一种小球藻及其在重金属废水处理中的应用

1.本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种小球藻及其在重金属废水处理中的应用。


背景技术：

2.重金属(hms)污染对生物体有严重的健康风险，并且由于hms的高毒性以及它们的不可生物降解性和在食物链和生物体中的积累，导致环境质量越发恶化。许多行业将hms直接或间接释放进河流或海水中，这是一个不容忽视的公众关注的问题。考虑到这一点，世界卫生组织和(who)以及美国环境保护署(usepa)已经制定了严格的规定，规定了向环境中排放的hms的允许水平。在hms中，铜(cu)和铅(pb)具有剧毒，属于非常常见的环境污染物。除了常规使用的物理化学方法外，研究人员已经尝试了各种去除hms的技术，最近，使用生物方法的逐渐兴起，很多研究都把目光放在了使用微藻去除hms上。
3.目前，许多研究用于去除hms的微藻藻株的效率不足以耐受高浓度的cu和pb，即使能耐受，也会由于不同的hms浓度、温度和ph值，而影响其生长繁殖。因此，迫切需要发现一种能够在一种或多种hms污染的水体中，以及在不同环境条件下健康生长的新型环境广适性微藻。
4.从富铅位点分离的嗜热小球藻(chlorella thermophila)可以在不同的环境条件下健康生长，包括(1)温度范围在10℃到40℃
±
5℃之间，(2)ph值范围从3到11，以及(3)耐受海水中铅离子(pb
2+
)和铜离子(cu
2+
)的浓度可达150-200ppm。这种藻类是运用于不同环境中的优良生物，可用于从受污染的水体中去除重金属，以维护绿色无污染环境的长久性。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了一种小球藻及其在重金属废水处理中的应用，该藻株可耐受0～160ppm的pb
2+
和cu
2+
离子，可用于去除废水中的重金属离子，为水生和陆生动植物群提供良好的生长环境。
[0006][0007]
本发明从铅(pb)矿场收集土壤和水样，从中分离出一株微藻，编号mem-a-407。经18s rrna基因测序，结合局部序列比对搜索工具(blast)和系统发育分析，鉴定为小球藻(chlorella thermophila)。
[0008]
mem-a-407藻株于2021年9月1日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:m20211114。
[0009]
试验结果显示，该藻株具有高度的重金属耐受性，能在极其恶劣的条件下生长，可耐受铅离子(pb
2+
)和铜离子(cu
2+
)范围从几个ppm到200ppm，温度从10℃到40℃
±
5℃之间，可耐受ph值在3-11之间，在上述条件下生长良好。因此，这株新分离到的藻株是良好的的生物材料，可以在指定或自然条件下以生态友好的方式经济地去除hms，净化水质。
[0010]
所述小球藻mem407的18s rrna基因片段的序列如seq id no.1所示。
[0011]
本发明还提供了所述的小球藻在处理重金属废水中的应用。其中，所述重金属包括铅和铜。
[0012]
本发明测试通过小球藻mem-a-407在高浓度金属下(铅和铜)的存活和增殖情况，发现mem-a-407对铅和铜均具有明显的耐受性/抗性，表明可以去除废/污水中的重金属。
[0013]
实验表明，小球藻mem-a-407可耐受0～160ppm的pb
2+
和cu
2+
离子。
[0014]
本发明还提供一种重金属处理剂，包括保藏编号为cctccno:m20211114小球藻。
[0015]
本发明还提供一种重金属废水的处理方法，将所述的小球藻mem407于废水中进行培养，或本发明所述的重金属处理剂添加到含重金属的废水中。
[0016]
本发明分离获得的小球藻mem-a-407具有多种特性，可以在10℃-40℃
±
5℃的温度下生长，耐受ph值为3-11，耐受不同浓度的pb
2+
和cu
2+
离子，可用于去除废水中的重金属离子，为水生和陆生动植物群提供良好的生长环境。
[0017]
生物保藏说明
[0018]
小球藻mem-a-407(chlorella thermophila mem-a-407)，于2021年9月1日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址为:中国，武汉，武汉大学，保藏编号为cctcc no:m20211114。
附图说明
[0019]
图1为微藻培养前后藻体颜色的变化情况；
[0020]
图2为纯化和重复平板划线法对微藻进行纯化的结果；
[0021]
图3为显微镜镜下新型分离株嗜热小球藻菌株的形态图，显微镜的放大倍数为100x；
[0022]
图4为不同培养时间下mem-a-407在液体培养基中的生长情况；
[0023]
图5为1％琼脂糖凝胶电泳图，显示了新分离到藻株嗜热小球藻的18srrna基因的pcr扩增产物。泳道m是dl2000 dna maker泳道1是18s rrna基因扩增产物；
[0024]
图6为使用mega-x软件获得的分离株嗜热小球藻18s rrna基因序列的系统发育树；
[0025]
图7为mem-a-407在0ppm、10ppm、20ppm和40ppm铅和铜浓度下的生长模式；(a)铅(pb)，和(b)铜(cu)；
[0026]
图8为mem-a-407在0ppm、80ppm、120ppm和160ppm铅和铜浓度下的生长模式；(a)铅(pb)和(b)铜(cu)。
具体实施方式
[0027]
本发明公开了一种小球藻及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0028]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0029]
实施例1藻株的分离鉴定
[0030]
(1)采集土壤和水样。
[0031]
(2)样品到达实验室后，将石头、鹅卵石和稻草移走清洗样品，样品置于4℃待用。
[0032]
(3)将土壤样品彻底混合，将具有代表性的10-15g土壤和(或)10ml均匀混合的水样加入100ml f/2培养基中，并添加20ppm浓度的铅(pb
2+
)和铜(cu
2+
)离子，在250ml锥形瓶中培养。
[0033]
(4)藻类分离过程中使用的藻类培养基的组成如下。
[0034]
步骤一：母液的制备：
[0035]
表1
[0036][0037]
步骤二：
[0038]
按照表2配制母液，121℃加热灭菌15分钟，加入步骤一制备的溶液中表2母液配方组成
[0039][0040]
表3微量元素母液的组成
[0041][0042]
按照表3配制好的溶液在121℃下加热灭菌20分钟并储存备用。
[0043]
(4)将烧瓶在25℃和100μmol m-2
s-1
的恒定光照强度下培养16小时光照和8小时黑暗期，直到藻体颜色可见(图1)。
[0044]
(5)在平板上散布藻悬液数天后，观察到近似均匀的混合微藻与真菌污染。选取生长速度快的微藻菌株，通过反复扩散和划线板法进行纯化，获得藻株mem-a-407，见图2。于显微镜下进行形态学观察，发现mem-a-407是一种直径约为10-20μm的呈绿色圆形的微藻，
结果见图3。
[0045]
(5)将纯化的mem-a-407藻株接种至液体培养基，每隔24小时测定od值(图4)。
[0046]
pcr法扩增18s rrna基因：收集1.0ml海藻培养物，提取基因组，扩增18s rrna基因。pcr反应体系如下：
[0047]
表4
[0048][0049]
pcr反应条件如下：
[0050]
表5
[0051][0052]
(6)18s rrna基因扩增子见图5，经桑格双脱氧测序分析其核苷酸序列如seq id no.1所示。
[0053]
(7)使用basic alignment search tool(blast)和系统发育分析鉴定藻种。
[0054]
利用ncbi的blast寻找与新分离株的18s rrna基因序列高度相似的标准核苷酸序列。利用mega-x软件对选定的序列进行比对，并采用1000bootstrap方法构建邻接系统进化树，如图6。
[0055]
结合形态学、18s rrna基因测序、局部序列比对搜索工具(blast)和系统发育分析，mem-a-407藻株被鉴定为小球藻chlorella thermophila。
[0056]
实施例2mem-a-407在不同浓度的pb2+，cu2+水体中的生长情况
[0057]
分别配制pb
2+
和cu
2+
浓度为0ppm、10ppm、20ppm和40ppm的100ml f/2培养基，并将其添加到单独的管式生物反应器中。按照下述条件接种嗜热小球藻至管式生物反应器中，接种浓度od
750
为0.30，温度25℃，光照周期16小时(明)：8小时(暗)，光照强度50μmol/m-2
/s-1
。为了测试嗜热小球藻的存活率和生长率，每2天测量一次od
750
，总共10天(图7a、b)。结果表明，在这三种浓度的pb
2+
和cu
2+
下，对藻株mem-a-407的生长没有影响。
[0058]
实施例3 mem-a-407在不同浓度的pb2+，cu2+水体中的生长情况
[0059]
在f/2培养基中添加0ppm、80ppm、120ppm和160ppm浓度的pb
2+
和cu
2+
，然后，将嗜热小球藻接种至与上一节温度，光照周期，光照强度条件相同的管式生物反应器中。od
750
的测量表明，80ppm和120ppm的浓度改藻株株生长没显着影响，然而，在160ppm的浓度下，生长相对缓慢，但该藻小仍能生长繁殖(图8a、b)。
[0060]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。