用于高体积分数颗粒微滤的外壁聚焦的设备及其制造方法与流程

本申请要求2016年7月21日提交的新加坡专利申请no.10201606028t的优先权。

本发明一般地涉及微滤系统，并且更具体地涉及用于在高颗粒体积分数下外壁聚焦以在低剪切应力下实现高性能颗粒微滤的方法和设备。

背景技术：

惯性微流体最近已经在微流体业界产生了兴趣，因为惯性微流体通常以约1ml/分钟的通量存在于具有约100μm量级的特征长度尺度的通道中，使得其对于宏观应用在技术上可行。因此，高颗粒体积分数的基于惯性微流体的微滤对于生物技术和血液应用已变得很重要。

大多数惯性微流体应用通常仅涉及稀释浓度(<0.5体积％)下的颗粒或细胞，其中颗粒被认为是非相互作用的，因为惯性聚焦对于惯性微流体是不可或缺的一部分。因为颗粒-颗粒相互作用使颗粒散焦，在高颗粒体积分数下难以实现惯性聚焦。

已经显示具有偏斜的迪恩剖面(dean’sprofile)的梯形螺旋通道微滤装置在10⁸细胞/ml的细胞浓度下以75％的效率将中国仓鼠卵巢(cho)细胞过滤到螺旋通道的外壁。然而，这样的效率对于许多应用来说是不够的，并且梯形螺旋通道难以制造，并且因此是不可缩放的。

因此，需要一种用于高颗粒体积分数的可缩放惯性微流体装置，以实现高通量微滤。此外，结合附图和本公开的背景技术，从随后的详细描述和所附权利要求中，其他可取的特征和特性将变得显而易见。

技术实现要素：

根据本发明，提供了一种用于微滤的设备。用于微滤的设备包括一个或多个惯性微流体装置，每个装置包括矩形微流体通道的多个螺旋。至少一个惯性微流体装置被配置成利用外壁聚焦以用于颗粒的微滤。

根据本发明的另一方面，提供了一种用于制造惯性微流体装置的方法。该方法包括在刚性材料基板上微加工具有一个或多个输入通道的矩形螺旋微通道和多个输出通道，所述多个输出通道被配置成利用外壁聚焦以用于颗粒的微滤。

附图说明

在附图中，相同的附图标记在各个视图中指代相同或功能相似的元件，并且附图与下面的详细描述一起被并入说明书并形成说明书的一部分，附图用于说明各种实施例并解释各种原理以及根据本实施例的优点。

图1描绘了包括常规惯性微流体过滤器的小型灌注过滤器的图示的平面图。

图2描绘了常规的无膜惯性微流体过滤器的图示的俯视平面图。

图3描绘了根据本实施例的外壁聚焦惯性微流体过滤器的图示的俯视平面图。

图4描绘了根据本实施例的在图3中图示的外壁聚焦惯性微流体过滤器的俯视平面图。

图5包括图5a和5b，描绘了高体积分数微滤，其中，图5a描绘了根据本实施例的外壁聚焦而图5b描绘了常规的内壁聚焦。

图6描绘了根据本实施例的通道内惯性微流体过滤器的从ow(0％)到iw(100％)的颗粒体积分数对颗粒分布的曲线图。

图7描绘了现有技术的螺旋梯形通道装置的图示的俯视平面图。

图8是在各种细胞体积分数下图7中图示的现有技术装置的分离效率的柱状图。

图9是根据本实施例的图3的装置在各种细胞体积分数下的分离效率的柱状图。

图10是与根据本实施例的图3的装置相比的图7中图示的现有技术装置的过滤器效率的柱状图。

图11描绘了产生赫赛汀的未过滤chodg44细胞系和根据本实施例过滤的产生赫赛汀的chodg44细胞系的可比较生长、生存率和生产率的曲线图。

图12描绘了根据本实施例的组合的外壁聚焦和内壁聚焦惯性微流体装置的俯视平面图示。

图13描绘了根据本实施例的图12的惯性微流体装置的六孔板实施方式的左前俯视透视图。

图14描绘了利用根据本实施例的一个或多个惯性微流体装置的连续血液成分分离装置的图示。

图15描绘了利用根据本实施例的一个或多个惯性微流体装置的小体积血液离心机的图示。

并且图16描绘了利用根据本实施例的惯性微流体装置的灌注微生物反应器的图示。

技术人员将理解，附图中的元件是为了简单和清楚而示出的，并且不一定按比例描绘。

具体实施方式

以下详细描述本质上仅是示例性的，并不意图限制本发明或本申请以及本申请的用途。此外，无意受到在本发明的前述背景技术或以下详细描述中提出的任何理论的约束。本实施例的目的是提出将外壁聚焦应用于在微流体装置的矩形螺旋通道中以高颗粒体积分数存在的惯性微流体，以改善细胞微滤性能。高颗粒体积分数是指颗粒体积分数大于10⁷颗粒/毫升(细胞/ml)，并且本细胞微滤应用导致了过滤效率大大提高。例如，使用在10⁸细胞/ml的高体积分数下产生中国仓鼠卵巢(cho)细胞的绿色荧光蛋白(gfp)，已经实现了大于98％的过滤效率，而使用在10⁸细胞/ml下的产生cho细胞的gfp的现有实验无法达到75％的过滤效率。

由于荧光微球倾向于在高浓度下聚集，因此难以进行对在高于10⁷细胞/ml的细胞体积分数下的惯性聚焦的研究。具有绿色荧光蛋白(gfp)的中国仓鼠卵巢(cho)细胞已被用于规避这种限制，并且还用作软生物细胞的更准确的机械模型。

参见图1，描绘了小型灌注过滤器的图示的平面图100。小型灌注过滤器包括生物反应器102和用作离心机106的常规惯性微流体过滤器104。生物反应器102连接到输入108，以接收通过灌注的介质的输入。生物反应器102还连接到输出110，以向微流体过滤器104提供细胞的灌注输出。

如插图130中所示，生物反应器102的输出110将细胞的灌注输出提供给微流体过滤器104的入口112。如插图130中所示，微流体过滤器104是形成螺旋的微流体通道。微流体过滤器104的上清液出口114提供没有细胞的收获介质的过滤的输出116。微流体过滤器104的过滤的细胞的出口118向细胞浓缩返回120提供细胞的反馈，以返回到生物反应器102。

插图132示出了在入口112附近微流体过滤器104的微流体螺旋通道的整个横截面136中扩散的细胞134的俯视平面图。另一个插图138描绘了在出口114,118附近的微流体过滤器104的微流体螺旋通道的横截面140的俯视平面图，出口具有微流体螺旋通道的内壁(iw)142和外壁(ow)144。在插图138中可以看到，在出口114,118附近，细胞134沿着微流体螺旋通道的内壁142聚焦。沿着内壁142聚焦的大多数细胞134将顺着内壁142并通过过滤的细胞的出口114输出微流体过滤器104，而污染物一小部分细胞134将顺着外壁144并通过上清液细胞出口118输出微流体过滤器104，以经由细胞浓缩返回120而返回生物反应器102。

图2描绘了常规的无膜惯性微流体过滤器的图示的俯视平面图200。无膜惯性微流体过滤器包括螺旋微流体通道202，用于使颗粒从一个或多个入口204沿方向205流动到一个或多个出口206(标识为出口206a至206f)。第一插图210示出在入口204附近的微流体螺旋通道202的横截面212中的颗粒的俯视平面图。虽然横截面212中的颗粒包括不同大小的颗粒，但是颗粒在整个横截面212中均匀地扩散。

第二插图214示出在从入口204到出口206的距离的大约三分之二处微流体螺旋通道202的横截面216中的颗粒的俯视平面图。横截面216中的颗粒已经在微流体螺旋通道202中按大小排列，其中较大的颗粒沿着内壁(iw)排列，而所描绘的最小颗粒排列在通道中间附近。第三插图218示出包括出口206a至206f的微流体螺旋通道202的横截面220中的颗粒的俯视平面图。当出口206散开(fanout)时，较大的颗粒通过包括内壁(iw)的出口206a离开，其次的较大颗粒通过出口206b离开，并且所示的最小颗粒通过出口206c离开。

参见图3，俯视平面图300描绘了根据本实施例的外壁聚焦惯性微流体过滤器302的图示。惯性微流体过滤器302包括微流体通道306的多个螺旋304，用于使具有颗粒或细胞的液体、流体或介质沿方向310从入口308流动到两个出口312(标识为出口312a至312f)。第一插图320示出作为在入口308附近的螺旋矩形微流体通道306的横截面322中的介质中的颗粒的细胞的俯视平面图。虽然横截面322中的细胞包括不同大小的细胞，但如插图320所示，细胞在整个横截面322中均匀地扩散。此外，虽然微流体通道306是矩形形状，但是根据本实施例也可以使用梯形形状的微流体通道的螺旋，其中通道的高度是恒定的并且一个或两个壁从通道的顶表面向内或向外朝通道的底表面倾斜。

第二插图330和第三插图332示出作为在出口312a和312b附近的螺旋矩形微流体通道306的横截面334中的颗粒的细胞的俯视平面图。第二插图330描绘了当约10⁷细胞/ml流过微流体通道，该10⁷细胞/ml转化为螺旋矩形微流体通道306中约1.7％体积分数的细胞的体积分数时，细胞的惯性聚焦。可以看出，当螺旋矩形微流体通道306中的细胞的体积分数为约1.7％时，细胞的惯性聚焦基本上是内壁(iw)聚焦。

第三插图332描绘了当约10⁸细胞/ml流过微流体通道并且螺旋矩形微流体通道306中的细胞的体积分数为约17％体积分数时的细胞排列。因此，可以看出，当根据本实施例的惯性微流体过滤器302的螺旋矩形微流体通道306中的细胞的体积分数为约17％体积分数时，细胞的惯性聚焦不再是内壁(iw)聚焦，而是有利地移位到外壁(ow)聚焦。虽然我们一直在讨论具有细胞的介质的微滤，但是微滤装置302可以用于具有任何种类的颗粒的任何液体的微滤，例如具有颗粒的流体(例如，水中的灰尘颗粒的微滤)或具有细胞的介质。而且，在不限制微滤装置的应用的情况下，颗粒直径与微通道的高度(即流体动力学直径)的优选比率约为0.01至0.5。而且，虽然我们一直在讨论具有一个入口和两个出口的微滤装置，但是可以提供任何数量的入口和出口，并且出口的数量可以大于、等于或小于入口的数量。而且，尽管图3描绘了1.7％的体积分数和17％的体积分数，但是根据本实施例向外壁聚焦的移位可以以低至5％体积分数的体积分数发生，并且取决于颗粒的半径和介质中颗粒的相互作用，可以低至1％的体积分数发生。

由于迪恩力和剪切梯度力之间的平衡，惯性聚焦发生在矩形螺旋通道的内壁上。然而，当颗粒体积分数增加至高浓度(例如，10⁸细胞/ml)时，颗粒的平衡位置从插图330中所示的内壁聚焦移位到如插图332中所示的外壁聚焦。在高体积分数下的外壁聚焦似乎是由于归因于悬浮液中颗粒的高体积分数的颗粒-流体相互作用而引起的。颗粒彼此的紧密接近无意中修改了流动剖面，导致从内壁聚焦到外壁聚焦的切换。从内壁聚焦到外壁聚焦的这种切换发生在通道高度恒定的矩形形状和梯形形状的微流体通道中。

图4描绘了根据本实施例的图3中图示的外壁聚焦惯性微流体过滤器302的俯视平面图400。使用计算机数控(cnc)微铣削在聚碳酸酯基板上微加工矩形微通道306。选择聚碳酸酯基板是因为与较软的pdms装置相比，聚碳酸酯是生物相容的，可以是大规模原型化并且在操作期间不太可能变形。另外，在聚碳酸酯基基板上在多个螺旋中微加工矩形微通道提供了高度可缩放的制造方法。可以使用其他刚性材料，例如热塑性材料或其他聚碳酸酯材料，以提供与聚碳酸酯基板类似的可缩放的优点。而且，虽然刚性材料对于可缩放制造来说是优选的，但是可以为矩形微通道306提供一个或多个非刚性壁。然而，这样的柔性材料可以产生与对于微通道306的所有壁使用刚性材料相比更扩散的聚焦边缘和/或更宽的聚焦宽度。

参见图5(图5包括图5a和5b)，描绘了由单色相机捕获的四倍放大率的荧光光学显微镜图像500,550。图像500描绘了根据本实施例的在聚碳酸酯微滤器的矩形螺旋微通道中具有gfp的cho细胞流，其中高细胞体积分数为约17％(即，10⁸细胞/ml的cho细胞浓度)。图像500描绘了在聚碳酸酯微滤器的矩形螺旋微通道中具有gfp的cho细胞流，其中细胞体积分数为约1.7％(即，10⁷细胞/ml的cho细胞浓度)。为了确定细胞体积分数，使用以matlab编写的专用图形用户界面(gui)来分析图像500,550。使用由美国印第安纳州的beckmancoulter公司制造的vicell^tm自动细胞计数器进行细胞计数。

图6描绘了惯性微流体过滤器302内沿着微通道306的荧光信号与相对位置的相对的曲线图600。沿x轴602从“0”至100绘制沿着矩形微通道306的底板的位置，其中“0”指示外壁(ow)，100指示内壁(iw)。沿y轴604绘制荧光信号作为荧光的相对强度。可以看出，随着细胞体积分数以2×10⁷细胞/ml的步长从1×10⁷细胞/ml的cho细胞浓度增加到1×10⁸细胞/ml，细胞的位置从沿内壁的向内聚焦移位到沿外壁的向外聚焦。

已经在类似流率但在低细胞体积分数下在梯形螺旋通道中观察到外壁聚焦。参见图7，平面图700描绘了一个这样的现有技术螺旋梯形通道装置702的图示的俯视平面图700。梯形通道704的横截面在插图706(入口710附近的横截面708的图示)和插图712(出口716a，716b附近的横截面714的图示)中示出。看起来螺旋梯形通道装置702中的外壁聚焦是由梯形通道中倾斜的迪恩二次流动剖面引起的。从螺旋梯形通道装置702的分离效率的图8中的柱状图800可以看出，在低cho细胞浓度直至10⁶细胞/ml时分离效率始终高，但随着细胞浓度增加而降低。例如，在细胞浓度为10⁸细胞/ml时，分离效率降至74.8％。

螺旋梯形通道装置702不能在10⁸细胞/ml下高效地过滤cho细胞(仅～75％的分离效率)。通过利用外壁聚焦和优化的通道尺寸，惯性微流体过滤器302在cho细胞浓度为10⁸细胞/ml时可实现98.2％的过滤效率，并且对于所有细胞浓度，过滤效率>95％，甚至对于从内壁聚焦到外壁聚焦的转变内的细胞浓度，如图9所示。参见图9，描绘了根据本实施例的在外壁聚焦惯性微流体过滤器302的10⁷细胞/ml和10⁸细胞/ml之间的各种cho细胞浓度下的分离效率的柱状图900。与外壁聚焦是由梯形通道中的偏斜的迪恩二次流动剖面引起的螺旋梯形通道装置702不同，似乎是由导致迪恩二次流动剖面变形的颗粒-流体相互作用和由非稀释状态下增加的颗粒-颗粒相互作用而引起的惯性微流体过滤器302的外壁聚焦，提供了相当一致的高过滤效率，其大于95％，即使细胞浓度在细胞从内聚焦转换到外聚焦的10⁷细胞/ml和10⁸细胞/ml之间，如柱状图900所示。

参见图10，柱状图1000总结了与根据本实施例的外壁聚焦惯性微流体过滤器302(柱1006,1008)相比，螺旋梯形通道装置702(柱1002,1004)与其之间的过滤器效率比较。柱1002,1006指示两个装置在10⁷细胞/ml下的过滤效率，而柱1004,1008指示两个装置在10⁸细胞/ml下的过滤效率。

由于在外壁聚焦惯性微流体过滤器302中，外壁聚焦在较低流率(流率低至每分钟四分之一毫米(即0.25ml/分钟))下占主导地位，因此过滤后的细胞将经历非常低的剪切应力(<0.5pa)。另外，用外壁聚焦惯性微流体过滤器302过滤的细胞有利地能够保持与未过滤(对照)细胞相同的生长速率和生产率。参见图11，图示1100描绘了产生赫赛汀的未过滤chodg44细胞系和根据本实施例过滤的产生赫赛汀的chodg44细胞系的可比较的生长、生存率和生产率曲线的图。曲线图1101绘制了分别对于产生赫赛汀的过滤和未过滤(对照)chodg44细胞系的生长曲线1102,1104和生存率曲线1106,1008。曲线图1101中插入的曲线图110绘制了分别对于过滤和未过滤细胞系的生产率曲线1112,1114，并且显示对于两种细胞系，生产率/产物滴度不受通过外壁聚焦惯性微流体过滤器302过滤的影响。

外壁聚焦惯性微流体过滤器302使用聚碳酸酯基板上cnc加工的微通道来制造，其具有与大规模生产相容(即，高度可缩放)的优点，并且与较软的pdms装置相比在操作期间不太可能变形。

图12描绘了根据本实施例的组合的外壁聚焦和内壁聚焦惯性微流体装置1202,1204的俯视平面图示1200。外壁聚焦惯性微流体装置1202被配置成利用外壁聚焦来通过具有将一个入口1208连接到两个出口1210a，1210b的矩形微通道1206的五到七个螺旋来从介质微滤细胞。出口1210a是外壁聚焦出口，其宽度基本上是矩形微通道1206宽度的三分之二，而出口1210b是内壁聚焦出口，其宽度基本上是矩形微通道1206宽度的三分之一。虽然该特定实施例具有宽度基本上是矩形微通道1206宽度的三分之二的外壁聚焦出口1210a和宽度基本上是矩形微通道1206宽度的三分之一的内壁聚焦出口1210b，但是这些宽度是示例性的，并且根据本实施例，可以使用矩形微通道1206的宽度的十分之一(1/10)到矩形微通道1206的宽度的一半(1/2)之间的任何宽度。

惯性微流体装置1204是两阶段惯性微流体装置，每个阶段是内壁聚焦惯性微流体装置，其具有将一个入口连接到两个出口的五到七个矩形螺旋通道。入口1212是第一阶段的入口，并且连接到惯性微流体装置1202的内壁聚焦出口1210b，以提供额外的过滤从而从介质中去除细胞。第一阶段的内壁出口是惯性微流体装置1204的第一出口1214。第一阶段的外壁出口连接到第二阶段的入口，并且第二阶段的内壁和外壁出口分别为惯性微流体装置1204的第二出口1216和第三出口1218。

外壁聚焦和内壁聚焦的组合提供了改进的过滤装置。另外，这样的组合装置可以装配在常规的六孔板1302上，如图13的左前俯视透视图1300所示，以提供额外的容量。例如，图12中所示的过滤装置可以连接到微生物反应器，例如由tapbiosystems制造的ambr(tap)15ml或250ml生物反应器，tapbiosystems是英国剑桥的sartoriusstedimbiotech的一部分。当在六孔板1302上以六孔配置堆叠时，堆叠的过滤装置可用于过滤500ml至5l的生物反应器。因此，根据本实施例的过滤装置可用于过滤从2ml生物反应器到5l生物反应器的生物反应器。

参见图14，图示1400描绘了利用根据本实施例的一个或多个惯性微流体装置的连续血液成分分离装置1402。从动物接收的细菌、血小板和白细胞边集的血液输入1402可以通过一个或多个惯性微流体装置过滤以从血液中去除废物颗粒1404，使得过滤的血液1406可以返回动物。使用根据本实施例的一个或多个惯性微流体装置可以将100μl/分钟的常规微滤通量增加至1μl/分钟。

图15描绘了利用根据本实施例的一个或多个惯性微流体装置的小体积血液离心机的图示1500。根据本实施例的惯性微流体装置可用于在高血细胞比容下分离血液成分而无需预稀释，如图示1500所示。使用根据本实施例的一个或多个惯性微流体装置可将用于离心小体积血液分离的常规时间从对样品造成损坏的15分钟减少到对样品几乎不造成或不造成损坏的3分钟。

作为生物技术中的生物技术应用，其中高体积分数细胞培养物是普遍的，其可以有利地利用根据本实施例的惯性微流体装置，图16描绘了包含根据本实施例的惯性微流体装置的灌注微生物反应器的图示1600。使用根据本实施例的一个或多个惯性微流体装置可以提供连续灌注微生物反应器，而常规灌注微生物反应器只能提供半灌注。

因此，可以看出，本实施例提供了用于高颗粒体积分数流体的高度可缩放的惯性微流体装置，以实现高通量微滤。在根据本实施例的惯性微流体中的外壁聚焦在微流体装置的矩形螺旋通道中在高颗粒体积分数下发生，以改善细胞微滤性能。高颗粒体积分数是指大于10⁷颗粒/毫升(细胞/ml)的颗粒体积分数，并且利用根据本实施例的微滤装置的细胞微滤应用导致过滤效率大大提高。

尽管已经在本发明的前述详细描述中呈现了示例性实施例，但是应当理解，存在大量变型。还应当理解，示例性实施例仅是示例，并不旨在以任何方式限制本发明的范围、适用性、操作或配置。相反，前面的详细描述将为本领域技术人员提供用于实现本发明的示例性实施例的便利路线图，应当理解，可以对在示例性实施例中描述的步骤和操作方法的功能和布置方面进行各种改变，而不脱离所附权利要求中阐述的本发明的范围。