一种微生物菌剂在多种卤代有机污染物降解中的应用

1.本发明涉及有机物生物降解领域技术领域，具体的一种微生物菌剂在多种卤代有机污染物降解中的应用。


背景技术：

2.近年来，电子产品更新换代的速度加快，产生的电子垃圾成为了全球性关注的问题。中国作为世界上最大的电子垃圾进口国，污染更为严重。电子垃圾在拆解的过程中，很多卤代有机污染物(hops)被释放到环境中，例如多氯联苯(pcbs)，多溴联苯醚(pbdes)，氯酚类(cps)、氯乙烯(pce、tce等)等。很多卤代污染物在环境中往往是协同存在的。陆地和海洋环境是许多hops的最终汇入点和进入食物链的主要途径，其污染问题不容忽视。开发出能对多种卤代有机污染物的共同修复技术对卤代有机污染物的修复具有重要的意义。


技术实现要素：

3.本发明为解决上述问题，提供了一种微生物菌剂在多种卤代有机污染物降解中的应用，产品环境友好，无毒性，能有效的同时对多种污染物(四氯乙烯pce、三氯苯酚2，4，6—tcp、多氯联苯，多溴联苯醚penta-bdes)进行厌氧还原脱卤，为卤代持久性有机污染物的降解提供了新的途径。
4.本发明通过以下技术方案来实现：
5.一种微生物菌剂在多种卤代有机污染物降解中的应用，所述多种卤代有机污染物包括四氯乙烯pce、三氯苯酚2，4，6-tcp、多氯联苯，多溴联苯醚penta-bdes；具体操作为：
6.将多氯联苯分别以1mg/l的浓度置于微生物菌剂降解体系中，30
±
1℃下黑暗环境下培养30天以上；
7.将四氯乙烯pce以0.2mm的浓度置于微生物菌剂降解体系中，30
±
1℃下黑暗环境下培养30天以上；
8.将三氯苯酚2，4，6-tcp以30μm的浓度置于微生物菌剂降解体系中，30
±
1℃下黑暗环境下培养30天以上；
9.将多溴联苯醚penta-bdes以1.2μm的浓度置于微生物菌剂降解体系中，30
±
1℃下黑暗环境下培养30天以上。
10.进一步的，所述微生物菌剂降解体系包括1.5～3mg厌氧微生物、0.1～1l无机盐培养基、1～1.5ml乳酸钠、0.5～1ml维生素溶液。
11.进一步的，所述厌氧微生物包括以下菌种混合制成：57～62份脱卤球菌(dehalococooides sp.)、6～8份沉降杆菌(sedimentibacter sp.)、5～7份细粒菌(lentimicrobium sp.)、4～6份拟杆菌(petrimonas sp.)、3～5份脱硫微杆菌(desulfomicrobium sp.)、2～4份厌氧球菌(anaerostignum sp.)、2～4份甲烷八叠球菌(methanosarcina sp.)。
12.进一步的，所述无机盐培养基配方为：nh4cl 0.3g/l，cacl2·
2h2o 0.015g/l，
mgcl2·
6h2o 0.5g/l，k2hpo
4 0.2g/l，se/w溶液2ml/l，微量元素溶液2ml/l，ph7.25的tris乙磺酸缓冲液15mmol/l，维生素溶液0.1ml/l，0.1％刃天青指示剂0.3ml/l，水余量。
13.进一步的，每升se/w溶液的组成为：naoh 0.5g，naseo3·
5h2o 6mg，na2wo4·
2h2o 8mg，水余量。
14.进一步的，每升微量元素溶液的组成为：hcl 10.0ml，fecl2·
4h2o 1.5g，cocl2·
6h2o 196.0mg，mncl2·
4h2o 100.0mg，zncl
2 70.0mg，h3bo
3 6.0mg，cucl2·
2h2o 2.0mg，nicl2·
6h2o 24.0mg，na2moo4·
2h2o 36.0mg，水余量。
15.进一步的，每升维生素溶液的组成为：生物素20mg，叶酸20mg，vb
6 100mg，vb
1 50mg，vb
2 50mg，vb
3 50mg，d-泛酸钙50mg，v b
12 50mg，对氨基苯甲酸50mg，硫辛酸50mg，vb
5 50mg，亚铁血红素50mg，1，2-萘醌50mg，水余量。
16.进一步的，所述tris乙磺酸缓冲液配制方法为：3.438g tris乙磺酸溶解在1l蒸馏水中，加0.5～0.8m的naoh水溶液调节ph至7.25，然后用蒸馏水定容至1l，于4摄氏度保存。
17.进一步的，所述多氯联苯包括pcb138、pcb180、pcb174、pcb153、pcb 170、pcb 187、pcb 149。
18.本发明的有益效果在于：
19.本发明采用的微生物菌剂环境友好，无毒性，该微生物菌剂能将7种多氯联苯pcbs单体化合物(包括pcb138，pcb180，pcb174，pcb153，pcb 170，pcb 187，pcb 149)不同程度的降解，能将四氯乙烯(pce)最终降解为两种二氯乙烯的同分异构体(trans-dce和cis-dce)，能将三氯酚(2，4，6-tcp)最终降解为单氯酚(mcp)，以及将多溴联苯醚(penta-bdes mixture)彻底脱溴降解为联苯醚(de)，本发明为研发能降解多种污染物的多功能菌剂提供了新的途径。
附图说明
20.图1是本发明pcb138单体脱氯降解途径示意图；
21.图2是本发明pcb180单体脱氯降解途径示意图；
22.图3是本发明pcb174单体脱氯降解途径示意图；
23.图4是本发明pcb153单体脱氯降解途径示意图；
24.图5是本发明pcb170单体脱氯降解途径示意图；
25.图6是本发明pcb187单体脱氯降解途径示意图；
26.图7是本发明pcb149单体脱氯降解途径示意图；
27.图8是本发明pce降解示意图；
28.图9是本发明tcp降解示意图；
29.图10是本发明pbdes的gc-ms测定示意图；
30.图11是本发明pbdes降解示意图；
具体实施方式
31.下面根据附图对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
32.本发明的厌氧微生物筛选自南黄海近岸海域海底沉积物样品(125.5
°
e，31.33
°
n)，经菌落多样性分析，微生物菌群组成为：脱卤球菌(dehalococooides sp.)，沉降杆菌
(sedimentibacter sp.)，细粒菌(lentimicrobium sp.)，拟杆菌(petrimonas sp.)，脱硫微杆菌(desulfomicrobium sp.)，厌氧球菌(anaerostignum sp.)，甲烷八叠球菌(methanosarcina sp.)等。
33.本发明无机盐培养基的成分，微量元素溶液的成分，se/w溶液的成分，维生素溶液的成分均是市售产品。
34.ph7.25的tris乙磺酸(tes)缓冲液配制为：3.438g tris乙磺酸溶解在1l蒸馏水中，加0.5～0.8m的naoh水溶液调节ph至7.25，然后用蒸馏水定容至1l，于4摄氏度保存。
35.实施例1
36.一种能降解多种卤代有机污染物厌氧还原脱氯的微生物制剂，包括以下组分混合制成：无机盐培养基0.1～1l，厌氧微生物1.5～3mg，乳酸钠1～1.5ml，维生素溶液0.5～1ml。
37.按质量百分比计，所述厌氧微生物由以下菌种组成：脱卤球菌(dehalococooides sp.)含60％左右，沉降杆菌(sedimentibacter sp.)占7％左右，细粒菌(lentimicrobium sp.)占6％左右，拟杆菌(petrimonas sp.)占5％左右，脱硫微杆菌(desulfomicrobium sp.)占4％左右，厌氧球菌(anaerostignum sp.)占3％左右，甲烷八叠球菌(methanosarcina sp.)占3％左右。
38.所述无机盐培养基配方为：nh4cl 0.3g/l，cacl2·
2h2o 0.015g/l，mgcl2·
6h2o 0.5g/l，k2hpo
4 0.2g/l，se/w溶液2ml/l，微量元素溶液2ml/l，ph7.25的tris乙磺酸(tes)缓冲液15mmol/l，维生素溶液0.1ml/l,刃天青(0.1％)指示剂0.3ml/l，水余量。
39.其中，每升se/w溶液的组成为：naoh 0.5g，naseo3·
5h2o 6mg，na2wo4·
2h2o 8mg，水余量。
40.每升微量元素溶液的组成为：hcl 10.0ml，fecl2·
4h2o 1.5g，cocl2·
6h2o 196.0mg，mncl2·
4h2o 100.0mg，zncl
2 70.0mg，h3bo
3 6.0mg，cucl2·
2h2o 2.0mg，nicl2·
6h2o 24.0mg，na2moo4·
2h2o 36.0mg，水余量。
41.每升维生素溶液的组成为：生物素20mg，叶酸20mg，vb
6 100mg，vb
1 50mg，vb
2 50mg，vb
3 50mg，d-泛酸钙50mg，v b
12 50mg，对氨基苯甲酸50mg，硫辛酸50mg，vb
5 50mg，亚铁血红素50mg，1,2-萘醌50mg，水余量。
42.以下为对几种卤代污染物的降解效果的应用的实验方法：
43.将几种卤代有机污染物分别添加到微生物制剂中，污染物包括多氯联苯pcbs，四氯乙烯pce，氯酚类(pcp、tcp)，多溴联苯醚(pbdes)，验证是否有多种卤代有机污染物的脱卤活性。
44.具体实验设置如下：
45.(1)pcbs降解体系的建立：分别添加几种多氯联苯pcbs单体(pcb138，pcb180，pcb174，pcb153，pcb170，pcb149，pcb187，pcb128)进行培养，用于追踪pcbs的脱氯途径。
46.(2)四氯乙烯(pce)降解体系的建立：以pce为唯一底物进行转接，pce在反应体系中的终浓度控制在0.19～0.21mm。
47.(3)tcp降解体系的建立：在转接时将底物替换为2，4，6
–
tcp(终浓度30μm)，当观察到降解活性后，以该底物继续转接，并连续转接至少3代以检验是否能稳定降解。
48.(4)pbdes降解体系的建立：以penta-bdes混合物为唯一底物的脱溴培养体系的建
立，即在转接时将底物替换为penta-bdes(终浓度1.2μm)，检测到penta-bdes降解及其所生成的脱溴产物后，继续转接，需要连续至少传代3代以检验脱溴活性的稳定。
49.以下为多种卤代化合物的脱卤活性分析：
50.无沉积物培养物中卤代化合物的萃取方法稍作简化，取1ml的培养物，在4ml的玻璃琥珀瓶中用等体积的异辛烷(1ml)进行液液萃取，绑在涡旋仪上剧烈振荡1.5
–
2h，振荡完成后，离心，取上层有机相进行分析。
51.pcbs测定的测定方法为利用气相色谱-质谱联用仪gc-ms(agilent technologies，gcmsd5975)进行测定，样品回收率为75％-105％。
52.pce的测定方法为利用气相色谱(agilent technologies，gc7890)进行测定，测定过程中检验样品回收率为85％左右。
53.tcp的测定在配备有hp-5色谱柱(30m
×
0.32mm
×
0.25μm；j&w scientific，folsom，ca，u.s.a)的气相色谱-质谱联用仪gc-ms上(qp 2010，shimadzu corporation，japan)进行。色谱条件为：初始40℃，以15℃/min升温至220℃，保持3min，总时长15min。质谱条件为：离子源温度250℃，溶剂延迟2min，采用全扫描和离子扫描模式相结合的方式进样，进样模式为无分流进样。制备氯酚类底物及其可能的降解产物(pcp、tetra-cp，tcp，dcp，mcp)物质的标准曲线，标准曲线的各浓度梯度设置为3，9，12，18，21，27μm。样品测定过程中检验回收率为85％-105％。
54.penta-bdes混合物的测定在配备有db-5色谱柱(15m
×
0.32mm
×
0.25μm；j&w scientific，u.s.a)的气相色谱质谱联用仪(gc6890-msd5975，agilent，wilmington，de，u.s.)上进行。进样程序为：初始110℃，以15℃/min升温至310℃，保持3min，总时长15min。质谱条件为：离子源温度250℃，溶剂延迟2min，采用全扫描和离子扫描模式相结合的方式进样，进样模式为无分流进样。进行标准曲线的制备和pbdes组分选择，定量方式根据五点标准曲线的方法进行，样品回收率为75％-110％。
55.结果与分析如下：
56.(1)对七种pcbs单体化合物降解能力的研究
57.选取七个pcbs单体化合物(包括pcb138，pcb180，pcb174，pcb153，pcb 170，pcb 187，pcb 149)，分别加入到厌氧培养体系中，追踪降解产物和底物的变化情况，推导出pcbs的脱氯途径。七种pcbs单体的脱氯降解途径如error！reference source not found.1～7所示。
58.由图可知，六氯联苯pcb138(234-245)可以通过间位脱氯降解为五氯联苯pcb99(245-24)，再进一步通过间位脱氯降解为四氯联苯pcb47(24-24)。此脱氯模式为侧边间位脱氯(flanked meta position，234，245)。
59.七氯联苯pcb180(2345-245)可以分别通过脱去对位氯原子和间位氯原子产生pcb146(235-245)和pcb153(245-245)，pcb146(235-245)进一步通过间位脱氯产生pcb101(245-25)，pcb153(245-245)进一步通过间位脱氯产生pcb99(245-24)。此脱氯反应的脱氯位置为侧边对位和侧边间位脱氯(234，345，235，245)。
60.七氯联苯pcb174(2345-236)可以分别通过脱去对位氯原子和间位氯原子产生pcb135(235-236)和pcb149(236-245)，pcb149(236-245)可进一步通过间位脱氯产生pcb91(236-24)。可以看出脱氯位置为(2345，2345，245)，。
61.六氯联苯pcb153(245-245)可以分别通过脱去对位氯原子和间位氯原子产生pcb101(245-25)和pcb99(245-24)，pcb101(245-25)可进一步通过间位脱氯产生pcb49(24-25)，pcb99(245-24)可进一步通过间位脱氯产生pcb47(24-24)。可以看出脱氯位置为(245，245)。
62.七氯联苯pcb170(2345-234)可以分别通过脱去间位氯原子产生pcb138(234-245)和pcb128(234-234)，pcb138(234-245)可进一步通过间位脱氯产生pcb99(245-24)。可以看出脱氯位置为(2345，234)。
63.七氯联苯pcb187(2356-245)可以分别通过脱去间位氯原子和邻位氯原子产生pcb149(236-245)和少量pcb146(235-245)，pcb149(236-245)可进一步通过间位脱氯产生pcb91(236-24)。可以看出脱氯位置主要为(2356，245)。
64.六氯联苯pcb149(236-245)作为底物时可以通过对位氯原子产生pcb95(236-25)。
65.(2)pce降解能力研究
66.脱氯培养物转接到以pce(0.2mm左右)为唯一底物的培养体系中，可以观察到培养体系中pce首先脱去一个氯原子转化为tce，当大部分pce降解后，tce开始以两种方式脱去氯原子，生成的最终产物为dce的两种同分异构体，trans-dce和cis-dce。并且，以pce为唯一底物连续培养5代后观察到pce的降解活性保持稳定。
67.(3)tcp降解能力研究
68.脱氯培养物转接到以tcp(2，4，6
–
tcp，30μm)为唯一底物的培养体系中，可以观察到三氯酚(tcp)首先脱去一个氯原子降解为二氯酚(dcp)，然后再脱去一个氯原子降解为终产物一氯酚(mcp)，以tcp为唯一底物连续培养4代后，通过gc-ms检测降解活性稳定。
69.(4)pbdes降解能力研究
70.由于penta-bdes mixture中bde47(24-24-四溴联苯醚)，bde99(245-24-五溴联苯醚)和bde100(246-24-五溴联苯醚)这三种单体的含量占比将近90％，gc-ms测定时这三个峰面积占比很高，如图10所示，因此研究penta-bdes是否降解一般看这三种底物的降解情况。由脱氯培养物转接到以penta-bdes(1.2μm)为唯一底物的培养体系中，可以观察到penta-bdes降解为联苯醚(diphenyl ether，de)，并且以penta-bdes为唯一底物连续培养3代后观察到penta-bdes的降解活性保持稳定。
71.以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内，本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。