专利名称：一种大孔径胆红素吸附剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属医学生物工程领域，涉及一种大孔径胆红素吸附剂及其制备方法，具体为将保护游离胺基后的胺化壳聚糖进行交联，在高压静电下喷入低温存储器内快速成型。 所得的高胺基壳聚糖微球体积可控，大小均一、表面以及内部孔径丰富，对胆红素吸附性能好。
背景技术：
胆红素是血红蛋白及其他血红素蛋白中的血红素在巨噬细胞或其他网织内皮细胞及肝细胞中的代谢产物。80% 85%的胆红素来自衰老的红细胞崩解；15%左右是由在造血过程中尚未成熟的红细胞在骨髓中被破坏(骨髓内无效性红细胞生成)而形成的；少量来自含血红素蛋白，如肌红蛋白、过氧化物酶、细胞色素等的破坏分解。异常的胆红素增高可造成肝脏和胆管功能紊乱、对大脑和神经系统引起不可逆的损害。目前有针对高胆红素血症的治疗技术主要有光线疗法和血液净化疗法。前者主要针对黄疸症状较轻的患者和新生儿患者；后者主要针对黄疸症状较重的患者，包括血浆置换和血液灌流。血浆置换疗法需要大量新鲜血浆，价格昂贵。血浆灌注吸附疗法费用低廉、 副作用小，应用前景良好。其中具有良好吸附性能的胆红素吸附剂是研究重点之一，研究范围从早期的活性炭到后来的苯乙烯-二乙烯苯共聚物、环糊精、壳聚糖衍生物等。活性炭是最早使用的生物吸附剂，曾被广泛用于内、外源性毒素的清除，但对于胆红素效果欠佳，主要原因是活性炭对胆红素特异性差、吸附剂本身孔径小。树脂吸附剂具备一定的特异性，自身的胺基、羧基、疏水作用以及静电吸附力可以有效的吸附胆红素。但目前大多数树脂吸附剂都是通过离子液体_水双相/油双相/反相体系悬浮聚合法制备，吸附剂体积大小难以控制、表面及内部孔径较小，一般为5 10 μ m，而且吸附效果欠佳。本发明采取胺化交联后的壳聚糖通过高压静电下低温冻存技术快速成型，得到体积可控、颗粒大小均一、表面及内部孔径较大的吸附剂颗粒。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述的技术问题而提供一种体积可控、颗粒大小均一的一种大孔径胆红素吸附剂及其制备方法。本发明的技术方案
一种大孔径胆红素吸附剂的制备方法，该方法包括以下步骤 (1)、壳聚糖的胺化
在浓度为5% (wt/v)的壳聚糖乙醇溶液中加入浓度为0. 08mmol/L 的胺化剂，即乙二胺水溶液，45°C反应时间4h后，加入5%甲醛水溶液保护胺化后的壳聚糖上游离胺基，即得胺化后的壳聚糖溶液；
上述的各溶液的用量，按溶液的体积比例，即5% (wt/v)的壳聚糖乙醇溶液0. 08mmol/L的乙二胺水溶液5%的甲醛水溶液为10 3 1 ；
所用的壳聚糖的分子量为40万，脱乙酰度为84、9% ； (2)、壳聚糖的交联
在步骤(1)所得的胺化后的壳聚糖溶液中加入浓度为0. 1%的戊二醛水溶液，控制转速为120r/min、温度为65°C下反应30min，即得交联后的壳聚糖溶液；
浓度为0. 1%的戊二醛水溶液的加入量相对于步骤(1)所用的浓度为5% (wt/v)的壳聚糖乙醇溶液的体积比即浓度为0. 1%的戊二醛水溶液浓度为5% (wt/v)的壳聚糖乙醇溶液为1 :10 ； (3 )、高压静电下低温快速成型
通过喷射泵控制喷射速度为70mm/h将步骤(2)所得的交联后的壳聚糖溶液自上而下垂直滴入置于高压静电仪上的温度为-196°C的低温冻存器内的液氮中以形成壳聚糖微球颗粒；
滴入过程中控制高压静电仪的U=55kv，f=90Hz, Pff=6ms ； (4)、微球的纯化
从低温冻存器内的液氮中过滤出步骤(3)所形成的壳聚糖微球颗粒后，放入温度为_55°C，真空度为20. 92 μ bar的真空冻干机中冻干后，依次应用无水酒精、磷酸盐缓冲液 (PBS)、去离子水洗涤两遍，最终得到本发明的一种大孔径胆红素吸附剂。所得的一种大孔径胆红素吸附剂，其平均颗粒直径约500 μ m，表面以及内部孔径约40 μ m并且相互交通。所得的大孔径胆红素吸附剂用于清除血液中游离胆红素。本发明的有益效果
本发明的大孔径胆红素吸附剂的原材料生物相容性好，冻干后三次洗涤，经X线衍射分析(X-RD )检测，未见化学残基遗留。本发明的一种大孔径胆红素吸附剂，由于其制备过程通过胺化、保护胺基，从而增加了大孔径胆红素吸附剂的胺基含量，大量的胺基使得吸附剂颗粒对胆红素的吸附作用增加。又由于制备过程中采用高压静电下的喷射泵使得所得的吸附剂颗粒直径可调控。同时，由于制备过程采用低温快速成型技术，喷入液氮中的吸附剂溶剂凝固膨胀，增大了吸附剂表面及内部孔径。
图1、扫描电子显微镜100X下的胆红素吸附剂颗粒扫描2、扫描电子显微镜500X下的胆红素吸附剂颗粒扫描图。图3、扫描电子显微镜1000X下的胆红素吸附剂颗粒表面及内部孔径扫描图。
具体实施例方式下面通过实施例并结合附图对本发明作进一步描述，但并不限制本发明。本发明所用的制备大孔径胆红素吸附剂的设备，包括喷射泵、注射器、低温冻存器、高压静电仪，喷射泵提供动力给注射器，控制注射器中的胺化交联的壳聚糖溶液在高压静电场中以一定的速率自上而下垂直注入到低温存储器； 本发明所用的高压静电仪上海理工大学； 所用的喷射泵=Angel 5805型，上海安洁电子； 所用的真空冻干机VIRTIS，BT3. 3EL ； 所用的扫描电子显微镜PHILIPS，XL30 FEG ； 壳聚糖Sigma，USA;
乙二胺AR，上海国药集团化学试剂有限公司； 甲醛AR，上海太平洋化工公司； 戊二醛BR，上海国药集团化学试剂有限公司； 实施例1
一种大孔径胆红素吸附剂，其通过如下方法制备
(1)、壳聚糖的胺化
在IOml浓度为5%的壳聚糖溶液中加入3ml浓度为0. 08mmol/L 的乙二胺水溶液，于45°C反应4h后，加入浓度为5%的甲醛水溶液 Iml ；
所用的壳聚糖的分子量为40万，脱乙酰度为84、9% ；
(2)、壳聚糖的交联
在步骤(1)胺化后的壳聚糖单体中加入Iml浓度为0. 1%的交联剂戊二醛水溶液，控制转速为120r/min，温度为65°C，反应30min ； (3 )、高压静电下低温快速成型
将步骤(2)交联后的壳聚糖溶液15ml加入喷射泵，通过喷射泵，控制喷射速度为70mm/ h，垂直滴入到置于高压静电仪上的温度为_196°C的低温冻存器内的液氮中以形成壳聚糖微球颗粒；
滴入过程中控制高压静电仪的U=55kv，f=90Hz, Pff=6ms ； (4)、微球的纯化
步骤(3 )滴入完成后，从低温冻存器内的液氮中过滤出壳聚糖微球颗粒，放入温度为_55°C，真空度为20. 92 μ bar的真空冻干机中冻干后，依次应用无水酒精、磷酸盐缓冲液(PBS)、去离子水洗涤两遍，最终得到本发明的一种大孔径胆红素吸附剂。上述所得的大孔径胆红素吸附剂通过扫描电子显微镜扫描，见图1、图2、图3。其中，图1为扫描电子显微镜100X下的胆红素吸附剂颗粒扫描图，从图1中可以看出，其颗粒的平均直径约500 μ m。图2为扫描电子显微镜500X下的胆红素吸附剂颗粒的扫描图，从图2中可以看出，本发明的大孔径胆红素吸附剂表面孔径均一。图3为扫描电子显微镜1000X下的胆红素吸附剂颗粒表面及内部孔径的扫描图， 从图3中可以看出，其表面及内部孔直径约40 μ m且相互交通。应用实施例1
大孔径胆红素吸附剂用于清除血液中过多游离胆红素。
将实施例1所得的大孔径胆红素吸附剂IOmg与高胆红素血症大鼠血液上清 500 μ 1作为实验组在37°C、60转/分钟的培养箱中振荡共培养2小时。以普通壳聚糖吸附剂颗粒(未高胺化、小孔径)10mg与高胆红素血症大鼠血液上清 500 μ 1作为对照组在37°C、60转/分钟的培养箱中振荡共培养2小时。各组实验前后总胆红素值用全自动生化仪检测(DXC800，Beckman) 0结果实验组总胆红素从117. 4士 12. 2 μ mol/L降到67. 8 士 21. 5 μ mol/L。对照组总胆红素从 117. 4士 12. 2 μ mol/L降到94. 0 士 18. 3 μ mol/L。从而说明本发明的大孔径高胺基化壳聚糖颗粒作为胆红素吸附剂具有较大改进。以上所述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所做的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。
权利要求
1.一种大孔径胆红素吸附剂的制备方法，其特征在于以壳聚糖为单体、乙二胺为胺化剂、甲醛为胺基保护剂、戊二醛为交联剂制备而成，其具体包括如下步骤(1)、壳聚糖的胺化在浓度为5% (wt/v)的壳聚糖乙醇溶液中加入浓度为0. 08mmol/L 的乙二胺水溶液，控制温度为45°C，反应4h后，加入5%的甲醛水溶液，得胺化后的壳聚糖溶液；上述的各溶液的用量，按溶液的体积比例，5% (wt/v)的壳聚糖乙醇溶液0. 08mmol/L的乙二胺水溶液5%的甲醛水溶液为10 3 1 ；(2)、壳聚糖的交联在步骤(1)所得的胺化后的壳聚糖溶液中加入浓度为0. 1%的戊二醛水溶液，控制转速为120r/min、温度为65°C下反应30min，即得交联后的壳聚糖溶液；浓度为0. 1%的戊二醛水溶液的加入量相对于步骤(1)所用的浓度为5% (wt/v)的壳聚糖乙醇溶液的体积比即浓度为0. 1%的戊二醛水溶液浓度为5% (wt/v)的壳聚糖乙醇溶液为1 :10 ； (3 )、高压静电下低温快速成型通过喷射泵控制喷射速度为70mm/h，将步骤(2)所得的交联后的壳聚糖溶液自上而下垂直滴入置于高压静电仪上的温度为 -196°C的低温冻存器内的液氮中以形成壳聚糖微球颗粒； 滴入过程中控制高压静电仪的U=55kv，f=90Hz, Pff=6ms ； (4)、微球的纯化从低温冻存器内的液氮中过滤出步骤(3)所形成的壳聚糖微球颗粒后，放入温度为_55°C，真空度为20. 92 μ bar的真空冻干机中冻干后，依次应用无水酒精、磷酸盐缓冲液、去离子水洗涤两遍，最终得到本发明的一种大孔径胆红素吸附剂。
2.如权利要求1所述的一种大孔径胆红素吸附剂的制备方法，其特征在于步骤(1)所用的壳聚糖的分子量为40万，脱乙酰度为84、9%。
3.如权利要求1或2所述的一种大孔径胆红素吸附剂的制备方法所得的大孔径胆红素吸附剂，其特征在于颗粒平均直径约500 μ m,表面以及内部孔径约40 μ m并且相互交通。
4.如权利要求3所述的一种大孔径胆红素吸附剂的制备方法所得的大孔径胆红素吸附剂用于清除血液中游离胆红素。
全文摘要
本发明公开了一种大孔径胆红素吸附剂及其制备方法和应用。它是在壳聚糖单体与胺化剂乙二胺反应并保护游离胺基后加入交联剂戊二醛，在高压静电环境下喷入低温冻存器内快速成型。所得的大孔径胆红素吸附剂颗粒大小均一，直径约500μm，吸附剂颗粒表面以及内部孔径丰富、直径约40μm并且相互交通。本发明的大孔径胆红素吸附剂的原材料生物相容性好，冻干后三次洗涤，未见化学残基遗留，对胆红素的吸附作用增加，其制备过程吸附剂颗粒直径可调控。使用该吸附剂进行体外血浆灌洗或者共培养时，胺基、疏水作用以及静电作用可以有效地吸附胆红素；该吸附剂表面及内部丰富的孔径增大了滤过面积，提高了吸附效率。
文档编号B01J20/28GK102441364SQ20111029918
公开日2012年5月9日 申请日期2011年9月29日 优先权日2011年9月29日
发明者崔龙, 彭承宏, 董亚东, 韩宝三, 黄芳 申请人:上海交通大学医学院附属瑞金医院