一种金属纳米簇模拟酶的固定化方法与流程

本发明属于酶固定化和催化领域，主要涉及一种金属纳米簇模拟酶的固定化方法。

背景技术：

天然生物酶具有优异的催化性质，在生化分析、临床检验和工业生产等领域已展现出极高的应用价值。然而，天然生物酶的催化活性易受环境因素影响而大幅降低，并且无法在催化反应中重复使用，导致生物酶的使用成本偏高。天然酶固定化是提高其稳定性和可重复利用性的主要途径。目前，大多数酶固定化方法均采用静电吸附或共价连接的方式将生物酶固定于基质材料(如高分子凝胶、二氧化硅、金纳米粒子等)的表面或内部。基于静电吸附的酶固定化方法通常受限于较低的酶固定化效率。而基于共价连接的酶固定化方法须对酶或基质材料进行多步化学修饰，操作繁琐。并且，与游离的生物酶相比，固定化之后的酶催化活性通常显著降低。这些问题严重制约了生物酶固定化技术的发展以及酶固定化产品的实际应用。

与天然生物酶相比，人工合成的模拟酶具有生产成本低、稳定性高等优点。金属(金、银、铜)纳米簇是近年来新兴的一类模拟酶。金属纳米簇一般由几个到几十个原子组成，可以采用生物分子作为保护配体进行合成，具有良好的稳定性和模拟天然过氧化物酶的催化活性。以模拟酶代替天然酶，发展简便易行的模拟酶固定化方法，实现模拟酶在催化反应中的循环使用，并且提高固定化后模拟酶的催化活性，对提高催化反应效率、降低生产成本具有十分重要的意义。

技术实现要素：

本发明针对天然生物酶固定化中存在的问题，以人工合成的金属纳米簇模拟酶代替天然生物酶，采用高分子聚合物作为共沉淀剂，通过生物分子-金属纳米簇、高分子聚合物、金属离子和磷酸根离子的共沉淀反应，发展了一种简便易行的新型模拟酶固定化方法，固定化之后的模拟酶具有高效的催化活性，性质稳定，并可重复利用。

本发明采用的技术方案如下：

一种金属纳米簇模拟酶的固定化方法，包括以下步骤：

1)以生物分子为配体，合成具有过氧化物酶催化性质的金属纳米簇，然后对其进行透析纯化，采用磷酸盐缓冲溶液，将纯化后的金属纳米簇配制为浓度为0.02～1.0mg/ml的水溶液；

2)向步骤1)中得到的金属纳米簇溶液中依次加入高分子聚合物和金属离子无机盐溶液，获得金属纳米簇模拟酶在无机盐基质中的固定化粗产物；

3)对步骤2)得到的粗产物进行离心、洗涤、真空干燥，得到金属纳米簇模拟酶在无机盐基质中的固定化产物。

在步骤1)中，所述的生物分子优选牛血清白蛋白；所述的金属纳米簇优选以牛血清白蛋白为配体合成的金、银或铜纳米簇；所述的磷酸盐缓冲溶液的浓度优选0.1m，ph值优选7.0～8.0。

在步骤2)中，所述的高分子聚合物优选聚(4-苯乙烯磺酸钠)、十二烷基苯磺酸钠、十二烷基硫酸钠或肝素；所述的金属离子无机盐溶液优选硫酸铜、硫酸钴、硫酸锌、硫酸铁、氯化铜、氯化钴、氯化锌或氯化铁；在混合后的反应体系中，所述的高分子聚合物浓度优选0.1～2.5mg/ml；所述的金属离子无机盐浓度优选0.5～10mm。

在步骤3)中，离心、洗涤、真空干燥指的是在3000～12000转/分条件下离心5～25分钟，然后用去离子水或超纯水洗涤3～5次，25℃真空干燥12～24小时。

本发明采用生物分子同时作为金属纳米簇的保护配体以及无机离子的结合位点，并利用高分子聚合物调控生物分子配体与无机离子的相互作用，通过生物分子-金属纳米簇、高分子聚合物、金属离子和磷酸根离子的共沉淀反应，实现金属纳米簇模拟酶在无机盐基质中的固定化。

与现有酶固定化方法相比，本发明有以下优点：

1、采用金属纳米簇模拟酶代替天然生物酶，降低成本。

2、模拟酶固定化通过共沉淀反应自发进行，无须提供任何外加能量、操作简单，绿色环保。

3、高分子聚合物的加入可有效调控模拟酶的固定化效率。

4、金属纳米簇模拟酶固定化后，催化活性未降低，能够重复利用，可广泛的用于天然过氧化物酶催化的一类反应。

附图说明

图1是实施例1中得到的肝素辅助下金纳米簇模拟酶在磷酸铜基质中固定化产物的透射电子显微镜照片。

图2是实施例1中得到的肝素辅助下金纳米簇模拟酶在磷酸铜基质中固定化产物的扫描电子显微镜照片。

图3为实施例2中金纳米簇模拟酶固定化前后，以3,3',5,5'-四甲基联苯胺为底物的催化活性对比柱状图。

图4为实施例3中金纳米簇模拟酶固定化前后，以邻苯二胺为底物的催化活性对比柱状图。

图5为实施例4中模拟酶固定化产物在以邻苯二胺为底物进行循环催化反应时，催化活性随使用次数的变化图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行具体的说明。

实施例1：金纳米簇模拟酶在磷酸铜基质中的固定化过程

在剧烈搅拌下，将氯金酸水溶液(5ml，10mm，37℃)和牛血清白蛋白水溶液(5ml，50mg/ml，37℃)混合。两分钟后，加入氢氧化钠水溶液(0.5ml,1m)，于37℃下反应12h。溶液颜色由淡黄色渐变为深棕色。用分子量为1000da的透析袋对所得溶液透析72h，即得到以牛血清白蛋白为保护配体的金纳米簇。用磷酸盐缓冲溶液(0.1m，ph7.4)将金纳米簇配制为50ml浓度为0.5mg/ml的溶液。将200μl硫酸铜水溶液(200mm)和200μl肝素水溶液(125mg/ml)加入到金纳米簇溶液中。反应体系中，铜离子的浓度为0.8mm,肝素的浓度为0.25mg/ml。将混合液在室温下放置3天，即得到金纳米簇模拟酶在磷酸铜基质中固定化的粗产物。将粗产物在12000转/分条件下离心15分钟，并用超纯水洗涤3次，于25℃真空干燥12小时、称重。所得产物的透射电子显微镜和扫描电子显微镜照片分别如附图1、2所示，从图中可以明显看出金纳米簇模拟酶固定化产物呈现多层次的花状结构。此类结构比表面积大，便于模拟酶与催化底物的充分接触。

实施例2:不同高分子聚合物对金纳米簇模拟酶固定化效率的影响实验

用磷酸盐缓冲溶液(0.1m，ph7.4)将实施例1中制备的金纳米簇配制成50ml浓度为0.5mg/ml的溶液。分别配制浓度为125mg/ml的聚(4-苯乙烯磺酸钠)、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、肝素水溶液。取上述溶液各100μl，分别加入到金纳米簇溶液中；再分别向各混合液中加入200μl硫酸铜溶液(200mm)。各混合体系中，金纳米簇、高分子聚合物、铜离子的浓度分别为0.5mg/ml,0.25mg/ml以及0.8mm。将混合液在室温下放置3天，即得到不同种类的高分子聚合物存在下，金纳米簇模拟酶的固定化产物。将固定化产物在12000转/分钟条件下离心15分钟，保留上清液。用bca试剂盒测定上清液中模拟酶的含量，按下述公式计算金纳米簇模拟酶的固定化效率。

模拟酶固定化效率＝(模拟酶初始浓度-上清液中的模拟酶浓度)/模拟酶初始浓度。

得到不同种类的高分子聚合物参与金纳米簇模拟酶固定化过程时，模拟酶的固定化效率，结果如附表1所示。

表1

实施例3：以3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)溶液为底物的催化实验

将实施例1中得到的金纳米簇模拟酶固定化产物固体配制成浓度为0.5mg/ml的水相分散液。向1.56ml的磷酸盐缓冲溶液(0.2m，ph4.0)中依次加入300μl的tmb溶液(3.33mm)、100μl的过氧化氢溶液(9.97m)以及40μl上述金纳米簇模拟酶固定化产物水相分散液或同等浓度的金纳米簇模拟酶溶液(未进行固定化的)。以紫外-可见吸收光谱仪测定上述混合溶液在波长为652nm处吸光度随时间的变化值。金纳米簇模拟酶及其固定化产物以tmb为底物的催化活性按照下列公式计算得出。

酶催化活性(tmb,u/mg)＝(652nm处吸光度变化程度(nm/min))/(酶浓度(mg/ml)x0.001)

如附图3所示，金纳米簇模拟酶固定化后，在以tmb为底物的催化反应中，催化活性并未降低。

实施例4：以邻苯二胺(opd)溶液为底物的催化实验

将实施例1中得到的金纳米簇模拟酶固定化产物固体配制成浓度为0.5mg/ml的水相分散液。向177μl的磷酸盐缓冲液(0.1m，ph5.8)中依次加入25μl的opd溶液(1.8mm)、50μl的过氧化氢水溶液(2.49m)以及198μl模拟酶固定化产物水相分散液或同等浓度的金纳米簇模拟酶溶液(未进行固定化的)，最后加入25μl硫酸溶液(2m)和25μl的亚硫酸钠溶液(0.2m)停止反应。以紫外-可见吸收光谱仪测定上述混合溶液在波长为489nm处的吸光度随时间的变化值。金纳米簇模拟酶及其固定化产物以opd为底物的催化活性按照下列公式计算得出。

酶催化活性(opd,u/mg)＝(489nm处吸光度变化程度(nm/min))/(酶浓度(mg/ml)x0.001)

如附图4所示，金纳米簇模拟酶固定化后，在以opd为底物的催化反应中，催化活性显著提高。

实施例4：以邻苯二胺溶液为底物的催化剂循环利用实验

将实施例1中得到的金纳米簇模拟酶固定化产物固体配制成浓度为0.5mg/ml的水相分散液。向900μl的磷酸盐缓冲液(0.1m，ph5.8)中依次加入100μl的邻苯二胺水溶液(1.8mm)、200μl的过氧化氢水溶液(2.49m)以及800μl金纳米簇模拟酶固定化产物的水相分散液，以紫外-可见吸收光谱仪测定上述混合液在波长为424nm处的吸光度随时间的变化值。之后，将上述混合液在12000转/分钟条件下离心10分钟，回收模拟酶固定化产物，用于下一次催化实验。按上述步骤进行催化实验，共重复6次。如附图5所示，金纳米簇模拟酶固定化产物在以opd为底物的催化反应中，循环使用6次之后，仍有70％的催化活性得以保持。