一种盐藻培养废液的高附加值处理方法与流程

本发明涉及藻类植物的培养废液处理及循环利用方法，特别是涉及盐藻高密度培养废液中有益多糖、甘油的提取方法和废液重复利用的方法。

背景技术：

杜氏盐藻，又称盐藻，是一种无细胞壁、有鞭毛的单细胞藻类，并且是最能耐受高盐的真核生物之一。因盐藻培养时所需的盐浓度比较高，所以培养废液中残余的盐浓度较高而不能随意排放。并且废液中含有较多的胞外多糖和甘油等高附加值产物，这些代谢产物有比较高的经济价值，直接被排放掉，造成资源浪费。因此探寻一种盐藻培养废液的高附加值处理方法具有重要的意义。

在中国，盐藻有很长的培养历史，因其具有生长速度快、可积累大量的有益代谢产物等特点，使得盐藻受到人们的关注。盐藻在胁迫环境中(高温、高盐和/或高光)可积累大量的β-胡萝卜素，最多高达藻细胞干重的14％。β-胡萝卜素能防治癌症、肿瘤和心血管疾病以及老年痴呆和白内障等与年龄有关的退化性疾病；盐藻在胁迫环境中还可积累大量的甘油，含量最高达80％，天然甘油是优质的化妆品原料，同时也是化工、轻工和医药工业的重要原料；杜氏藻多糖复合物具有较强的药物生物活性，在免疫佐剂活性方面能与完全福氏佐剂相似，能够明显的增强抗原性和机体免疫功能、增强机体巨噬细胞的吞噬功能提高机体免疫力、抑制实体瘤细胞的生长，其抑制率高达60％以上。另外，盐藻细胞能够大量积累蛋白质，含量高达细胞干重的50-60％，其中包括人类必需的氨基酸在内的18种氨基酸，是一种优良的蛋白饲料和人类食品加工原料；另外，现代药理学研究表明，盐藻和类胡萝卜素还具有潜在的免疫调节、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化以及预防脂肪肝等多种药理活性。因此，盐藻的大量和高密度培养已经引起了研究人员的极大关注。但是，随着盐藻等微藻的大量培养，其培养废液的处理问题也逐渐突出，如废液中盐度较高，随意排放会造成环境污染、土壤板结盐化、影响动植物的生长，并且造成了资源的浪费、降低了经济效益。如2011年盐藻培养的卤水约2万立方米，也就是2万立方米污水，如果通过本方法处理，可以节约60％的水资源。

但是目前用于微藻养殖废液处理的方法非常少，目前并没有盐藻废液中可溶性多糖、甘油提取方法的相关专利，经查询，文献中大多是在收集分离细胞后直接补充培养基用于微藻的培养，通过调查专利情况如下：

专利(CN2338338)“微藻废水处理装置”，该专利提供了一种微藻的培养废水的处理装置，其特点是将反应器、废水供入部分、再生液供给部分以及排水放空阀等结合起来并添加通气与光照设施，但是培养液中的甘油、多糖并未处理，使得藻液的粘度增加，影响微藻生长。

在一些文献中有相关报道是通过聚丙烯中空纤维膜法收集盐藻细胞，其分离清液未经进一步处理，便添加卤水继续用作盐藻培养。这种方法的特点是完成了盐藻废液的再次利用，但是其中某些元素用量无法确定，养殖效果不好，废液中的多糖、甘油、蛋白未清除，会使废液在养殖过程更加容易染杂菌，从而降低效率。

文献“均匀设计优化盐藻多糖提取工艺”薛巧如等，提出最适条件为70℃，pH值8，液料比18：1，处理300分钟，糖得率最高达到7.98％。文献“盐藻水溶性多糖的提取与纯化”刘云鹤等，盐藻多糖的提取工艺中指出最适提取温度是85℃，提取时间300分钟，液料比20：1，多糖得率13.09％。但是，这两篇文献都是基于盐藻细胞(干粉或者盐藻泥)的多糖提取方法，适宜于多糖含量较高的实验，仅可借鉴于盐藻废液的蛋白、多糖甘油的去除，并且高温会导致盐藻多糖活性的降低。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种成本低廉、操作简单、并能提高盐藻经济效益、减少污水排放、减少环境污染、提高资源利用率、节约资源的绿色环保的盐藻废液的高附加值处理方法。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种盐藻培养废液的高附加值处理方法，其特征在于：将盐藻废液通过沙滤床过滤、大孔吸附树脂吸附洗脱，对盐藻废液中的盐藻多糖、甘油进行回收，并且将洗脱废液进行处理，补加营养可以用于盐藻的再次培养。

而且，所述大孔吸附树脂为X-5，处理方法为：取100g大孔树脂，用500mL蒸馏水充分润胀24h，之后沸水浴3h充分溶胀，冷却后湿法装柱，蒸馏水平衡2-3h。

而且，所述X-5吸附柱特性为：填料量设计为为7/10-8/10，流速设置为700L/h-900L/h，处理时间设置为9-11小时。

而且，所述处理的条件为首先收集细胞，然后将废液经过沙滤，阴性大孔树脂吸附柱吸附，洗脱，洗脱液收集用作得到盐藻多糖、甘油等有机物；滤过液补加营养用于盐藻培养。

而且，沙滤床设计为粒径为1.5-3mm，沙粒分布系数为k(60)-k(80)，厚度为0.6-0.8m，直径0.2-0.4m，平衡液面高度0.2-0.4m，透过液流速为1000～1500L/h。

而且，所述大孔吸附树脂吸附洗脱所用溶液盐浓度为2.5％，pH值为8.5，洗脱温度为35～40℃，洗脱流速为2000L/h。

而且，所述补加营养时添加微量元素和大量元素，成分如下

微量元素：H₃PO₃61.0mg/L，ZnCl₂4.1mg/L，CoCl₂.6H₂O 5.1mg/L，MnCl₂·4H₂O4.1mg/L，CuSO₄3.6mg/L，(NH₄)₆Mo₇O₂₄.4H₂O 38.0mg/L，FeCl₃·6H₂O 2.5mg/L；

补充大量元素：KCl 0.40g/L，MgSO₄0.80g/L，KNO₃0.50g/L，KH₂PO₄0.04g/L，NaHCO₃0.21g/L，CaCl₂0.02g/L；

而且，具体步骤如下：

⑴废液的前处理及通过滤柱条件：将废液经过沙滤，沙滤床设计为砂粒粒径为1.5～3mm，沙粒分布系数为k(60)～k(80)，厚度为0.6～0.8m，直径0.2～0.4m，平衡液面高度0.2～0.4m；

⑵流速设置为1000～1500L/h，经过沙滤处理后的废液进入大孔树脂层析柱；

⑶称取12～18kg大孔树脂X-5干粉，加入55～70L蒸馏水，浸泡18～20h，然后沸水浴3h使大孔树脂X-5充分润胀，待冷却后冲洗3次，进行减压脱气，湿法装柱，之后用5％盐酸浸泡1～2h，水洗至中性，而后用2％氢氧化钠浸泡1～2h，水洗至中性，最后进行吸附；

⑷吸附柱设计为直径0.16～0.32m，柱长1.25～1.55m，填料量为柱体7/10～8/10，流速设置为700～900L/h；

⑸在处理9～11h后，对大孔树脂X-5吸附柱进行洗脱，洗脱液为pH＝8.5的含有0.15～0.20M氢氧化钠的0.8～1.2％氯化钠洗脱，洗脱温度为35～40℃，洗脱流速为1500～1800L/h，洗脱体积为柱体体积的1.8～3倍，洗脱液用于回收盐藻胞外多糖、甘油等；

⑹经过吸附处理后的滤液，补加营养成分(如下所示)，可继续用于盐藻培养；并确定废液处理后可重复利用2～3次。

本发明的优点和积极效果如下：

本发明将大规模生产采收完藻体后培养基的处理和回流：采收完藻体的培养基不能直接回流到培养池直接使用，需经过沉淀过滤，之后经过沙滤、过滤柱分离除去盐藻分泌的多糖和甘油、蛋白等有机成分后，补加营养元素后方可回流至培养池继续使用。

本发明提供了一种盐藻培养废液的高附加值处理方法，该方法中大孔树脂可以收集盐藻生长过程中分泌的胞外多糖和甘油，从而提高经济效益，减少培养废水的排放量，能够节约大量水资源，并且可以通过补充营养元素保证盐藻的生长和繁殖。

本方法能够获得盐藻胞外多糖和盐藻天然甘油这些高附加值产物，并且减少了盐藻培养废水的排放，减轻环境污染，盐藻废水处理后可以重复利用，节约了水资源和矿物质资源，减少了成本，极大的提高了经济效益。

附图说明

图1为本发明盐藻培养废液高附加值处理方法流程图；

图2为回收得到的多糖以及甘油样品图片，图2-a为多糖，图2-b为甘油；

图3为滤过液的重复利用次数对盐藻生物量的影响图，图3-a图表示细胞数，图3-b图表示干重；

图4为滤过液的不同利用次数对盐藻类胡萝卜素积累的影响图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明将盐藻培养废液经过沙滤，X-5大孔树脂吸附，洗脱收集得到盐藻胞外多糖、甘油等，滤过液通过补充营养成分可重复利用，回收提取盐藻胞外多糖以及甘油，并回收得到盐藻胞外多糖8.59mg/L，甘油2.87mg/L，回收效率分别为11.6％和7.8％。滤过液中多糖、甘油、蛋白质残留量的残留量分别低于未处理废液的10％、12％、5％。

确定第1次回收的滤过液用作二次培养时有助于盐藻的生长，滤过液回收利用2到3次后生长促进效果不显著，与新鲜培养基类似。3次重复利用后不适宜用于盐藻培养。

一种盐藻培养废液的高附加值处理方法，步骤如下：

⑴废液的前处理及通过滤柱条件：将废液经过沙滤，沙滤床设计为砂粒粒径为1.5～3mm，沙粒分布系数为k(60)～k(80)，厚度为0.6～0.8m，直径0.2～0.4m，平衡液面高度0.2～0.4m。

⑵流速设置为1000～1500L/h，经过沙滤处理后的废液进入大孔树脂层析柱。

⑶称取12～18kg大孔树脂X-5干粉，加入55～70L蒸馏水，浸泡18～20h，然后沸水浴3h使大孔树脂X-5充分润胀，待冷却后冲洗3次，进行减压脱气，湿法装柱，之后用5％盐酸浸泡1～2h，水洗至中性，而后用2％氢氧化钠浸泡1～2h，水洗至中性，最后进行吸附。

⑷吸附柱设计为直径0.16～0.32m，柱长1.25～1.55m，填料量为柱体7/10～8/10，流速设置为700～900L/h。

⑸在处理9～11h后，对大孔树脂X-5吸附柱进行洗脱，洗脱液为pH＝8.5的含有0.15～0.20M氢氧化钠的0.8～1.2％氯化钠洗脱，洗脱温度为35～40℃，洗脱流速为1500～1800L/h，洗脱体积为柱体体积的1.8～3倍，洗脱液用于回收盐藻胞外多糖、甘油等。

⑹经过吸附处理后的滤液，补加营养成分(如下所示)，可继续用于盐藻培养。并确定废液处理后可重复利用2～3次。

营养成分中的大量元素(g·L^-1)：

KNO₃ 0.50g；KCl 0.4g；NaHCO₃ 0.21g；KH₂PO₄ 0.04g；NaCl 6.00g；

MgSO₄ 0.80g。

营养成分中的微量元素(mg·L^-1)：

H₃PO₃ 61.0mg；ZnCl₂4.1mg；CoCl₂.6H₂O 5.1mg；MnCl₂·4H₂O 4.1mg；

CuSO₄ 3.6mg；(NH₄)₆Mo₇O₂₄.4H₂O 38.0mg；Na₂EDTA·2H₂O 2.09mg；

FeCl₃·6H₂O 2.44mg。

为了确定处理方法的各种参数，本发明做如下实施例实验。

实施例1

不同沙滤条件对过滤结果的影响

沙滤设置参数首先沙子粒径的选择范围是0.5～1.5，1.5～3，3～4.5mm，沙滤厚度为0.7m，确定1.5～3.5mm的沙滤滤液无固体悬浮颗粒；流速设置范围为200～500L/h，500～1000L/h 1000～1500L/h，1500～2000L/h，证明1000～1500L/h过滤滤液澄清，放置后无固体沉淀并且效率较高；

实施例2

不同滤柱条件对过滤结果的影响

⑴设置填料量比为8/10，流速设置为500L/h、600L/h、700L/h、800L/h、900L/h、1000L/h，处理5小时，实验结果表明：流速为700L/h～900L/h时盐藻胞外多糖与甘油吸附率分别为89％左右和58％左右，有利于吸附效率；

⑵设置不同处理时间确定处理量：5～7h、7～9h、9～11h、11～13h，处理时间为9h～11h时，盐藻多糖以及甘油的吸附率分别为86％左右和55％左右；

实施例3

不同洗脱条件的确定

⑴在经过大孔树脂X-5吸附柱处理10h后，进行洗脱，洗脱条件设置氯化钠浓度为0.5％～1％、1％～2％、2％～3％、3％～4％，在温度为25℃时，用pH值为7的洗脱液以1500L/h的流速洗脱3h。结果证明，盐浓度为2％～3％时，洗脱率为70％以上；盐藻胞外多糖以及甘油的得率分别为9.4％和7.6％。

⑵设定洗脱液pH值范围分别为pH＝5～6、6～7、7～8、8～9，洗脱盐浓度为2.5％、温度为25℃、流速1500L/h洗脱3h，pH值为8时，洗脱率为76％以上；盐藻胞外多糖以及甘油的回收率分别为9.6％和7.7％。

⑶洗脱温度设置范围为20～25℃，25～30℃、30～35℃、35～40℃、40～45℃、45～50℃，在洗脱盐浓度为2.5％、pH为8条件下以1500L/h流速洗脱3h；洗脱温度为35℃～40℃时，洗脱率达到81％，盐藻多糖与甘油回收率分别为10.5％和7.8％；

⑷流速设置分别为750L/h、1000L/h、1500L/h、2000L/h、2500L/h、3000L/h，在盐度为2.5％、温度40℃、pH为8.5条件下洗脱，洗脱总体积为4500L；当流速为2500L/h时，洗脱率为100％，盐藻多糖与甘油回收率为11.4％和7.8％；

洗脱条件设置为盐浓度2.5％，洗脱液pH值设置为8，洗脱温度为38℃，洗脱流速为2500L/h，洗脱时间3小时，盐藻胞外多糖以及甘油的回收率分别为11.6％和7.8％。

实施例4

不同利用次数对盐藻生物量的影响

按照盐藻培养基配方补加微量元素与大量元素，处理后滤过液分别利用1次～4次4个实验组，每个实验组3个平行，每2天测定细胞数；培养25天后，取200mL藻液，收集细胞，于90℃烘箱烘干5小时，称量干重；如图4，第一二次循环利用有利于盐藻生长，第三次可以作为培养基使用。

实施例5

盐藻积累类胡萝卜素的检测和β-类胡萝卜素含量的分析

在培养20天后，收集不同循环次数的培养基中的盐藻细胞，利用丙酮法对盐藻细胞进行处理后，按照Lichtentaler and Wellburn formus计算盐藻细胞中类胡萝卜素的含量。第一次利用时，类胡萝卜素的积累量为289.4mg/L，第二次为196.7mg/L，当重复利用第3次时，类胡萝卜素的积累量为99.1mg/L，而对照组盐藻积累的类胡萝卜素只有98.3mg/L，利用3次之后类胡萝卜素的积累量明显低于对照组，说明盐藻培养基在处理之后可以利用2-3次。