一种使用壳聚糖絮凝预处理大豆黄浆水的方法

1.本发明属于大豆黄浆水处理技术领域，具体涉及一种使用壳聚糖絮凝预处理大豆黄浆水的方法。


背景技术：

2.豆腐因其富含较高的蛋白和必需脂肪酸而受到亚洲人民的青睐。在豆腐制作过程中，经压滤成型后会排放大量含有黄酮和色素类物质的黄色液体，我们将其称为黄浆水。黄浆水中包含大量的营养物质，例如蛋白质、低聚糖、矿物质和异黄酮等，作为传统豆制品加工的副产物多数被直接排放到环境中，不但为微生物的生长和繁殖创造了营养基质导致生物需氧量和化学需氧量的严重超标，造成环境污染，也使得其中的有益生理活性成分流失。其中水苏糖就是黄浆水中最重要的功能性物质，其属于棉籽糖属半乳糖苷类的功能性低聚糖。是一种可以显著促进双歧杆菌等有益菌增殖的功能性低聚糖，被美国食品与药物管理局认定为一般安全无毒食品的低聚糖产品。水苏糖能显著促进人体肠道有益菌群增殖，迅速改善人体消化道内环境，吸附胃肠道有毒物质及病原菌，具有维护肠道菌群、降低血压和血脂、排毒、延缓衰老、促进微量元素的吸收、抗肿瘤和抗癌等功效，被称为―超强益生元。回收黄浆水里的功能性物质必须经过预处理，目前常见的黄浆水预处理方法共三种：加热沉淀法、等电点法、絮凝剂法，加热法是利用蛋白质对热的不稳定性来破坏样品中的抗营养因子，因此此方法并不理想。工业上通常采用后两种方法，其中等电点法是利用蛋白质在等电点时溶解度最低的原理来分离蛋白的方法。而絮凝法是在废水中加入一定量的絮凝剂，使水体中的一些污染物脱稳，并汇聚成大颗粒物质而沉淀析出。絮凝剂根据化学成分可分为无机和有机两种絮凝剂。无机絮凝剂可分为低分子和高分子两种，无机絮凝剂具有价格低廉，用法简单等优点。有机絮凝剂主要包括甲壳素类、蛋白质类、动物胶、改性淀粉等，其具有价格低、无毒无害不容易造成二次污染等优点。
3.因此，我们用氯化钙絮凝、壳聚糖絮凝和碱溶酸沉三种常见预处理方法，测定蛋白去除率和水苏糖保留率，从而筛选出一种适合工业生产且高效稳定的大豆黄浆水预处理方法是本领域技术人员极需解决的问题。


技术实现要素：

4.本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供一种使用壳聚糖絮凝预处理大豆黄浆水的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种使用壳聚糖絮凝预处理大豆黄浆水的方法，包括以下步骤：
6.步骤一、黄浆水的制备：
7.(1)选择颗粒饱满、大小均匀、色泽一致的大豆；
8.(2)称取大豆，按照豆水比1:5浸泡14-16h后，去掉水分；
9.(3)加干豆9倍体积的水磨浆，滤出豆渣；
10.(4)将豆浆进行水浴加热至90℃保持10min进行煮浆；
11.(5)加入凝固剂(硫酸钙添加量为干豆的2％)，保12min后；
12.(6)放入模具中进行压制，最后收集黄浆水；
13.(7)将制备好的黄浆水保存至4℃冰箱备用；
14.步骤二、黄浆水预处理方法的初步筛选；
15.选取氯化钙絮凝、壳聚糖絮凝和碱溶酸沉三种预处理方法进行比较，并对预处理样液的蛋白截留率及水苏糖保留率进行分析，与氯化钙絮凝相比，壳聚糖絮凝对蛋白的去除无显著差异，但水苏糖保留率显著升高(p《0.05)；采用碱溶酸沉去蛋白效果最差，其蛋白去除率和水苏糖保留率均最低；
16.步骤三、壳聚糖絮凝预处理的单因素试验，取2g的壳聚糖加入到1％的冰乙酸中，充分搅拌，制成20g/l的壳聚糖溶液；将黄浆水中加入一定量的壳聚糖溶液，分别考察静沉时间、ph值、静沉温度、壳聚糖添加量四个因素对蛋白去除率的影响；
17.步骤四、浆水预处理的响应面优化试验，在单因素试验基础上，最终选择(a)静沉时间/min、(b)ph值、(c)静沉温度/℃和(d)壳聚糖添加量/g/l四个因素为自变量，并以蛋白去除率为响应值，根据box-behnken中心组合设计原理，进行了四因素三水平的响应面分析试验。
18.优选的，所述步骤三中，静沉时间对黄浆水中蛋白去除率的影响，向黄浆水中添加20ml浓度为20g/l的壳聚糖溶液(0.4g/l)，调节ph＝5.0，放入预设温度为40℃的水浴锅中，控制时间分别为15、30、45、60、75min，每组进行三次平行试验，然后将黄浆水以8000rpm的转速离心10min取上清液测定蛋白去除率。
19.优选的，所述步骤三中，ph值对黄浆水中蛋白去除率的影响，向黄浆水中添加20ml浓度为20g/l的壳聚糖溶液(0.4g/l)，调节ph值分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，放入预设温度为40℃的恒温水浴锅中，控制时间为45min，每组进行三次平行试验，然后将黄浆水以8000rpm的转速离心10min取上清液测定蛋白去除率。
20.优选的，所述步骤三中，静沉温度对黄浆水中蛋白去除率的影响，向黄浆水中添加20ml浓度为20g/l的壳聚糖溶液(0.4g/l)，调节ph＝5.0，放入预设温度分别为20、30、40、50、60℃的恒温水浴锅中，控制时间为45min，每组进行三次平行试验，然后将黄浆水以8000rpm的转速离心10min取上清液测定蛋白去除率。
21.优选的，所述步骤三中，壳聚糖添加量对黄浆水中蛋白去除率的影响，向黄浆水中分别添加10ml浓度为20g/l的壳聚糖溶液(0.2g/l)、20ml浓度为20g/l的壳聚糖溶液(0.4g/l)、30ml浓度为20g/l的壳聚糖溶液(0.6g/l)、40ml浓度为20g/l的壳聚糖溶液(0.8g/l)、50ml浓度为20g/l的壳聚糖溶液(1.0g/l)的壳聚糖，调节ph＝5.0，放入预设温度为40℃的恒温水浴锅中，控制时间为45min，每组进行三次平行试验，然后将黄浆水以8000rpm的转速离心10min取上清液测定蛋白去除率。
22.优选的，预处理的最优工艺参数为静沉时间为67.58min，ph值为5.55，静沉温度为30.89℃，壳聚糖添加量0.69g/l，此时蛋白去除率的预测值为48.94％。
23.优选的，蛋白去除率为48.39
±
0.27％。
24.与现有技术相比，本发明提供了一种使用壳聚糖絮凝预处理大豆黄浆水的方法，具备以下有益效果：本发明经响应面优化试验优化后，预处理的最优工艺参数为静沉时间
为67.58min，ph＝5.55，静沉温度为30.89℃，壳聚糖添加量0.69g/l，此时蛋白去除率的预测值为48.94％；根据试验实际控制条件，将静沉时间调整为68.00min，调整ph＝5.5，静沉温度调整为31℃，壳聚糖添加量调整为0.7g/l，在此条件下进行三次平行试验；最终蛋白去除率为48.39
±
0.27％，与响应面预测值相符，说明该优化条件可应用于试验中；在此最优预处理条件下，测定水苏糖保留率为90.35％，因此证明此预处理条件对黄浆水中水苏糖含量几乎没有影响；从而筛选出适合工业生产且高效稳定的大豆黄浆水预处理方法。
附图说明
25.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制，在附图中：
26.图1为本发明静沉时间对黄浆水蛋白去除率的影响示意图；
27.图2为本发明ph值对黄浆水蛋白去除率的影响示意图；
28.图3为本发明静沉温度对黄浆水蛋白去除率的影响示意图；
29.图4为本发明壳聚糖添加量对黄浆水蛋白去除率的影响示意图；
30.图5为本发明回归模型方程的方差分析表。
具体实施方式
31.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.本发明提供一种技术方案：一种使用壳聚糖絮凝预处理大豆黄浆水的方法，包括以下步骤：
33.步骤一、黄浆水的制备：
34.(1)选择颗粒饱满、大小均匀、色泽一致的大豆；
35.(2)称取大豆，按照豆水比1:5浸泡14-16h后，去掉水分；
36.(3)加干豆9倍体积的水磨浆，滤出豆渣；
37.(4)将豆浆进行水浴加热至90℃保持10min进行煮浆；
38.(5)加入凝固剂(硫酸钙添加量为干豆的2％)，保12min后；
39.(6)放入模具中进行压制，最后收集黄浆水；
40.(7)将制备好的黄浆水保存至4℃冰箱备用；
41.步骤二、黄浆水预处理方法的初步筛选；
42.选取氯化钙絮凝、壳聚糖絮凝和碱溶酸沉三种预处理方法进行比较，并对预处理样液的蛋白截留率及水苏糖保留率进行分析，与氯化钙絮凝相比，壳聚糖絮凝对蛋白的去除无显著差异，但水苏糖保留率显著升高(p《0.05)；采用碱溶酸沉去蛋白效果最差，其蛋白去除率和水苏糖保留率均最低；
43.步骤三、壳聚糖絮凝预处理的单因素试验，取2g的壳聚糖加入到1％的冰乙酸中，充分搅拌，制成20g/l的壳聚糖溶液；将黄浆水中加入一定量的壳聚糖溶液，分别考察静沉时间、ph值、静沉温度、壳聚糖添加量四个因素对蛋白去除率的影响；
44.步骤四、浆水预处理的响应面优化试验，在单因素试验基础上，最终选择(a)静沉时间/min、(b)ph值、(c)静沉温度/℃和(d)壳聚糖添加量/g/l四个因素为自变量，并以蛋白去除率为响应值，根据box-behnken中心组合设计原理，进行了四因素三水平的响应面分析试验。
45.本发明中，优选的，所述步骤三中，静沉时间对黄浆水中蛋白去除率的影响，向黄浆水中添加20ml浓度为20g/l的壳聚糖溶液(0.4g/l)，调节ph＝5.0，放入预设温度为40℃的水浴锅中，控制时间分别为15、30、45、60、75min，每组进行三次平行试验，然后将黄浆水以8000rpm的转速离心10min取上清液测定蛋白去除率。
46.本发明中，优选的，所述步骤三中，ph值对黄浆水中蛋白去除率的影响，向黄浆水中添加20ml浓度为20g/l的壳聚糖溶液(0.4g/l)，调节ph值分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，放入预设温度为40℃的恒温水浴锅中，控制时间为45min，每组进行三次平行试验，然后将黄浆水以8000rpm的转速离心10min取上清液测定蛋白去除率。
47.本发明中，优选的，所述步骤三中，静沉温度对黄浆水中蛋白去除率的影响，向黄浆水中添加20ml浓度为20g/l的壳聚糖溶液(0.4g/l)，调节ph＝5.0，放入预设温度分别为20、30、40、50、60℃的恒温水浴锅中，控制时间为45min，每组进行三次平行试验，然后将黄浆水以8000rpm的转速离心10min取上清液测定蛋白去除率。
48.本发明中，优选的，所述步骤三中，壳聚糖添加量对黄浆水中蛋白去除率的影响，向黄浆水中分别添加10ml浓度为20g/l的壳聚糖溶液(0.2g/l)、20ml浓度为20g/l的壳聚糖溶液(0.4g/l)、30ml浓度为20g/l的壳聚糖溶液(0.6g/l)、40ml浓度为20g/l的壳聚糖溶液(0.8g/l)、50ml浓度为20g/l的壳聚糖溶液(1.0g/l)的壳聚糖，调节ph＝5.0，放入预设温度为40℃的恒温水浴锅中，控制时间为45min，每组进行三次平行试验，然后将黄浆水以8000rpm的转速离心10min取上清液测定蛋白去除率。
49.本发明中，优选的，预处理的最优工艺参数为静沉时间为67.58min，ph值为5.55，静沉温度为30.89℃，壳聚糖添加量0.69g/l，此时蛋白去除率的预测值为48.94％。
50.本发明中，优选的，蛋白去除率为48.39
±
0.27％。
51.实施例1：
52.黄浆水的制备：(1)选择颗粒饱满、大小均匀、色泽一致的大豆(2)称取大豆，按照豆水比1:5浸泡14-16h后，去掉水分，(3)加干豆9倍体积的水磨浆，滤出豆渣，(4)将豆浆进行水浴加热至90℃保持10min进行煮浆，(5)加入凝固剂(硫酸钙添加量为干豆的2％)，保12min后(6)放入模具中进行压制，最后收集黄浆水(7)将制备好的黄浆水保存至4℃冰箱备用；
53.方法：黄浆水理化指标测定
54.(1)固形物测定：参照gb 5009.3-2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》中直接干燥法进行测定；
55.(2)粗蛋白测定：参照gb 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法进行测定；
56.(3)脂肪测定：参照gb 5009.6-2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》中索氏抽提法进行测定；
57.(4)灰分测定：参照gb 5009.4-2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》中食
品中总灰分法进行测定；
58.(5)可溶性蛋白测定：参照bradford法测定蛋白含量；蛋白的标准曲线：准确称取50mg考马斯亮蓝g-250，置于500ml棕色容量瓶中，加入25ml95％的乙醇使之溶解，加入85％的磷酸50ml用蒸馏水定容到相应的刻度线备用；准确称取牛血清白蛋白100mg，用蒸馏水定容到100ml制得1mg/ml的标准蛋白液，取5支试管，分别加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml标准蛋白液，用蒸馏水补充至1ml，然后加入5ml考马斯亮蓝溶液，置于室温下3min，595nm处测定其吸光度，制作蛋白标曲；样液蛋白含量的测定：吸取1ml样液，加入5ml考马斯亮蓝溶液，置于室温下3min后595nm处测定其吸光度；
59.(6)总糖测定：参照苯酚-硫酸法测定总糖含量；葡萄糖标准曲线：葡萄糖置于烘箱105℃下干燥至质量不发生变化；称取25mg的葡萄糖置于500ml容量瓶中，用蒸馏水定容到刻度线；取5支试管，准确吸取葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml，用蒸馏水补充至2.0ml，依次加入1ml6％苯酚和5ml浓硫酸，将所有试管室温下放置30min后紫490nm测定吸光度，根据所得数据制作曲线；样液总糖含量的测定：吸取2ml样液，分别加入1ml6％的苯酚和5ml的浓硫酸，室温下摇匀静置30min后紫外490nm处测定吸光度；
60.(7)水苏糖测定：利用高效液相色谱法测定水苏糖含量；色谱柱：syncronisamino-nh2色谱柱(4.6
×
250mm，5μm)；检测器为elsd-um5800；流动相：乙腈:水＝75:25(v:v)；流速：0.8ml/min；柱温：35℃；elsd使用氮气作为雾化气体，流速为1.8ml/min，漂移管温度为50℃；标准溶液配制：用天平称取5mg水苏糖标品，置于5ml容量瓶中，用40％乙腈溶解并定容到刻度线配成浓度为1mg/ml的溶液，将其通过0.45μm滤膜过滤，滤液供高效液相分析；标准曲线的制备：采用外标法，所配制的水苏糖标准溶液以5、10、15、20、25μl的进样量注入高效液相色谱仪中，测定峰面积并分别以水苏糖含量的对数和峰面积的对数为横纵坐标作出标准曲线；样液中水苏糖含量的测定：将原液和预处理后的样液稀释5倍，分级过滤过程中的样液无需稀释，将其通过0.45μm滤膜过滤，以10μl进样量注入高效液相色谱仪中；
61.结果:
62.表2-4黄浆水主要成分分析
[0063][0064][0065]
方法：黄浆水预处理方法的初步筛选；
[0066]
选取氯化钙絮凝、壳聚糖絮凝和碱溶酸沉三种预处理方法进行比较，并对预处理样液的蛋白截留率及水苏糖保留率进行分析，其计算公式如下所示；处理方法如表2-3所示；
[0067][0068]
式中：w1—处理后的样液中蛋白含量；w0—原液中蛋白含量
[0069][0070]
式中：m1—处理后的样液中水苏糖含量；m0—原液中水苏糖含量
[0071]
表2-3预处理方法及条件
[0072][0073]
结果：如表2-5所示，与氯化钙絮凝相比，壳聚糖絮凝对蛋白的去除无显著差异，但水苏糖保留率显著升高(p《0.05)；采用碱溶酸沉去蛋白效果最差，其蛋白去除率和水苏糖保留率均最低。
[0074]
表2-5黄浆水预处理方法的比较
[0075][0076][0077]
注：同列连续不同字母表示差异显著(p《0.05)。
[0078]
实施例2：
[0079]
壳聚糖絮凝预处理的单因素试验，取2g的壳聚糖加入到1％的冰乙酸中，充分搅拌，制成20g/l的壳聚糖溶液；将黄浆水中加入一定量的壳聚糖溶液，分别考察静沉时间、ph值、静沉温度、壳聚糖添加量四个因素对蛋白去除率的影响；
[0080]
方法：(1)静沉时间对黄浆水中蛋白去除率的影响，向黄浆水中添加20ml浓度为20g/l的壳聚糖溶液(0.4g/l)，调节ph＝5.0，放入预设温度为40
°
c的水浴锅中，控制时间分别为15、30、45、60、75min，每组进行三次平行试验，然后将黄浆水以8000rpm的转速离心10min取上清液测定蛋白去除率；
[0081]
结果：从图1可以看出，随着时间的不断增加黄浆水中蛋白的去除率不断上升，但当时间在60～75min时蛋白的去除率变化趋于缓慢；这可能是因为时间越长，壳聚糖与蛋白质分子结合越多，蛋白质去除效果越好，但随着时间的不断增加，结合能力达到饱和，导致结合缓慢；因此选取时间60min作为后续的响应面优化中心点较为合适；
[0082]
方法：(2)ph值对黄浆水中蛋白去除率的影响，向黄浆水中添加20ml浓度为20g/l的壳聚糖溶液(0.4g/l)，调节ph值分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，放入预设温度为40℃的恒温水浴锅中，控制时间为45min，每组进行三次平行试验，然后将黄浆水以8000rpm的转速离心10min取上清液测定蛋白去除率；
[0083]
结果：从图2可以看出，随着ph值的不断增加黄浆水中蛋白的去除率先明显上升而后缓慢下降，在ph＝5.0时蛋白的去除率最大；这可能是因为壳聚糖溶解在稀乙酸溶液中带正电荷，而此时的大豆蛋白带负电荷，两者静电相互作用的结果导致了蛋白去除率的上升；
随着ph值的增加，壳聚糖的质子化作用逐渐增强，它把自己聚集成更大的颗粒，削弱了与蛋白质的结合力，从而导致蛋白去除率的下降；因此选取ph＝5.5作为后续的响应面优化中心点较为合适；
[0084]
方法：(3)静沉温度对黄浆水中蛋白去除率的影响，向黄浆水中添加20ml浓度为20g/l的壳聚糖溶液(0.4g/l)，调节ph＝5.0，放入预设温度分别为20、30、40、50、60℃的恒温水浴锅中，控制时间为45min，每组进行三次平行试验，然后将黄浆水以8000rpm的转速离心10min取上清液测定蛋白去除率；
[0085]
结果：从图3可以看出，随着温度的不断增加黄浆水中蛋白的去除率呈现先增加后下降的趋势；在30℃时蛋白的去除率最高为41.57％，而后蛋白的去除率逐渐下降；这可能是因为壳聚糖分子和蛋白质分子在较低温度下发生絮凝，但是随着温度的升高，这两个分子的结构被破坏，从而导致较低的絮凝度；因此选取温度30℃为后续的响应面优化中心点较为合理；
[0086]
方法：(4)壳聚糖添加量对黄浆水中蛋白去除率的影响，向黄浆水中分别添加10ml浓度为20g/l的壳聚糖溶液(0.2g/l)、20ml浓度为20g/l的壳聚糖溶液(0.4g/l)、30ml浓度为20g/l的壳聚糖溶液(0.6g/l)、40ml浓度为20g/l的壳聚糖溶液(0.8g/l)、50ml浓度为20g/l的壳聚糖溶液(1.0g/l)的壳聚糖，调节ph＝5.0，放入预设温度为40℃的恒温水浴锅中，控制时间为45min，每组进行三次平行试验，然后将黄浆水以8000rpm的转速离心10min取上清液测定蛋白去除率；
[0087]
结果：从图4可以看出，随着壳聚糖添加量的不断增加黄浆水中蛋白的去除率不断升高后又下降；在添加量为0.2～0.8g/l的时候蛋白的去除率明显上升，而0.8～1.0g/l时蛋白的去除率快速下降，并且下降的速度高于上升的速度；这可能是因为壳聚糖添加过量，造成聚合物失去架桥作用而影响蛋白的聚集沉降；因此选取壳聚糖添加量0.6g/l作为后续的响应面优化中心点较为合适；
[0088]
方法：浆水预处理的响应面优化试验，在单因素试验基础上，最终选择(a)静沉时间/min、(b)ph值、(c)静沉温度/℃和(d)壳聚糖添加量/g/l四个因素为自变量，并以蛋白去除率为响应值，根据box-behnken中心组合设计原理，进行了四因素三水平的响应面分析试验；
[0089]
表2-6box-behnken试验因素水平表
[0090][0091]
结果：表2-7box-behnken中心组合试验结果
[0092][0093][0094]
通过design-expert8.05.b软件对表7的数据进行回归分析，可得到二次回归模型的方差分析表8的二次多项式回归方程如下：
[0095]
y＝52.00
–
1.21*a
–
0.95*b+0.93*c+1.64*d+1.00*a*b
–
1.00*a*c
–
0.97*a*d+1.30*b*c+3.70*b*d+2.10*c*d
–
10.62*a2
–
7.25*b2
–
8.35*c2
–
1.87*d2；
[0096]
式中y为蛋白去除率，a为静沉时间，b为ph值，c为静沉温度，d为壳聚糖添加量；由
表8的方差分析，我们可以分析得到的模型的p值小于0.01为极显著，失拟项p值大于0.05为不显著，说明试验建模成立，且r2值为0.96说明模型拟合度较好；由表8的回归模型的显著性分析可知，对于蛋白去除率而言壳聚糖添加量影响极显著、其次为静沉时间、然后为ph值，最后为静沉温度；
[0097]
结果：ph值与壳聚糖添加量对蛋白去除率有极显著影响，其曲线较陡，与回归方程方差分析结果相一致；
[0098]
结果：经响应面优化试验优化后，预处理的最优工艺参数为静沉时间为67.58min，ph＝5.55，静沉温度为30.89℃，壳聚糖添加量0.69g/l，此时蛋白去除率的预测值为48.94％；根据试验实际控制条件，将静沉时间调整为68.00min，调整ph＝5.5，静沉温度调整为31℃，壳聚糖添加量调整为0.7g/l，在此条件下进行三次平行试验；最终蛋白去除率为48.39
±
0.27％，与响应面预测值相符，说明该优化条件可应用于试验中；在此最优预处理条件下，测定水苏糖保留率为90.35％，因此证明此预处理条件对黄浆水中水苏糖含量几乎没有影响。
[0099]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。