标，获得线性回归方程；
[0019] (2)取待测溶液，采用与步骤(1)相同的检测方法检测荧光强度；
[0020] (3)将步骤(2)所得待测溶液的荧光强度值代入步骤（1)所得线性回归方程中，计 算得到待测溶液中的镉浓度。
[0021] 由于实际情况下待测水体中镉离子浓度较低，在实时监测过程中镉离子的浓度变 化幅度较小，为了确保检测的灵敏性和准确性，本发明优选在待测溶液中加入镉的标准溶 液，获得加标待测溶液，采用外标法进行检测。本发明优选所述加标待测溶液的镉浓度为10 ~500ng/mL;进一步优选所述加标待测溶液的镉浓度为20~200ng/mL。
[0022] 本发明