具有好氧反硝化能力的海洋盐单胞菌菌株hgmn521及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有好氧反硝化能力的海洋盐单胞菌菌株HGMN521，该菌株的保藏名称：盐单胞菌HGMN521，分类命名：Halomonas?sp?HGMN521，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2009年8月28日，保藏号：CCTCC?NO：M209187，保藏地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心；还公开了该菌株HGMN521在处理受无机氮污染海水中的应用。该菌株在好氧条件下具有高效反硝化能力，能快速有效的去除受无机氮污染海水中的亚硝酸盐氮（NO2--N）及硝酸盐氮（NO3--N），且对海水养殖生物没有毒害致病作用，具有安全、环保、高效的特点。
【专利说明】具有好氧反硝化能力的海洋盐单胞菌菌株HGMN521及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物【技术领域】，具体涉及一种具有好氧反硝化能力的海洋盐单胞菌菌株HGMN521及其应用。
【背景技术】
[0002]近年来，在海水网箱养殖产业飞速发展的同时，网箱养殖“自身污染”问题日益凸现出来，不但对邻近海域生态环境造成了严重负面影响，反过来又制约了海水养殖生产本身。海水网箱养殖系统作为一种高密度、高投饵的人工养殖生态系统，其输出的废物，残饵、代谢及排泄废物等是引发环境问题的主要污染源，最后导致养殖区海水富营养化，为赤潮的发生提供了物质基础，成为赤潮发生的诱因。近年来我国近岸海域赤潮发生的频率、波及范围和危害程度呈逐年上升趋势，其中有害赤潮的爆发对环境、经济和人体健康造成的影响尤为严重。调查发现，大部分富营养化海水中氮、磷含量十分丰富，尤其以无机氮污染最为严重，其中近岸海域中无机氮超II类海水水质标准的海域占52%。网箱养殖与水域生态环境的矛盾的日趋突出，养殖对水域环境的要求使得对海水网箱养殖环境修复的研究极其迫切。
[0003]近年来国内外对氮污染的治理日益重视，当前已经有许多物理化学方法可以实现污染水体中硝酸盐的去除。譬如，离子交换，反渗透和电渗析等都是很有效的处理技术。但是利用这些工艺的主要缺点就是成本昂贵，而且如何处理由这些工艺本身产生的高浓度的硝酸盐废水也是一个问题。利用生物反硝化方法去除硝酸盐氮是脱除氮素污染的一种经济有效的方法。为达到对海水网箱养殖环境中无机氮污染的快速、高效去除，从海水网箱养殖沉积环境中分离纯化获得微生物，并用于对无机氮污染的有效治理，是目前研究的方向。
【发明内容】
[0004]本发明的第一个目的在于提供一种具有好氧反硝化能力的海洋盐单胞菌菌株HGMN521，该菌株在好氧条件下具有高效反硝化能力，能快速有效的去除无机氮污染海水中的亚硝酸盐氮(NO2--N)及硝酸盐氮(NO3--N),成本低且环保。
[0005]本发明的第二个目的在于提供上述具有好氧反硝化能力的海洋盐单胞菌菌株HGMN521在处理受无机氮污染海水中的应用。
[0006]本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的:一种具有好氧反硝化能力的海洋盐单胞菌菌株HGMN521，该菌株的保藏名称:盐单胞菌HGMN521，分类命名:Halomonassp HGMN521，保藏单位:中国典型培养物保藏中心，保藏日期:2009年8月28日，保藏号:CCTCC NO:M209187，保藏地址:湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心。
[0007]作为本发明的一种优选的实施方式，本发明所述的具有好氧反硝化能力的海洋盐单胞菌菌株HGMN521的筛选分离鉴定过程为:取海水鱼类网箱养殖场区的沉积物，在实验室利用富集基和选择培养基培养后，并分离纯化菌株，根据菌株对亚硝酸盐氮(NO2--N)及硝酸盐氮(no3_-n)还原能力的强弱，筛选出对无机氮好氧反硝化能力强的菌株，并最终筛选出一株对亚硝酸盐氮(Ν02_-Ν)及硝酸盐氮(N03_-N)还原能力强的菌株，编号为HGMN521，然后根据菌株的菌落形态特征、培养特征和生理生化特征，及其16SrDNA基因序列经与Genbank中已登陆的基因序列进行对比分析发现，菌株HGMN521经鉴定为盐单胞菌属，命名为盐单胞菌(Halomonas sp.) HGMN521 ?
[0008]本发明的第二个目的是通过如下技术方案来实现的:上述具有好氧反硝化能力的海洋盐单胞菌菌株HGMN521在处理受无机氮污染海水中的应用。
[0009]作为本发明的一种优选的实施方式:在处理受无机氮污染海水中的具体过程为:取经上述分离纯化的盐单胞菌(Halomonas sp.) HGMN521单菌落，于活化培养基中培养20-24h，按海水与菌液体积比为40-60:1，将盐单胞菌(Halomonassp.)HGMN521接种于含高浓度亚硝酸盐氮(Ν02_-Ν)和硝酸盐氮(N03_-N)的海水中，pH范围7.6-8.2，20-28°C恒温振荡培养3-10d。
[0010]本发明上述活化扩大培养中培养基的较佳组成为:葡萄糖10g，柠檬酸钠5g，醋酸钠1.5g,氯化铵1.0g,硝酸钾1.0g,磷酸氢二钠0.6g，磷酸二氢钾0.4g，硫酸镁0.1g,氯化亚铁 0.lg，酵母膏 0.5g,陈海水 1000mL, ρΗ7.6-8.2，121°C灭菌 20min。
[0011]与现有技术相比，本发明具有以下优点:本发明从海水网箱养殖区沉积物中筛选得到的新菌株，在好氧条件下具有高效反硝化能力，具有良好的去除受无机氮污染海水中亚硝酸盐氮(Ν02_-Ν)和硝酸盐氮(Ν03_-Ν)的能力，能在3-10d内几乎完全去除海水中的亚硝酸盐氮(Ν02_-Ν)和硝酸盐氮(Ν03_-Ν)。该新菌株对海水养殖生物斑节对虾(Penaeusmonodon)奸苗和黑鲷(Sparus macrocephalus)仔鱼没有毒害致病作用，对去除海水养殖环境中高浓度无机氮污染具有安全、环保、高效的特点。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1是实施例2中菌株HGMN521的PCR产物琼脂糖电泳图；
[0013]图2是实施例3中菌株HGMN521菌株的电镜图片；
[0014]图3是菌株实施例5中HGMN521在以亚硝酸盐氮(Ν02__Ν)为唯一氮源培养基下的降解效率图；
[0015]图4是实施例5中菌株HGMN521在以硝酸盐氮(Ν03__Ν)为唯一氮源培养基下的降解效率图。
【具体实施方式】
[0016]下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但不以任何形式限制本发明。
[0017]实施例1具有好氧反硝化能力的海洋菌株的筛选
[0018]一、材料准备
[0019]1、菌源和实验废水
[0020](1)菌 源:有20多年养殖历史的深圳市大鹏澳海水鱼类网箱养殖场区的沉积物。
[0021](2)实验废水A (高浓度硝酸盐氮(Ν03_-Ν)海水):硝酸盐钠2.6g，葡萄糖36g，酵母膏 0.5g,陈海水 1000mL, ρΗ7.6 ~8.2，121°C灭菌 20min。
[0022](3)实验废水B (高浓度亚硝酸盐氮(Ν02_-Ν)海水):亚硝酸盐钠2.lg，葡萄糖36g，酵母膏 0.5g,陈海水 1000mL, ρΗ7.6 ~8.2，121°C灭菌 20min。
[0023]2、培养基
[0024](I)选择培养基:葡萄糖24g，柠檬酸钠14.7g，硝酸钾6.7g，氯化铵4.7g，磷酸二氢钾 1.8g,陈海水 1000mL, 121°C灭菌 20min。
[0025](2)分离及斜面培养基:葡萄糖10g，柠檬酸钠5g，醋酸钠1.5g，氯化铵1.0g，硝酸钾1.0g,磷酸氢二钠0.6g,磷酸二氢钾0.4g,硫酸镁0.1g,氯化亚铁0.1g,酵母膏0.5g,琼脂粉 20g,陈海水 1000mL, ρΗ7.6 ~8.2，121°C灭菌 20min。
[0026](3)活化扩大培养基:葡萄糖10g，柠檬酸钠5g，醋酸钠1.5g，氯化铵1.0g，硝酸钾
1.0g,磷酸氢二钠0.6g,磷酸二氢钾0.4g,硫酸镁0.1g,氯化亚铁0.lg，酵母膏0.5g,陈海水1000mL, ρΗ7.6 ~8.2，121。。灭菌 20min。
[0027](4)硝酸盐氮(NO3--N)还原培养基:肉汁胨 lOOOmL，KNO3Ig, ρΗ7.0 ~7.6，121°C灭菌 20min。
[0028](5)亚硝酸盐氮(Ν02_-Ν)还原培养基:牛肉膏10g，蛋白胨5g，NaNO2Ig,蒸馏水1000mL, ρΗ7.3 ~7.4，121。。灭菌 15min。
[0029]3、实验仪器和设备
[0030]广东海利电磁式空气压缩机AC0-009E ;
[0031]苏州安泰超净工作台SW-CJ-1BU ;
[0032]上海精宏生化培养箱SHP-150 ；
[0033]苏州欧倍振荡培养箱0BS-2F ；
[0034]德国HYDR0-B10S-KIEL 采泥器；
[0035]日本HIRAYAMA高压灭菌器HVN-85 ；
[0036]美国LaChat流动注射分析仪QC8000 ；
[0037]日立H-7650透射电子显微镜；
[0038]PC818 型 PCR 仪；
[0039]电泳仪及电泳槽；
[0040]凝胶紫外观测仪等。
[0041]二、菌株的分离与筛选
[0042]1、菌株的富集
[0043]取大鹏澳海水鱼类网箱养殖场沉积物表层以下5cm处的沉积物放入采样袋，再放入(TC冰盒中带回实验室。取250g沉积物加到2L的富集瓶中，加入750mL选择培养基，并加入适量的纤维棉，在室温条件下间歇曝气富集培养2个月，中间据情况不定期添加灭菌海水和选择培养基。
[0044]2、菌株的分离纯化
[0045]挑选并直接冲洗细菌附着量较大的纤维棉，得到富集菌液，适当稀释，均匀涂布于分离培养基平板上，28°C培养3d，待菌落长出后，挑取形态各异的单菌落，在分离培养基平板上进行划线分离，直至得到纯的单菌落。将分离纯化的细菌接种至斜面培养基中并于冰箱4°C保存。
[0046]3、好氧反硝化细菌的筛选
[0047] 通过对亚硝酸盐氮(Ν02_-Ν)和硝酸盐氮(Ν03_-Ν)还原能力的反应，挑选对亚硝酸盐氮(NOf-N)和硝酸盐氮(NOf-N)都具有利用效果的菌株。
[0048]亚硝酸盐氮(Ν02_-Ν)还原反应:将分离纯化的菌株接种于液体亚硝酸盐氮(Ν02_-Ν)还原培养基中，28°C培养3d，滴加格里斯氏试剂，若培养基中红色消失为亚硝酸盐氮(Ν02_-Ν)还原阳性，红色无变化则为阴性；
[0049]硝酸盐氮(NO3--N)还原反应:将分离纯化的菌株接种于液体硝酸盐氮(NO3--N)还原培养基中，28°C培养3d，滴加格里斯氏试剂、二苯胺试剂，当液体培养基中滴入格里斯氏试剂后，溶液如变为粉红色、橙色、棕色为硝酸盐氮(N03_-N)还原阳性；若无红色出现，滴加二苯胺试剂，此时若呈蓝色反应，则为硝酸盐氮(N03_-N)还原阴性，若不呈蓝色，按硝酸盐氮(Ν03_-Ν)还原阳性处理。
[0050]经过筛选获得一株编号为HGMN521的菌株，即海洋好氧反硝化菌株HGMN521。
[0051 ] 实施例2具有好氧反硝化能力的海洋菌株HGMN521的鉴定
[0052]1、对具有好氧反硝化能力的海洋菌株HGMN521的鉴定
[0053]对具有好氧反硝化能力的海洋菌株HGMN521进行了生理生化的鉴定以及16SrDNA分子的鉴定，从分子水平，并结合细菌形态学特征及生理生化特性分析确定菌株的种属。
[0054]16S rDNA序列分析主要按照以下步骤:
[0055]①.细菌核DNA的提取:
[0056]I)用高压灭菌的牙签挑单菌落接种于扩大培养基内培养过夜，取1.5mL菌液于Eppendorf管内，8000rpm室温离心5min,彻底除去上清。
[0057]2)加STE缓冲液1.5mL洗涤一次，离心弃上清，再加入0.6mLTE溶液，重悬细菌。
[0058]3)加 30 μ L10mg/mL 的溶菌酶，37°C水浴 45min。
[0059]4)加65 μ L10%的SDS，20mg/mL的蛋白酶K3 μ L，50°C水浴2h，至溶液变清。
[0060]5)加入等体积酚氯仿抽提三次，直至看不到蛋白质为止。
[0061]6)在上清液中加入1/10体积的3M的NaAc (pH5.2)。
[0062]7)加入等体积的异丙醇，沉淀DNA。用玻璃棒缠绕挑出DNA细丝，再用70%的乙醇洗涤一次，自然晾干，并将DNA溶于100 μ L TE溶液中。
[0063]8)加入终浓度为 50ug/mL 的 Rnase，37°C，30min,去除 RNA，_20°C保存备用。
[0064]②.16S rDNA基因的PCR扩增
[0065]Pl:27F (5' -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3/ )
[0066]P2:1492R (5' -AAG TCG TAA CAA GGT AAC C-3/ )
[0067]在50 μ L的反应体积中，加入I μ L模板DNA (0.lug), 0.5 μ LPl和Ρ2 (终浓度为
0.5yM),luL dNTP(每种 ΝΤΡ0.2mM)，0.5μ LTaq 聚合酶(2U)和 5 μ LlO X PCR 缓冲液。PCR扩增条件为:94°C预变性5min，在94°C变性30s，61_65°C退火30s，72°C延伸lmin，循环30次；最后72°C终延伸lOmin。
[0068]③.PCR产物的回收
[0069]将PCR产物以1%琼脂糖凝胶进行电泳后，在紫外灯下切取含欲回收片段的凝胶，放入1.5mL离心管中加2倍体积TE，65°C水浴IOmin后加等体积水饱和酚抽提一次离心后取上层水相再用酚-氯仿-异戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍体积的lOmol/L乙酸铵和2倍体积无水乙醇沉淀，离心，用70%乙醇洗沉淀一次，风干后溶于适量灭菌双蒸水。[0070]16S rDNA的部分序列测定和分析
[0071]P-f:CACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC ；
[0072]P-r:GGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC?
[0073]加入I μ L 模板 DNA ( < 0.lug)，PCR 扩增 30 个循环(94 °C lmin, 55 °C 30s,72 °C 2min)0采用ABI PRISM测序试剂盒中染料终止剂终止反应。然后，在AppliedBiosystem373A DNA测序仪上测序。测得的16S rDNA序列采用BLAST软件与GenBank数据库比较分析，最终从分子水平上确定该菌的种属。
[0074]2U6S rDNA 序列测定
[0075]本发明采用对16S rDNA序列测定和分析的方法对细菌进行分子水平的鉴定。以细菌的核DNA为模板，以16S rDNA基因的PCR扩增的通用引物为引物，进行PCR扩增，得到长度为1499bp的扩增带用1%琼脂糖凝胶电泳检测，如图1所示。PCR产物经纯化后，测定
其全序列。
[0076]AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG ATTGAACGCT GGCGGCAGGC CTAACACATG CAAGTCGAGC60
GGAAACGATC CTAGCTTGCT AGGAGGCGTC GAGCGGCGGA CGGGTGAGTA ACGCATAGGA120
ATCTGCCCGG TAGTGGGGGA TAACCTGGGG AMCCCAGGC TMTACCGCA TACGTCCTAC180
GGGAGAAAGC AGGGGCTCTT CGGACCTTGC GCTATCGGAT GAGCCTATGT CGGATTAGCT240
GGTTGGTGAG GTAATGGCTC ACCAAGGCGA CGATCCGTAG CTGGTCTGAG AGGATGATCA300
GCCACATCGG GACTGAGACA CGGCCCGAAC TCCTACGGGA GGCAGCAGTG GGGAATATTG360
GACAATGGGC GCAAGCCTGA TCCAGCCATG CCGCGTGTGT GMGAAGGCC CTCGGGTTGT420
AAAGCACTTT CAGTGGGGAA GAAATCCTCG GGGCTAATAC CCTCGAGGGA GGACATCACC480
CACAGAAGAA GCACCGGCTA ACTCCGTGCC AGCAGCCGCG GTAATACGGA GGGTGCGAGC540
GTTAATCGGA ATTACTGGGC GTAAAGCGCG CGTAGGCGGC CTGATAAGCC GGTTGTGAAA600
GCCCCGGGCT CAACCTGGGA ACGGCATCCG GMCTGTCAG GCTAGAGTGC AGGAGAGGAA660
GGTAGAATTC CCGGTGTAGC GGTGAAATGC GTAGAGATCG GGAGGAATAC CAGTGGCGAA720
GGCGGCCTTC TGGACTGACA CTGACGC TGA GGTGCGAAAG CGTGGGTAGC AAACAGGATTYbU
AGATAGCCTG GTAGTCCACG CCGTAMCGA TGTCGACTAG CCGTTGGGGT CCTTGAGACC840
TGTGTGGCGC AGTTAACGCG ATAAGTCGAC CGCCTGGGGA GTACGGCCGC AAGGTTAAAA900
CTCAAATGAA TTGACGGGGG CCCGCACAAG CGGTGGAGCA TGTGGTTTAA TTCGATGCAA960
CGCGAAGAAC CTTACCTACC CTTGACATCG AGAGAACTTG GCAGAGATGC CTTGGTGCCT1020
TCGGGAACTC TCAGACAGGT GCTGCGTGGC CGTCGTCAGC TCGTGTTGTG AMTGTTGGG1080
TTAAGTCCCG TAACGAGCGC AACCCTTGTC CCTATTTGCC AGCGATTCGG TCGGGAACTC1140
TAGGGAGACT GCCGGTGACA AACCGGAGGA AGGTGGGGAC GACGTCAGGT CATCATGGCC1200
CTTACGGGTA GGGCTACACA CGTGCTACAA TGGCCGGTAC AAAGGGTTGC GMGCCGCGA1260
GGTGGAGCCA ATCCCGAMA GCCGGTCTCA GTCCGGATCG GAGTCTGCAA CTCGACTCCG1320
TGAAGTCGGA ATCGCTAGTA ATCGTGAATC AGAATGTCAC GGTGAATACG TTCCCGGGCC1380
TTGTACACAC CGCCCGTCAC ACCATGGGAG TGGACTGCAC CAGAAGTGGT TAGCCTAACT1440
TCGGAGGGCG ATCACCACGG TGTGGTTCAT GACTGGGGTG AAGTCGTAAC AAGGTAACC1499
[0077]实施例3具有好氧反硝化能力的海洋菌株HGMN521菌落形态、生理和生化特征
[0078]具有好氧反硝化能力的海洋菌株HGMN521菌落形态、生理和生化特征见表1_1 ;细胞形态见图2。
[0079]表1-1具有好氧反硝化能力的海洋菌株HGMN521的菌落形态特征以及主
[0080]要的生理生化特征
[0081]
【权利要求】
1.一种具有好氧反硝化能力的海洋盐单胞菌菌株HGMN521，其特征在于:该菌株的保藏名称:盐单胞菌HGMN521，分类命名:Halomonas sp HGMN521，保藏单位:中国典型培养物保藏中心，保藏日期:2009年8月28日，保藏号:CCTCC NO:M209187，保藏地址:湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心。
2.权利要求1所述的具有好氧反硝化能力的海洋盐单胞菌菌株HGMN521在处理受无机氮污染海水中的应用。
【文档编号】C02F3/34GK103981124SQ201410138167
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年4月8日 优先权日:2014年4月8日
【发明者】古小莉, 黄洪辉, 孟霞, 廖秀丽 申请人:中国水产科学研究院南海水产研究所