一种基于磁场干预的PCR液滴生成系统的制作方法

本实用新型涉及一种PCR液滴生成芯片，特别涉及一种基于磁场干预的PCR液滴生成系统，属于微流体控制技术领域。

背景技术：

近来，液滴微流控PCR在技术方面的迅速发展已经证明了该技术的优越性并被广泛的应用于生物、化学等领域，尤其在单分子放大和分析方面的优势更加明显。微流控技术能够以每秒钟几千个的速度产生单分散性好的液体，同时又能很好的控制液滴的尺寸和成分，液滴微流控实现了单个液滴的混合、传输和分析的独立控制，在实验中快速形成大量的均一液滴，将反应分隔在多个独立的空间内进行，在单分散的液滴中同时进行多个平行反应，使得平行反应能够在短时间内快速进行，并具有很好的重现性，同时避免了液滴间的交叉污染，消除了PCR偏好于非特异性放大的现象。

随着微流控技术的发展应用，越来越多的科学研究者考虑基于标记物微粒的液滴微流控PCR技术，以期实现可控的液滴产生、便捷的操作和灵活的后期处理分析，而成功的PCR液滴中应该包含一个标记物微粒、均匀的混合液成分，在实验中快速形成大量的均一液滴。然而将微粒应用于液滴微流控的最大难点在于液滴产生过程中微粒物容易沉降或者流动过程中产生堆积，标记物微粒进入微流控通道前沉降或进入通道后排列距离不均一，大大降低了液滴成功包被的效率，即液滴中没有包被或包被两个及以上标记物微粒的无效液滴，又或者液滴大小不均一，均达不到实验者的目的要求，最终导致实验失败或实验重复性差等现象的发生。

技术实现要素：

针对上述技术问题，本实用新型提供了一种基于磁场干预的PCR液滴生成系统，通过在芯片外周增加磁场，利用磁场的干预使得标记物微粒进入微流控通道保持恒定的速度和相对均一的距离，大大提高成功制备有效PCR液滴的效率。

为了实现上述目的，本实用新型采用以下技术方案：

一种基于磁场干预的PCR液滴生成系统，包括PCR液滴生成芯片和用于对所述PCR液滴生成芯片进行磁场干预的磁场干预装置，所述PCR液滴含单个标记物微粒与PCR反应液，所述PCR液滴生成芯片中设有供液体/液滴流动的微流控通道，所述微流控通道又包括标记物微粒溶液入口、PCR反应液入口和混合通道，所述标记物微粒溶液入口、PCR反应液入口共同与混合通道连通，其特征在于，

所述标记物微粒为非磁性微粒时，所述磁场干预装置包括：

用于容置所述标记物微粒溶液的腔体，所述腔体中置有微型磁力转子，所述腔体的出口与所述标记物微粒溶液入口连通，以及

用于对所述微型磁力转子施加磁场并调节微型磁力转子的转速以使标记物微粒按照预设的速度和间距进入所述标记物微粒溶液入口的外周旋转磁场发生器；

所述标记物微粒为磁性微粒时，所述磁场干预装置包括：

用于对所述混合通道施加等间距磁场以使标记物微粒按照预设的间距经过所述混合通道的等间距磁场发生器。

优选地，所述微流控通道还包括液滴生成通道，所述液滴生成通道与所述混合通道之间接有油相入口，在所述液滴生成通道中使油相包裹于含有单个标记物微粒、PCR反应液形成的水相混合物表面，形成PCR液滴。

优选地，所述液滴生成通道的末端开口为液滴生成出口，所述液滴生成出口处设有用于在所述微流控通道中产生负压以驱动所述液体/液滴流动的负压驱动装置。

优选地，所述外周旋转磁场发生器通过改变磁场场强来调节所述微型磁力转子的转速。

更优选地，所述外周旋转磁场发生器根据PCR液滴在负压条件下的生成速度调整磁场场强，从而调整微型磁力转子的转速。

优选地，所述腔体上设有用于向腔体中加入所述标记物微粒溶液的开口，所述开口上装有与所述开口相适配的可拆卸盖。

优选地，所述标记物微粒为非磁性微粒时，所述混合通道为S型混合通道。

优选地，所述等间距磁场发生器包括微型铁环外包铜丝线构成的线圈，所述线圈通过接入方波电源使生成的磁场存在有无两种变换状态。

更优选地，所述等间距磁场发生器通过调节方波电源频率、磁环间距以及场强大小以使标记物微粒按照预设的间距经过所述混合通道。

本案发明人经长期研究和大量实践，才得以提出本实用新型的技术方案，与现有产品相比，本实用新型具有的有益效果是：

通过磁场干预，标记物微粒在微流控通道中保持相对恒定的排列距离，大大提高了带有单个标记物微粒PCR液滴成功制备的效率，节约了检材，节省了时间，提高了实验成功率和重复性，具有广泛的实用前景。

附图说明

图1为本实用新型实施例1的基于磁场干预的PCR液滴生成系统的结构示意图，其中：1-1-标记物微粒溶液腔，1-2-微型磁力转子，1-3-外周旋转磁场，1-4-PCR反应液入口，1-5-S型混合通道，1-6、1-7-油相入口，1-8-液滴生成通道，1-9-液滴生成出口，1-10-外周旋转磁场发生器，1-11-负压驱动装置。

图2为本实用新型实施例2的基于磁场干预的PCR液滴生成系统的结构示意图，其中：2-1-磁性标记物微粒溶液入口，2-2-PCR反应液入口，2-3-等间距磁场，2-4、2-5-油相入口，2-6-混合通道，2-7-液滴生成通道，2-8-液滴生成出口，2-9-等间距磁场发生器，2-10-负压驱动装置。

图3为对比例1中未对微流控芯片进行磁场干预制备的非磁性微粒标记物PCR液滴10×显微镜下示意图。

图4为实施例1中对微流控芯片进行磁场干预制备的非磁性标记物微粒PCR液滴的10×显微镜下示意图。

图5为对比例2中未对微流控芯片进行磁场干预制备的磁性微粒标记物PCR液滴10×显微镜下示意图。

图6为实施例2中对微流控芯片进行磁场干预制备的磁性标记物微粒PCR液滴的4×显微镜下示意图。

具体实施方式

为了使公众能充分了解本实用新型的技术实质和有益效果，申请人将在下面结合附图对本实用新型的具体实施方式详细描述，但申请人对实例的描述不是对技术方案的限制，任何依据本实用新型构思作形式而非实质的变化都应当视为本实用新型的保护范围。

实施例1

本实施例适用于非磁性标记物微粒PCR液滴的制备。

结构见图1所示，主要包括：

标记物微粒溶液腔1-1，为便于微粒物溶液的加入，在腔体上设有开口，在开口上装有与所述开口相适配的可拆卸盖；

该标记物微粒溶液腔1-1中置有微型磁力转子1-2，该微型磁力转子为半径范围0.2cm～1cm的磁性转子，可以在磁场的作用下旋转，将标记物微粒拨送入微流控通道；

外周旋转磁场发生器1-10，用于生成外周旋转磁场1-3，该装置可通过改变磁场的场强调节微型磁力转子1-2的转速，根据PCR液滴在负压条件下的生成速度适当调整外周旋转磁场场强1-3，从而调整微型磁力转子1-2运动速度，使得标记物微粒以恒定的速度和相对均一距离进入微流控通道；

PCR反应液入口1-4，PCR反应液可从该开口加入；

S型混合通道1-5，该混合通道与PCR反应液入口1-4、标记物微粒溶液入口(未示出)连通，有助于在最短的微流控通道中，将标记物微粒溶液与PCR反应液进行均匀混合；

油相入口1-6、1-7，油相物质可从该开口加入；

液滴生成通道1-8，该通道与S型混合通道1-5、油相入口1-6、1-7相连通，在该通道中使油相包裹于含有单个标记物微粒、PCR反应液形成的水相混合物表面，形成PCR液滴。

液滴生成出口1-9，是液滴生成通道1-8的末端开口，在该出口处配有负压驱动装置1-11，利用该装置可以在微流控通道中产生负压，以驱动其中的液体/液滴流动。

本实施例选用非磁性标记物微粒为凝胶微粒，半径为5～50μm之间，在标记物微粒上面共价键连接寡核苷酸引物，用以特异性扩增靶DNA片段，与PCR反应液一起被油相包裹。

具体操作步骤：

步骤一：打开标记物微粒溶液腔1-1的封盖，加入标记物微粒的盐酸溶液10ul～25ul，微粒浓度为1.5×10⁴个/ul；

步骤二：在PCR反应液入口1-4处加入PCR反应液25ul～50ul；

步骤三：在油相入口1-6，1-7处加入氟化油80ul～120ul；

步骤四：开启外周磁场发生器1-10，调节外周旋转磁场1-3的场强，使得微型磁力转子1-2的转速在400rpm～800rpm之间，同时，将液滴生成出口1-9处的负压驱动装置1-11产生的负压控制在-0.4kPa～-3.5kPa之间；在该实用新型中，只要是能够在芯片外周产生旋转磁场以达到控制微型磁力转子转速目的的仪器均可作为外周旋转磁场发生器，不受其结构、型号的限制，在此不做要求/限定，同样，对于负压驱动装置的型号与连接亦不做要求/限定，只要能按照常规要求控制微流控通道中液体/液滴的流动即可。

步骤五：根据液滴生成出口1-9处PCR液滴的生成速率适当调整外周旋转磁场1-3，将微型磁力转子1-2的转速调整到一个最佳速率，从而使合格PCR液滴的生成率达到最高点；

步骤六：收集液滴生成出口1-9处生成的PCR液滴。

对比例1

除了在PCR液滴制备过程中未对微流控芯片进行磁场干预之外，其他制备条件与本实施例完全相同。

如图3所示，对比例1中制备得到的合格液滴的比例大致在40％～50％，而本实施例制备的PCR液滴的合格率约为75％～80％，见图4。

实施例2

本实施例适用于磁性标记物微粒PCR液滴的制备。

结构见图2所示，主要包括：

磁性标记物微粒溶液入口2-1，磁性标记物微粒溶液可从该开口加入；

PCR反应液入口2-2，PCR反应液可从该开口加入；

等间距磁场发生器2-9，用于生成等间距磁场2-3，接入方波电流，磁场在有无两种状态的变频在100Hz～1000Hz之间，磁环间距可适当调节，磁场强度可适当调整。通过等距磁场调整混合通道2-6中的磁性标记物微粒，使得标记物微粒在微流控通道中保持均一距离；

油相入口2-4、2-5，油相物质可从该开口加入；

液滴生成通道2-7，该通道与混合通道2-6、油相入口2-4、2-5相连通，在该通道中使油相包裹于含有单个标记物微粒、PCR反应液形成的水相混合物表面，形成PCR液滴。

液滴生成出口2-8，是液滴生成通道2-7的末端开口，在该出口处配有负压驱动装置2-10，利用该装置可以在微流控通道中产生负压，以驱动其中的液体/液滴流动。

该实施例中选用磁性标记物微粒为Fe3O4磁性颗粒，半径为5～50μm之间，磁珠上面通过表面改性后共价连接寡核苷酸引物单链，用以特异性扩增靶DNA片段，与PCR反应液一起被油相包裹。

具体操作步骤：

步骤一：在磁性标记物微粒溶液入口2-1处加入磁性标记物微粒盐酸溶液10ul～25ul，浓度为1.5×10⁴个/ul，在PCR反应液入口2-2处加入PCR反应液25ul～50ul；

步骤二：在油相入口2-4、2-5加入氟化油80ul～120ul；

步骤三：开启液滴生成出口2-8处的负压驱动装置2-10，将产生的负压控制在-0.4kPa～-3.5kPa之间；

步骤四：等间距磁场发生器2-9优选为半径为0.5mm～5mm的微型铁环外包铜丝线(也可采用其他材料、方法制作，只要能产生符合相应要求的等间距磁场即可)，线圈接通方波电源，磁场变频范围在100Hz～1000Hz之间，磁环间距控制在2mm～5mm，磁场强度控制在1000Gs～5500Gs之间，根据液滴生成出口2-8处PCR液滴生成速率将磁场变频、磁环间距和磁场强度大小调整到一个最佳契合点，从而使合格PCR液滴的生成率达到最高点；

步骤五：收集液滴生成出口2-8处生成的PCR液滴。

对比例2

除了在PCR液滴制备过程中未对微流控芯片进行磁场干预之外，其他制备条件与本实施例完全相同。

如图5所示，对比例2中制备得到的合格液滴的比例大致在20％左右，而本实施例制备的PCR液滴的合格率约为80％～85％，见图6。

本实用新型的技术内容及技术特征已揭示如上，然而熟悉本领域的技术人员仍可能基于本实用新型的原理对负压力、磁场强度、磁环间距等参数进行适当的调整改变后应用，因此，本实用新型保护范围应不限于实施例所揭示的内容，而应包括各种不背离本实用新型的替换及改变，并为本专利申请权利要求所涵盖。