本发明涉及污染土壤治理领域，特别涉及一种铜污染土壤的联合修复方法。
背景技术：
：土壤不仅是地球生态圈的重要组成部分，也是人类赖以生存的重要自然资源。随着工农业生产的发展，土壤重金属污染愈加严重，土壤污染已成为倍受关注的公害之一。多年累积下来，人们面临的土地复垦与生态恢复问题已十分严重。土壤中铜污染传统的治理修复方法通常为物理和化学的方法，如稀释和覆土法、玻璃化技术、热处理技术、淋洗法、电化学法等，传统的修复方法虽然在治理效果明显，历时较短，但是存在成本高、不易管理、易造成二次污染的缺陷。节节草，属多年生草本植物，分布广泛。有研究报道显示，通过尾矿区节节草种群和盆栽试验研究得出节节草在cu、cd、zn、pb等单一或复合污染胁迫下能够不同程度增加重金属有机结合态含量，并降低重金属生物有效性(李影等,2010；王友保等,2006)。中国专利cn10867246a公开了一种高铜离子浓度污染土壤的修复方法，通过在污染土壤种植一年生对重金属具有富集作用的植物(藜、狗尾草、虎尾草、葎草)的方法，待收获期自根部进行收割、后处理以移除重金属。恰当利用植物修复重金属污染土壤能够有效移除重金属或降低其生物毒性，但对于污染程度较高区域，很难通过一年的植物种植富集、转运、移除重金属至国家标准水平，且反复栽种过程增加了资源的投入。技术实现要素：针对现有技术的不足，本发明提供了一种铜污染土壤的联合修复方法，其目的是利用微生物对污染土壤中难溶态或弱酸盐结合态的活化作用转化为植物体易吸收的可交换态铜离子，通过植物的生长繁殖在其体内富集重金属，进而将重金属移除，从而显著降低铜污染土壤中重金属含量，可用于不同程度铜污染土壤区域的修复。为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：一种铜污染土壤的联合修复方法，包括以下步骤：将微生物菌剂按25～45kg/亩的施用量投加于铜污染土壤中并翻均；在含微生物菌剂铜污染土壤内种植节节草，利用微生物菌剂的活化作用以及节节草的对铜的吸收、富集联合移除土壤中的铜；其中，微生物菌剂为草酸青霉与黄蓝状菌混合孢子粉。优选地，所述草酸青霉与黄蓝状菌混合孢子粉的制备方法包括如下步骤：1)斜面培养将草酸青霉、黄蓝状菌原始菌种在无菌条件下分别接种于斜面培养基上，在26-28℃条件下培养48-72小时；2)摇床培养将步骤1)培养的菌种斜面上添加无菌水刮取孢子，并稀释成孢子含量为1×106-1×107cfu/ml的孢子悬液，无菌条件下分别接种于种子培养基中，在ph6.0～6.5、温度为26-28℃条件下，140-160r/min摇床培养18-24小时；3)发酵罐培养将步骤2)培养的菌种在无菌条件下以体积比为15％-18％的接种量接种于液体发酵培养基中，在ph6.0～7.0、罐压为0.05～0.06mpa、温度为26-28℃、通风量为1:0.6～0.8vvm的条件下，在培养72-96小时后，产生的菌丝体占总体积的20％时停止发酵；4)固体发酵产孢将步骤3)培养的菌丝体接种到固体发酵培养基上，培养168-180小时，停止发酵，得到混合固体发酵产物；5)将步骤4)所得固体发酵产物进行干燥、粉碎后制成草酸青霉与黄蓝状菌混合孢子粉。进一步地，所述斜面培养基配方为：葡萄糖20g/l、土豆汁200g/l和琼脂20g/l。优选地，所述种子培养基配方为蔗糖20-25g/l、蛋白胨5-7g/l、磷酸二氢钾0.2-0.3g/l、硫酸镁0.2-0.3g/l和氯化钠2-4g/l。优选地，所述液体发酵培养基配方为：淀粉20-25g/l、玉米粉5-6g/l、豆饼粉2-3g/l、蔗糖20-25g/l、蛋白胨5-6g/l、硫酸镁0.2-0.3g/l、氯化钠20-25g/l和消泡剂(v/v)0.05％-0.08％。优选地，所述固体发酵培养基配方为：将水稻秸秆、玉米粉、谷壳按重量比为7:2:1的比例混合组成固体料，再向固体料中加水混合，得到固体发酵培养基；其中，固体料与水的重量比为1:0.6-0.65。优选地，种植节节草后还包括进行周期性采收的步骤；所述采收发生在节节草长出18-22节时，采收方法为：距节节草根部5-10cm处收割，并采用水热液化的方法对植物体内富集的重金属铜进行分离提取。本发明的上述方案有如下的有益效果：(一)本发明提供一种针对铜污染土壤的联合修复方法，利用微生物菌剂的活化作用以及节节草的对铜的吸收、富集联合移除土壤中的铜，操作方式简单、成本低，适用于对铜污染区域的修复。(二)本发明提供的铜污染土壤的联合修复方法中，所采用的菌种草酸青霉、黄蓝状菌能够耐受重金属铜，且均具有产酸特性，通过两者菌体产酸功能协同进一步活化污染土壤中的弱酸结合态铜，使其转化为离子态或可交换态，并通过节节草的生长繁殖富集铜，进一步收获植物进行后处理以达到移除重金属铜的目的；此外，在孢子粉的制备过程中采用了混合固体发酵的方法，简化了操作步骤，节省时间资源。(三)本发明提供的铜污染土壤的联合修复方法中，节节草为多年生植物，通过一次种植，多年周期性采收即可达到逐步移除重金属铜的效果，节省资源；采用本发明的微生物-植物联合修复方法，操作简单易行，环保低耗，可显著降低铜污染土壤中重金属含量，可用于不同程度铜污染土壤区域的修复。具体实施方式为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。实施例1具体包括以下步骤：步骤一，将微生物菌剂按35kg/亩的施用量投加于铜污染土壤，使用翻耕机等机械设备翻匀，使微生物菌剂均匀分布于污染区域；所述微生物菌剂制备的具体步骤为：1)斜面培养：将草酸青霉、黄蓝状菌原始菌种在无菌条件下各挑取1环分别接种于斜面培养基上，在28℃条件下培养72小时；其中，斜面培养基配方为：葡萄糖20g/l、土豆汁200g/l、琼脂20g/l，ph自然；2)摇床培养：将步骤1)培养的菌种斜面上添加无菌水刮取孢子，并稀释成孢子含量为1×107cfu/ml的孢子悬液，无菌条件下分别接种于种子培养基中，在ph6.0-6.5、28℃条件下，140r/min摇床培养24小时；其中，所述种子培养基配方为：蔗糖20g/l、蛋白胨5g/l、磷酸二氢钾0.2g/l、硫酸镁0.2g/l、氯化钠2g/l；3)发酵罐培养：将步骤(2)培养的菌种在无菌条件下以体积比为15％的接种量接种于液体发酵培养基中，在ph6.0、罐压为0.05mpa、温度为28℃、通风量为1:0.6vvm的条件下，在培养72小时后，产生的菌丝体占总体积的20％时停止发酵；其中，所述液体发酵培养基配方为：淀粉20g/l、玉米粉6g/l、豆饼粉2g/l、蔗糖20g/l、蛋白胨6g/l、硫酸镁0.2g/l、氯化钠25g/l和消泡剂0.08％。4)固体发酵产孢：将步骤3)经过发酵罐培养后的菌丝体接种到固体发酵培养基上，培养168小时，停止发酵；其中，所述固体发酵培养基配方为：水稻秸秆、玉米粉、谷壳按7:2:1重量比混合组成的固体料中加入水，即得固体发酵培养基，固体料与水的重量比为1:0.6；5)将步骤4)中得到的混合固体发酵产物干燥、粉碎制备成草酸青霉、黄蓝状菌混合孢子粉；步骤二，在铜污染区内种植具有铜富集能力的植物-节节草，繁殖方式采用分株繁殖，种植密度为12株/m2。步骤三，在节节草长出18-22节时在距植物根部5-10cm处收割以移除重金属铜，并采用水热液化的方法对植物体内富集的重金属铜进行分离提取；在以上方法实施过程中，节节草采收后测定污染土壤中重金属铜的含量变化。实施例2具体包括以下步骤：步骤一，将微生物菌剂按35kg/亩的施用量投加于铜污染土壤，使用翻耕机等机械设备翻匀，使微生物菌剂均匀分布于污染区域；所述微生物菌剂制备的具体步骤为：1)斜面培养：将草酸青霉、黄蓝状菌原始菌种在无菌条件下各挑取1环分别接种于斜面培养基上，在26℃条件下培养48小时；其中，斜面培养基配方为：葡萄糖20g/l、土豆汁200g/l、琼脂20g/l，ph自然；2)摇床培养：将步骤1)培养的菌种斜面上添加无菌水刮取孢子，并稀释成孢子含量为1*106cfu/ml的孢子悬液，无菌条件下分别接种于种子培养基中，在ph6.0-6.5、26℃条件下，160r/min摇床培养18小时；其中，所述种子培养基配方(g/l)为：蔗糖25g/l、蛋白胨7g/l、磷酸二氢钾0.3g/l、硫酸镁0.3g/l和氯化钠4g/l；3)发酵罐培养：将步骤(2)培养的菌种在无菌条件下以体积比为18％的接种量接种于液体发酵培养基中，在ph7.0、罐压为0.06mpa、温度为26℃、通风量为1:0.8vvm的条件下，在培养96小时后，产生的菌丝体占总体积的20％时停止发酵；其中，所述液体发酵培养基配方为：淀粉25g/l、玉米粉5g/l、豆饼粉3g/l、蔗糖25g/l、蛋白胨5g/l、硫酸镁0.3g/l、氯化钠20g/l和消泡剂(v/v)0.05％。4)固体发酵产孢：将步骤3)经过发酵罐培养后的菌丝体接种到固体发酵培养基上，培养180小时，停止发酵；其中，所述固体发酵培养基配方为：水稻秸秆、玉米粉、谷壳按7:2:1重量比混合组成的固体料中加入水，即得固体发酵培养基，固体料与水的重量比为1:0.65；5)将步骤4)中得到的混合固体发酵产物干燥、粉碎制备成草酸青霉、黄蓝状菌混合孢子粉；其余步骤同实施例1。在以上方法实施过程中，节节草采收后测定污染土壤中重金属铜的含量变化。实施例3具体包括以下步骤：步骤一，将微生物菌剂按30kg/亩的施用量投加于铜污染土壤，使用翻耕机等机械设备翻匀，使微生物菌剂均匀分布于污染区域；其余步骤同实施例1。实施例4具体包括以下步骤：步骤一，将微生物菌剂按40kg/亩的施用量投加于铜污染土壤，使用翻耕机等机械设备翻匀，使微生物菌剂均匀分布于污染区域；其余步骤同实施例1。实施例5具体包括以下步骤：步骤一，将微生物菌剂按45kg/亩的施用量投加于铜污染土壤，使用翻耕机等机械设备翻匀，使微生物菌剂均匀分布于污染区域；其余步骤同实施例1。实施例6具体包括以下步骤：将实施例1中所述步骤二中的节节草种植密度调整为9株/m2。其余步骤同实施例1。实施例7具体包括以下步骤：将实施例1中所述步骤二中的节节草种植密度调整为15株/m2。其余步骤同实施例1。实施例8具体包括以下步骤：步骤一，将单一菌剂草酸青霉菌孢子粉按35kg/亩的施用量投加于铜污染土壤，使用翻耕机等机械设备翻匀，使微生物菌剂均匀分布于污染区域；其余步骤同实施例1。实施例9具体包括以下步骤：步骤一，将单一菌剂黄蓝状菌孢子粉按35kg/亩的施用量投加于铜污染土壤，使用翻耕机等机械设备翻匀，使微生物菌剂均匀分布于污染区域；其余步骤同实施例1。按照实施例1-9所述的方法对铜污染程度相同的土壤进行修复，同时以不做和任何修复处理(对照组1)和以无添加微生物菌剂，仅种植节节草处理(对照组2)作为对照组，根据对照组、实施例1-9修复后的结果如下表所示。处理组别初始有效铜含量(mg/kg)收获后有效铜含量(mg/kg)对照组1412.23412.12对照组2413.01401.26实施例1413.25375.59实施例2414.03376.23实施例3413.21391.21实施例4414.37381.56实施例5412.98394.48实施例6413.13377.27实施例7413.45378.11实施例8412.99394.34实施例9413.00395.19由表中数据分析可知，采用实施例1-9所述的方法，均能不同程度降低污染土壤中的有效态铜含量，且微生物菌剂与节节草的联合修复效果要优于对照组2；表中对照组1、2及实施例1-2说明，采用本发明的方法，在不同的发酵条件下，实施例1的实验效果优于实施例2，二者均能不同程度的移除污染土壤中的有效态铜含量，优选地，微生物菌剂的发酵条件选用实施例1中所述。表中对照组1、2及实施例1、3、4、5说明了在不同的微生物菌剂施用量条件下，采用本发明的方法的修复效果；优选地，本发明中微生物菌剂的施用量为35kg/亩。表中对照组1、2及实施例1、6、7说明了在不同节节草种植密度条件下，采用本发明的方法的修复效果；优选地，本发明中节节草的种植密度为10株/m2。表中对照组1、2及实施例1、8、9说明了微生物混合孢子粉菌剂与单一草酸青霉孢子粉菌剂、单一黄蓝状菌孢子粉菌剂分别与节节草联合修复的应用效果，实施例8、9均能降低污染土壤中有效态铜的含量，但与实施例1相比，效果相差较多，说明两种菌株的混合孢子粉能够协同活化土壤中的铜，进而使节节草植株内富集更多的重金属铜。以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12