色谱介质及其制备方法与流程
发明领域
本发明涉及适于从流动相分离生物分子的官能化色谱介质。
发明背景
生物技术市场是世界医药市场中增长最快的部分，占2012年所有市场销售额的20%(1530亿美元)。市场份额从2002年的10%增长41%，在2012至2018年间，从1530亿美元增至2150亿美元。目前市场上有约200种单克隆抗体(mab)产品，有超过1000种在临床试验中，该领域对技术进步的需求是显而易见的。在过去的几十年里，工业配置中生物分子的典型发酵滴度已从0.5g/l增至~3g/l，基于分子生物学的活化进展，据信在不久的将来可实现高达10g/l的水平。然而，虽然下游纯化工艺也已得到一定的研究和发展，但该领域的改进与上游的改进并不匹配。
治疗性蛋白的制造需要在加工过程中实现高纯度，以使待给药的蛋白基本上不含有害污染物。目前，在工业规模上，色谱法是用来获得高纯度蛋白的主要方法。从经济角度来说，被严重依赖的色谱单元操作是生物分子如mab下游加工进展的关键。色谱法占生物治疗药物加工的高达60%(re-useofproteinaresin:foulingandeconomics,2015年3月1日,biopharminternational,第28卷,第3期,anurags.rathore,milipathak,guijunma,danielg.bracewell)。
当含有目标分子和杂质的液相与固相接触时，这种色谱分离涉及i)目标分子和/或ii)一种或多种杂质与固相的结合。目标分子/杂质与固相之间的相互作用可基于电荷、疏水性、亲和力或其组合。
历史上，使用多孔珠粒的常规填充床色谱法已经是一种非常强大的分离工具。这些珠粒的多孔性产生高表面积以结合目标物或杂质。这导致高容量的材料，意味着可使用较少量的吸附材料。高容量还会增加分离过程中取得的浓度效应，因为与负载悬浮液的相对浓度相比，每单位体积的吸附剂可结合更多的目标物。这些方面对于工业规模处理至关重要，其中每批可能需要从可达20,000l的液体体积纯化几千克材料。多孔珠粒的典型结合容量在35-120mg/ml的范围内，取决于固相的官能性和结合的物质。
在基于多孔珠粒的系统中，目标分子/杂质与固相之间的结合事件取决于向多孔珠粒中的扩散。因此，在基于多孔珠粒的系统中的停留时间与流速之间存在强相关性。因此，结合容量随停留时间的减少而降低。这又伴随着容量的快速降低，其中在基于多孔珠粒的系统中使用少于2分钟的时间。短停留时间所需的高流速也可能与多孔珠粒不相容，特别是在其中许多升珠粒悬浮液被填充到柱中的生产规模下。这里，多孔珠粒的机械不稳定性可能导致压缩或坍塌事件，这又导致不均匀的柱床。
由于流速影响停留时间，故最大化每单位时间可与固相结合的目标物的量是至关重要的。这允许使用较少的吸附剂量和/或在较短的时间内进行分离。该度量可定义为每单位体积每单位时间结合的克数(mg/ml/min)。上面讨论的多孔珠粒的典型结合容量和停留时间导致单柱多孔珠粒系统的总生产率为约10-120mg/ml/min。
作为基于多孔珠粒的系统的替代物，可使用整料或膜。通过此类材料的流动是对流的而不是扩散的，因此它们的结合容量对流动的敏感性远小于基于多孔珠粒的系统。这些材料可以比基于多孔珠粒的材料高得多的流速运行，其中典型的停留时间大约为0.2-0.5分钟。然而，在动态流动下，在目标物10%穿透时整料(10-20mg/ml)和膜(7.5-29mg/ml)的典型结合容量低于多孔珠粒(gottschalk,u.(2008).biotechnolprog,24(3),496-503)。整料和膜材料的较差结合容量(与基于多孔珠粒的材料相比)可通过采用较高的流速在一定程度上补偿。
上面讨论的整料和膜的典型结合容量和停留时间导致整料和膜系统的结合事件的总生产率为约10-145mg/ml/min。
存在对这样的色谱材料的需要，其兼有与基于多孔珠粒的材料相关的高结合容量和可用整料/膜材料实现的较高流速。这样的材料将在高流速下提供高容量以实现最大生产率(mg/ml/min)。
发明概述
本发明人已惊奇地发现，通过两步法产生的纳米纤维材料呈现出这样的有利性质，在两步法中官能化步骤独立于接枝步骤进行。通过该方法产生的材料与非接枝材料相比具有显著增加的结合容量，通常提供对于靶蛋白例如免疫球蛋白为至少30mg/ml或甚至至少100mg/ml的动态结合容量。本发明的产品所显示的容量与通常只能用多孔珠粒实现的容量相当或超过通常只能用多孔珠粒实现的容量，并且是目前商业化的膜和整料技术可实现的容量的数倍。此外，这些容量可在亚秒级停留时间下实现，导致生产率值是常规市售材料的10-100倍或甚至数千倍。
根据本发明产生的材料依赖于若干令人惊奇的创新。首先，本发明人已发现，对于设定密度的配体基团，即与目标生物分子选择性结合的色谱介质结合的基团，增加接枝的量可增加色谱材料的结合容量。先前已在用带电基团官能化色谱介质的情形中了解到，增加那些带电基团的量会增加材料的电荷密度和材料的结合容量。因此，先前的使材料的结合容量最大化的方法集中于最大化电荷密度。然而，本发明人已首次证实，通过增加接枝，可独立于材料的电荷密度增加结合容量。
在其他情况下，已发现改变官能化步骤对电荷密度几乎没有影响，但在与接枝步骤组合时，对于相同程度的官能化，可实现结合容量的显著增加。因此已发现色谱材料的电荷密度和结合容量可通过改变官能化程度和接枝程度来控制，以提供高度优化的材料。本发明人已研究和利用了接枝步骤和随后的官能化步骤之间的这种关系来产生在高流速下具有非常高的结合容量的材料。发现电荷密度与动态结合容量之间的关系远比先前认识的更微妙。因此，对于具有相同电荷密度的材料，已发现可通过控制接枝程度来改变动态结合容量。这是一个出乎意料并高度有利的结果。
这是非常重要的，因为增加色谱材料的容量的先前尝试仅仅集中在增加材料上配体基团的密度上。因此，它们未能解决如何通过独立地改变作为孤立步骤的接枝和官能化的条件来控制和增加材料的容量。在许多已知的改性方法中，这种控制程度根本不可能，因为色谱材料用荷电聚合物改性，即接枝和官能化步骤同时进行。
重要的是，除了增加材料的结合容量外，接枝和官能化还具有调节材料流动阻力的作用，这对色谱材料的生产率具有不利影响。这在menkhaus等人(menkhaus,t.j.,varadaraju,h.,zhang,l.,schneiderman,s.,bjustrom,s.,liu,l.,&fong,h.(2010).chemicalcommunications,46(21),3720-3722)中有讨论，其报道增加的接枝可能与增大的流动阻力和对流介质中增大的传质扩散方面有关。这可能是因为改性色谱材料的已知方法通常是从材料的表面接枝带电聚合物链。因此，增加接枝程度也会增加材料的电荷密度，而无法独立地控制这些来优化材料的结合容量和流动特性。
通过将接枝步骤与使材料官能化的步骤分开，在本发明中克服了这些缺点。还已发现，增加接枝程度本身不会增大流过材料的阻力。只有当接枝材料被官能化时才会开始影响流动阻力。
此外，本发明人已发现，缩水甘油及其衍生物是特别优选的在接枝步骤中使用的单体单元。令人惊奇的是，当接枝步骤采用缩水甘油聚合时，所得色谱介质显示出比由其他接枝方法如原子转移自由基聚合(atrp)产生的色谱介质改善的性质(例如，它们受益于较高的容量和较高的生产率)。
因此，本发明提供了一种制备官能化聚合物色谱介质的方法。所述方法包括：
(i)提供由一个或多个聚合物纳米纤维形成的基材，
(ii)从基材接枝一个或多个中性聚合物链，和
(iii)使接枝产物与试剂接触，所述试剂将步骤(ii)的产物官能化为色谱介质，
其中步骤(ii)包括使多个式
与所述纳米纤维基材上存在的一个或多个官能团反应，其中r1、r2、r3、r4和r5可相同或不同，并选自h、卤素、c1-c4烷基或c1-c4烷氧基，前提条件是r1、r2、r3、r4或r5中的至少一个不为氢。
本发明进一步提供了官能化色谱介质，其包含：
i)聚合物纳米纤维的至少一个非织造层，其包含多个纳米纤维-纳米纤维熔合点；
ii)覆盖聚合物纳米纤维和纳米纤维-纳米纤维熔合点的接枝聚合物涂层，或者表示为共价拴系至聚合物纳米纤维的多个接枝聚合物分子；
iii)共价结合至接枝聚合物涂层或接枝聚合物分子的多个配体基团，其中配体基团能够与靶生物分子相互作用。能够与靶生物分子相互作用的配体基团可举例为离子交换基团、疏水基团、混合模式基团、亲和基团和其组合。
另外，本发明提供了包含如上所述的官能化色谱介质的色谱柱。
此外，本发明提供了分离一种或多种靶生物分子的方法，包括以下步骤：
i)提供如上所述的官能化色谱介质或色谱柱；和
ii)使包含靶生物分子的流动相通过官能化色谱介质或色谱柱。
本发明还提供了：
-可通过本发明的制备方法获得的官能化色谱介质；
-制备色谱柱的方法，所述方法包括进行本发明的制备方法并向柱中引入由此获得的产物；
-色谱柱，其(a)可通过所述方法获得，或(b)其包含一种或多种本发明的官能化色谱介质；
-本发明的官能化色谱介质或本发明的色谱柱在色谱法中的用途；
-从流动相分离一种或多种生物分子的方法，所述方法包括使流动相中的一种或多种生物分子与本发明的官能化色谱介质或本发明的色谱柱接触。
附图简述
图1示出了若干市售的基于多孔珠粒的系统的动态结合容量(dbc)随停留时间的变化。
图2示出了在没有接枝步骤的情况下增加官能化剂的量对三甲基铵官能化材料的电荷密度的影响。
图3示出了在没有接枝步骤的情况下增加电荷密度对三甲基铵官能化材料的动态结合容量(dbc)的影响。
图4示出了增加聚合物接枝程度和三甲基铵官能化剂的量对根据本发明制备的若干材料的电荷密度的影响。
图5示出了图4中显示的值的平均值。
图6示出了在设定的电荷密度下增加聚合物接枝对根据本发明制备的若干三甲基铵官能化材料的动态结合容量(dbc)的影响。
图7示出了与未接枝的材料相比，在设定的聚合物接枝下增加电荷密度对根据本发明制备的若干材料的动态结合容量(dbc)的影响。
图8示出了增加聚合物接枝程度和官能化反应时间对缩水甘油/磺酸官能化材料的电荷密度的影响。
图9示出了独立接枝步骤对根据本发明的缩水甘油/磺酸官能化材料的动态结合容量的影响。
图10示出了接枝对根据本发明的缩水甘油/羧甲基官能化材料的动态结合容量(dbc)的影响。
图11示出了增加电荷密度和聚合物接枝程度对根据本发明制备的若干材料的流动阻力的影响。
图12示出了增加聚合物接枝程度对若干不带电材料的流动阻力的影响。
图13示出了增加缩水甘油试剂的量对接枝产物中-oh基团的密度的影响。
图14示出了本发明的色谱介质的示意图。
图15示出了本发明的色谱柱的示意图。
图16示出了基于0.2ml的膜以固定的0.4s停留时间或30ml/min的流速，缓冲液ph和电导率对dvs-蛋白a官能化纳米纤维材料的跨膜压力的影响。结果为一式三份来自在peek外壳中的3个不同的0.2ml膜床，并绘出误差棒。在不同的工作日测试20mmtris,ph8.0,15.5ms/cm缓冲液系统，这可解释略微升高的跨膜压力。
图17示出了a)用季铵基团(q)官能化的未接枝再生纤维素(rc)纳米纤维介质的sem图像和b)从该图像测量的纤维直径的直方图。
图18示出了a)用季铵基团(q)官能化的缩水甘油接枝再生纤维素(rc)纳米纤维介质的sem图像和b)从该图像测量的纤维直径的直方图。
图19示出了a)用蛋白a通过二乙烯基砜(dvs)活化而官能化的缩水甘油接枝再生纤维素(rc)纳米纤维介质的sem图像和b)从该图像测量的纤维直径的直方图。
发明详述
本发明典型地涉及由聚合物纳米纤维基材制备官能化聚合物色谱介质的两步法。这两个步骤为聚合物接枝步骤和官能化步骤。
聚合物纳米纤维
本发明的官能化聚合物色谱介质由聚合物纳米纤维基材形成。每一基材由一个或多个聚合物纳米纤维形成。
聚合物纳米纤维通常为电纺聚合物纳米纤维。这样的电纺聚合物纳米纤维是本领域技术人员熟知的，并且其制备的优化条件可见于例如o.hardick,等人,j.mater.sci.46(2011)3890中，其全部内容通过引用并入本文。本发明的方法通常包括电纺聚合物以产生一个或多个聚合物纳米纤维的初始步骤。这可包括电纺聚合物以产生一个或多个非织造片材或层，每个非织造片材或层包含一个或多个聚合物纳米纤维。合适地，片材或层(10)各自包含多个纳米纤维-纳米纤维熔合点(20)，如图14所示。在各个纳米纤维(30)之间在其接合处的层内熔合点向片材/层提供了机械稳定性，并降低了在使用期间纳米纤维脱落到液体中的风险。熔合点可合适地通过在电纺工艺期间控制温度使得沉积的纳米纤维在固化之前彼此接触来实现。可能特别有利的是电纺聚合物溶液，在该情况下形成的纤维通过溶剂的蒸发固化，在固化之前提供足够的时间来形成层内熔合点。
用于本发明的聚合物纳米纤维通常具有10nm至1000nm的平均直径。对于一些应用，平均直径为200nm至800nm的聚合物纳米纤维是合适的。对于某些应用，平均直径为200nm至400nm的聚合物纳米纤维可能是合适的。用于本发明的聚合物纳米纤维的长度不受特别限制。因此，常规的电纺工艺可产生数百米或甚至数千米长的聚合物纳米纤维。但通常所述一个或多个聚合物纳米纤维的长度至多10km，优选10m至10km。聚合物纳米纤维可合适地是单丝纳米纤维，和可例如具有圆形、椭圆形或基本上圆形/椭圆形的横截面。
通常，所述一个或多个聚合物纳米纤维以一个或多个非织造片材的形式提供，每个非织造片材包含一个或多个聚合物纳米纤维。因此，基材通常由一个或多个非织造片材形成，每个非织造片材包含一个或多个聚合物纳米纤维。包含一个或多个聚合物纳米纤维的非织造片材为所述一个或多个聚合物纳米纤维的垫，其中每个纳米纤维基本上无规取向，即它尚未制造成使得所述一个或多个纳米纤维呈现特定的图案。包含聚合物纳米纤维的非织造片材通常通过已知的方法提供，如o.hardick,等人,j.mater.sci.46(2011)3890中公开的那些。在某些情况下，非织造片材可由单一聚合物纳米纤维组成。或者，非织造片材可包含两根或更多根聚合物纳米纤维，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10根聚合物纳米纤维。
非织造片材通常具有1至40g/m2、优选5至25g/m2、在一些情况下1至20或5至15g/m2的面密度。
非织造片材通常具有5至120μm、优选10至100μm、在一些情况下50至90μm、在其他情况下5至40、10至30或15至25μm的厚度。
用来制备本发明的方法中使用的纳米纤维的聚合物不受特别限制，前提条件是该聚合物适于用在色谱应用中。因此，通常，该聚合物为适于在色谱法中用作色谱介质即吸附剂的聚合物。合适的聚合物包括聚酰胺如尼龙、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯腈、聚苯乙烯、聚砜例如聚醚砜(pes)、聚己内酯、胶原、壳聚糖、聚环氧乙烷、琼脂糖、乙酸琼脂糖、纤维素、乙酸纤维素及其组合。优选聚醚砜(pes)、纤维素、乙酸纤维素及其组合。在一些情况下，优选纤维素、乙酸纤维素及其组合。
在一些实施方案中，基材包含一个或多个纳米纤维，其由一个或多个聚合物纳米纤维形成，所述一个或多个聚合物纳米纤维由不同的聚合物形成。因此，在该实施方案中，基材包含一种或多种不同的聚合物。典型的聚合物如上所限定。
通常，本发明的方法用于制备官能化纤维素色谱介质，并且该方法包括提供由一个或多个乙酸纤维素纳米纤维形成的基材。优选地，该方法包括提供由一个或多个非织造片材或层形成的基材，每个非织造片材或层包含一个或多个乙酸纤维素纳米纤维。乙酸纤维素易于通常从乙酸纤维素在一种或多种有机溶剂中的溶液电纺，并且在电纺后可易于转化为纤维素。因此，优选该方法包括提供由一个或多个非织造片材/层形成的基材，每个非织造片材/层包含一个或多个电纺乙酸纤维素纳米纤维。
由一个或多个聚合物纳米纤维形成的基材包含所述一个或多个聚合物纳米纤维，通常以如上所讨论的一个或多个非织造片材/层的形式。在某些实施方案中，所述一个或多个聚合物纳米纤维或一个或多个非织造片材在接枝步骤之前不经历任何物理加工步骤。
纳米纤维的物理改性
然而，在本发明的某些优选实施方案中，基材的提供包括在接枝步骤之前任选地在非织造片材/层中对聚合物纳米纤维进行物理改性。具体而言，物理改性可包括加热和/或压制聚合物纳米纤维/非织造片材/层，优选地加热和压制聚合物纳米纤维/非织造片材/层。这些步骤将改善材料的结构稳定性。还可改变压制和加热条件以改变所得材料的厚度和/或孔隙率。
使用多个聚合物纳米纤维的非织造片材能够制备更厚的材料，其具有更大的吸附容量(一旦接枝和官能化)。因此，基材的提供通常包括提供一个堆叠在另一个之上的两个或更多个非织造片材/层，每个所述片材/层包含一个或多个聚合物纳米纤维，并同时加热和压制该片材/层的叠层以熔合相邻片材/层的纳米纤维之间的接触点，产生层间熔合点。在纤维素色谱介质的情况下，基材的提供通常包括提供一个堆叠或折叠在另一个之上的两个或更多个非织造片材/层，每个所述片材/层包含一个或多个乙酸纤维素纳米纤维，并同时加热和压制该片材/层的叠层以熔合相邻片材的纳米纤维之间的接触点。官能化色谱介质因此可以是多个非织造聚合物纳米纤维层的叠层，具有多个层间纳米纤维-纳米纤维熔合点，其将至少两个层彼此结合。
用于压制和加热聚合物纳米纤维/非织造片材的优选加工条件可见于us20160288089和wo-a-2015/052465中，其全部内容通过引用并入本文。
接枝纳米纤维基材
本发明的方法包括接枝步骤(步骤(ii))，其通常包括从步骤(i)中提供的基材接枝一个或多个中性聚合物链。
从基材接枝一个或多个中性聚合物链通常包括从基材上存在的一个或多个官能团生长一个或多个聚合物链，任选地在一种或多种催化剂的存在下。因此，通常，基材包含一个或多个官能团，优选地一个或多个可自其生长聚合物链的官能团。从所述一个或多个官能团生长聚合物链意味着在所述一个或多个官能团处由相应单体结构单元构建聚合物。因此，接枝步骤通常包括直接从基材生长聚合物链，而不是向基材粘结预先形成的聚合物链。因此，随着聚合的进行，各个单体被加到生长中的聚合物链的末端，所述聚合物链在远端锚定于基材。聚合物涂层然后将包含单点共价拴系于基材的聚合物分子。聚合物分子可以是直线或支化的，并且甚至是超支化的，在该情况下>50%的单体残基是支化点或末端单体。直接从基材生长聚合物链能够控制聚合物涂层的结构，特别是使用使聚合物全部以均匀的速率同时生长的聚合策略。这使得能够形成致密且界限清楚的聚合物涂层。因此，当基材是一个或多个在其接合处熔合在一起的聚合物纳米纤维层时，将形成界限清楚的薄涂层–覆盖核心纳米纤维和各个纳米纤维之间的熔合点。涂层可以是保形涂层，即遵循纳米纤维和熔合点的轮廓。涂层的厚度可例如使得涂覆的纳米纤维具有100-1000nm，例如100-700nm或200-700nm的平均直径。然后，未涂覆的纳米纤维的平均直径可以是例如100-800nm，例如100-600nm。层的平均孔隙大小可以是例如200-800nm和孔隙体积分数可以是例如50-90%，例如60-80%。平均孔隙大小和平均纤维直径可从层的sem图像计算，和孔隙体积分数可从层或基材的总体积(厚度乘以截面面积)和纳米纤维的比重计算。代表性的多层乙酸纤维素纳米纤维盘的孔隙体积计算的具体实例是：盘直径32mm和盘厚度0.44mm提供0.354cm3的总体积。盘的干重为0.165g，根据乙酸纤维素比重1.31g/cm3，提供0.126cm3的乙酸纤维素体积。因此，孔隙体积分数是(0.354–0.126)/0.354=64%。
层的孔结构对于性能是重要的，因为在高动态结合容量(大的可接近表面和短的扩散路径)和低背压(大的孔隙和高的孔隙体积分数)之间需要满足精密的平衡。接枝纳米纤维层因为其小的纤维直径和高的孔隙体积分数独特地适合满足该平衡。当层具有以下孔隙大小(如从毛细流动测孔术和全氟聚醚润湿液体获得的)时，实现特别良好的组合：泡点孔隙大小–0.9-1.2µm，例如1.0-1.2µm；最小孔隙大小–0.2-0.4µm和/或平均流动孔隙(mfp)孔隙大小0.3-0.5µm。测量应该如下文实施例17所述进行。
对于良好的流动性质，如果基材的开孔结构在接枝过程后得到保持，则是有利的。以此方式，色谱介质具有如图16所示通过开口彼此流体连接的第一侧(130)和第二侧(160)，和通过在接枝的聚合物纳米纤维之间的间隙(间隙体积)形成三维连接的孔结构。这种孔结构优选不含或基本上不含接枝聚合物或在接枝过程中偶然形成的任何均聚物。这可通过限制在接枝过程中加入的单体量实现，并且阻塞孔结构的任何聚合物的缺乏可通过测量流速和/或通过电子显微术来观察孔结构而容易地检查。接枝聚合过程提供了引入官能化聚合物的独特可能性，增加了结合容量而不阻塞孔结构。
本发明的接枝层的优点，特别是与水凝胶涂覆的膜相比，在于背压基本上不依赖于缓冲液电导率和ph。这是由于缺乏明显的溶胀/收缩现象，并且可表现为使得当ph5-8的水性缓冲液以0.4s停留时间通过官能化色谱介质时，当缓冲液的电导率在3-90ms/cm(在22°c下测量)的区间内变化时经过官能化介质的压降变化少于0.07mpa/mm床高(介质厚度)。3ms/cm对应于20mm乙酸盐或tris缓冲液，而90ms/cm对应于加入了大约1mnacl的相同缓冲液。
在本发明中，接枝步骤可包括使多个式
与纳米纤维基材上存在的一个或多个官能团反应，
其中r1、r2、r3、r4和r5可相同或不同，并选自h、卤素、c1-c4烷基或c1-c4烷氧基，前提条件是r1、r2、r3、r4或r5中的至少一个不为氢。因此，通常仅一种类型的聚合物接枝于基材。然而，在其他实施方案中，不止一种类型的聚合物可接枝于基材。
通常，r1、r2、r3、r4和r5可相同或不同，并选自氟、氯、溴、甲基或乙基。因此，在式(i)的化合物中：
r1为h、卤素、c1-c4烷基或c1-c4烷氧基，优选地h、氟、氯、溴、甲基或乙基；
r2为h、卤素、c1-c4烷基或c1-c4烷氧基，优选地h、氟、氯、溴、甲基或乙基；
r3为h、卤素、c1-c4烷基或c1-c4烷氧基，优选地h、氟、氯、溴、甲基或乙基；
r4为h、卤素、c1-c4烷基或c1-c4烷氧基，优选地h、氟、氯、溴、甲基或乙基；和
r5为h、卤素、c1-c4烷基或c1-c4烷氧基，优选地h、氟、氯、溴、甲基或乙基。
通常，当接枝步骤(ii)包括使具有一个或多个可自其生长聚合物的官能团的基材与多个式(i)的化合物和/或其对映体反应时，r1、r2、r3、r4和r5中的至少一个为氢。在此情况下，优选地，r1、r2、r3、r4和r5中的至少两个为氢。更优选地，r1、r2、r3、r4和r5中的至少三个为氢。甚至更优选地，r1、r2、r3、r4和r5中的四个为氢。优选地，r1为氢，r2和r3中的至少一个为氢。或者，r2和r3为氢。然而更优选地，r1、r2和r3为氢。
更优选地，接枝步骤(ii)包括使具有一个或多个可自其生长聚合物的官能团的基材与多个式
在其中基材由自不同聚合物形成的纳米纤维形成的实施方案中，在接枝步骤中每一不同种类的聚合物纳米纤维可接枝有不同的聚合物。这可能，例如，是由于不同的聚合物纳米纤维上存在不同的官能团。或者，相同的聚合物可接枝于基材中每种不同种类的聚合物纳米纤维。
典型的官能团包括羟基、氨基和羧基。在其中基材由一个或多个纤维素或乙酸纤维素纳米纤维形成的情况下，官能团通常为羟基。
通常，在步骤(i)和(ii)之间处理基材以引入所述一个或多个官能团，或者在步骤(i)和(ii)之间处理基材以使基材上的任何官能团脱保护或活化，或者在步骤(i)和(ii)之间处理基材以增加基材上官能团的数量/密度。优选地，在步骤(i)和(ii)之间处理基材以引入所述一个或多个官能团，或者使基材上的任何官能团脱保护或活化。更优选地，在步骤(i)和(ii)之间处理基材以使基材上的任何官能团脱保护或活化。甚至更优选地，在步骤(i)和(ii)之间处理基材以使基材上的任何官能团脱保护。
然而，在替代的实施方案中，在步骤(i)和(ii)之间没有另外的处理步骤。在这些实施方案中，通常，接枝步骤(ii)在这样的条件下进行：在同一步骤中还引入所述一个或多个官能团，或使基材上的任何官能团脱保护或活化，或增加基材上官能团的数量/密度。优选地，接枝步骤(ii)在这样的条件下进行：在同一步骤中还引入所述一个或多个官能团，或使基材上的任何官能团脱保护或活化。更优选地，接枝步骤(ii)在这样的条件下进行：在同一步骤中还使基材上的任何官能团脱保护或活化。甚至更优选地，接枝步骤(ii)在这样的条件下进行：在同一步骤中还使基材上的任何官能团脱保护。
在一个特别优选的实施方案中，官能团为羟基。在此特别优选的实施方案中，接枝步骤(ii)通常在这样的条件下进行：在同一步骤中还使基材上的羟基脱保护。
通常进行官能团的脱保护使得官能团可具有一个或多个自其生长的聚合物链。例如，当色谱介质为纤维素色谱介质时，通常提供乙酸纤维素基材，并且在接枝步骤之前，处理乙酸纤维素以将其转化为纤维素。这涉及乙酰化羟基的脱保护以产生羟基。乙酸纤维素向纤维素的转化通常使用碱性水溶液进行大于12小时、例如12至36小时来实现，优选地所述碱性水溶液为naoh在水:乙醇、更优选地2:1的水:乙醇中的溶液。
或者，当色谱介质为纤维素色谱介质时，提供乙酸纤维素基材并在接枝步骤(ii)中在这样的条件下进行处理：其中乙酸纤维素转化为纤维素，并且纤维素随后与多个式
当色谱介质为纤维素色谱介质时，本发明通常提供一种制备官能化纤维素色谱介质的方法，该方法包括
(i)提供由一个或多个乙酸纤维素纳米纤维形成的基材，处理乙酸纤维素以将其转化为纤维素，
(ii)从所得纤维素基材接枝一个或多个中性聚合物链，和
(iii)使接枝产物与试剂接触，所述试剂将步骤(ii)的产物官能化为色谱介质。
当色谱介质为纤维素色谱介质时，作为替代方案，本发明提供一种制备官能化纤维素色谱介质的方法，该方法包括
(i)提供由一个或多个乙酸纤维素纳米纤维形成的基材，
(ii)使基材经受这样的条件：乙酸纤维素转化为纤维素，并且随后一个或多个中性聚合物链接枝到所得纤维素基材上，和
(iii)使接枝产物与试剂接触，所述试剂将步骤(ii)的产物官能化为色谱介质。
以下在所要求保护的方法的步骤(iii)的情形中讨论官能团的活化。该讨论同样适用于所要求保护的方法的步骤(ii)的官能团的活化。
增加基材上官能团的数量和/或密度的方法是技术人员已知的。
当向基材引入所述一个或多个官能团时，在步骤(i)和(ii)之间于改性基材上存在的官能团的进一步步骤(i-a)中处理基材以引入可自其生长一个或多个聚合物链的官能团，然后是从如此改性的基材生长聚合物链的步骤(ii)。步骤(i-a)可包括单个步骤或多个步骤，其一起将基材上存在的官能团改性为可自其生长一个或多个聚合物链的官能团。
在涉及缩水甘油聚合的实施方案中，通常在步骤(i)和(ii)之间处理基材以使基材上的任何官能团脱保护。本文还描述了在接枝步骤中涉及atrp和raft聚合的对比方法。在这些方法中，通常在步骤(i)和(ii)之间处理基材以将基材上存在的官能团改性为可自其生长一个或多个聚合物链的官能团。在此步骤之前，还可处理基材以使基材上的任何官能团脱保护。
在涉及atrp聚合的方法中，通常将基材上的羟基改性以引入烷基卤或芳基卤基团。通常，烷基卤为烷基氟、烷基氯、烷基溴或烷基碘。优选烷基溴。更优选叔烷基卤。甚至更优选叔烷基溴。
接枝到基材的所述一个或多个聚合物链适合是中性的。聚合物链不含本领域技术人员认为是带电基团的任何基团，例如，下文讨论的那种带电基团。通常，在步骤(ii)中接枝到基材的聚合物链不含如本文所限定的任何带电基团。
聚合物的中性可通过聚合物是否含有任何可电离即在基本上中性的ph、例如ph6-8、通常ph6.5-7.5、常常ph6.75-7.25、或约ph7下质子化或去质子化的基团来评估。通常，中性聚合物基本上不含酸性或碱性中心，即基本上没有在ph6-8、通常ph6.5-7.5、常常ph6.75-7.25、或约ph7下质子化或去质子化的官能团。这可由技术人员通过本领域典型的测定方法来确定。评估酸度和碱度的典型程序及其理论方面在“acidityandbasicityofsolids:theory,assessmentandutility”j.fraisard和l.petrakis编辑,natoasiseriesc,第444卷,kluweracademicpublishers,dordrecht,bostonandlondon,1994中有讨论，尤其是在第513页中，其全部内容通过引用并入本文。如本文所用，基本上是指小于1摩尔%、优选小于0.1摩尔%、甚至更优选小于0.01摩尔%、或甚至小于0.001摩尔%。
如上文所提到，接枝步骤(ii)可包括使具有一个或多个可自其生长聚合物的官能团的基材与多个式
其中r1、r2、r3、r4和r5可相同或不同，并选自h、卤素、c1-c4烷基或c1-c4烷氧基，前提条件是r1、r2、r3、r4或r5中的至少一个不为氢；使用称为缩水甘油聚合的聚合方法。因此，使用缩水甘油聚合实现聚合物链的生长。通常，r1、r2、r3、r4和r5可相同或不同，并选自氟、氯、溴、甲基或乙基。因此，在式(i)的化合物中：
r1为h、卤素、c1-c4烷基或c1-c4烷氧基，优选地h、氟、氯、溴、甲基或乙基；
r2为h、卤素、c1-c4烷基或c1-c4烷氧基，优选地h、氟、氯、溴、甲基或乙基；
r3为h、卤素、c1-c4烷基或c1-c4烷氧基，优选地h、氟、氯、溴、甲基或乙基；
r4为h、卤素、c1-c4烷基或c1-c4烷氧基，优选地h、氟、氯、溴、甲基或乙基；和
r5为h、卤素、c1-c4烷基或c1-c4烷氧基，优选地h、氟、氯、溴、甲基或乙基。
通常，当接枝步骤(ii)包括使具有一个或多个可自其生长聚合物的官能团的基材与多个式(i)的化合物和/或其对映体反应时，r1、r2、r3、r4和r5中的至少一个为氢。在此情况下，r1、r2、r3、r4和r5中的至少二个为氢。更优选地，r1、r2、r3、r4和r5中的至少三个为氢。甚至更优选地，r1、r2、r3、r4和r5中的四个为氢。优选地，r1为氢，r2和r3中的至少一个为氢。或者，r2和r3为氢。然而更优选地，r1、r2和r3为氢。
更优选地，接枝步骤(ii)包括使具有一个或多个可自其生长聚合物的官能团的基材与多个式
缩水甘油聚合是本领域技术人员已知的技术。缩水甘油聚合通常不需要催化剂的存在。然而，聚合可任选地在一种或多种适当的催化剂的存在下进行。在这样的实施方案中，通常使用化学或生物催化剂。缩水甘油聚合通常在水性环境中进行。通常，缩水甘油聚合在室温下进行。通常，缩水甘油聚合在温和的碱性条件下进行。通常，缩水甘油聚合进行大于约5小时，优选大于约10小时，更优选大于约15小时，例如约16小时。在缩水甘油聚合之后，通常将接枝产物在水中洗涤，然后用弱酸洗涤。
缩水甘油聚合包括使缩水甘油和/或式(i)的缩水甘油衍生物从基材上存在的一个或多个如本文所限定的官能团聚合。通常，这些官能团为羟基。因此，通常，所要求保护的方法的步骤(ii)包括使多个式
缩水甘油聚合通常产生一个或多个聚甘油链。因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种制备官能化聚合物色谱介质的方法，所述方法包括：
(i)提供由一个或多个聚合物纳米纤维形成的基材，
(ii)从基材接枝一种或多种中性聚合物链，和
(iii)使接枝产物与试剂接触，所述试剂将步骤(ii)的产物官能化为色谱介质，
其中生长的聚合物链包括从基材上存在的一个或多个官能团聚合缩水甘油和/或式(i)的缩水甘油衍生物，优选缩水甘油。
因此，在一个实施方案中，本发明还提供了一种制备官能化聚合物色谱介质的方法，所述方法包括：
(i)提供由一个或多个聚合物纳米纤维形成的基材，
(ii)从基材接枝一个或多个中性聚合物链，和
(iii)使接枝产物与试剂接触，所述试剂将步骤(ii)的产物官能化为色谱介质，
其中所述一个或多个聚合物链为一个或多个聚甘油链。
缩水甘油聚合不可避免地导致聚合物链的支化，产生“丛生”结构。因此，通常，一个或多个聚合物链是支化的，并且可以是充分超支化的，如上所述。在缩水甘油聚合物中不同类型的单体残基是：甘油三醚(支化点)、1,2-甘油二醚(直线)和1-或2-甘油单醚(末端)。在许多情况下，三醚和单醚残基占优势，产生超支化聚合物。
本领域技术人员熟知的另一种聚合方法是受控自由基聚合(crp)。受控自由基聚合是本领域技术人员熟知的术语，并且通常是指单体的自由基加成聚合，其中可在一定程度上相对于时间控制生长的聚合物的分子量。crp的实例包括原子转移自由基聚合(atrp)、通过aget(电子转移生成原子)-atrp和可逆加成-断裂链转移(raft)。聚合方法不完全限定为crp，而是可包括自由基聚合(frp)和开环易位聚合(romp)。
atrp可在水性环境中或任选地在水与另一溶剂的混合物中进行，所述溶剂可以是例如甲醇、dmso、thf、dmf或nmp。atrp聚合优选在基本上无氧的条件下进行。通常，atrp在室温下进行。通常，在进行atrp之后，用水洗涤所得材料。
用于atrp聚合的催化剂通常是与一种或多种配体络合的过渡金属或过渡金属盐。如本文所用，配体为与金属离子(通常为过渡金属离子)配位的化合物。合适的过渡金属包括铜、钴、钼、铑、锇、钌、钯、镍和铼。优选铜。用于铜配位催化剂的合适配体的实例包括2,2'-联吡啶(bpy)、4,4'-二(5-壬基)-2,2-联吡啶(dnbpy)、n,n,n',n'-四甲基亚乙基二胺(tmeda)、n-丙基(2-吡啶基)甲亚胺(nprpmi)、2,2':6',2''-三联吡啶(tpy)、4,4',4''-三(5-壬基)-2,2':6',2''-三联吡啶(tntpy)、n,n,n',n'',n''-五甲基二亚乙基三胺(pmdeta)、n,n-双(2-吡啶基甲基)辛胺(bpmoa)、1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺(hmteta)、三[2-(二甲基氨基)乙基]胺(me6tren)、三[(2-吡啶基)甲基]胺(tpma)和1,4,8,11-四氮杂-1,4,8,11-四甲基环十四烷(me4cyclam)。
使用适当的单体并且视情况使用链转移剂可使在crp方法中在聚合物链的生长端处诱导聚合物的支化，从而提供丛生型结构的可能性。在其他情况下，不太优选支化并可形成基本上无支链的“刷状”聚合物结构。
可控制atrp聚合以产生基本上线形的聚合链或产生一定程度的支化。基本上无支链的聚合物将产生聚合物“刷状”结构。atrp聚合可采用一种或多种不同类型的单体，其中单体为用于形成聚合物的任何单独的单元。单体各自包括一个或多个可聚合基团并且通常选自单官能单体和双官能单体。可聚合基团通常包含c=c双键。
合适的单官能单体的实例有甲基丙烯酸酯和甲基丙烯酰胺，例如n-[3-(二甲基氨基)丙基]甲基丙烯酰胺。其他典型的甲基丙烯酸酯和甲基丙烯酰胺包括2-羟丙基甲基丙烯酰胺(hpma)和甲基丙烯酸羟乙酯(hema)。
可使用双官能单体，例如二甲基丙烯酸酯或二乙烯基砜，来在atrp聚合中引入支化和/或交联。二乙烯基砜也可用于产生反应性接枝聚合物，其中在二乙烯基砜单体残基中残余的乙烯基砜基团可用于偶联配体，例如蛋白，例如蛋白a。
接枝产物的官能化
本发明的方法包括接枝产物的官能化步骤(步骤(iii))，其使该产物官能化为色谱介质，例如通过向接枝产物上引入一个或多个配体基团。该步骤通常包括使接枝产物与试剂接触，所述试剂通过向接枝产物上引入一个或多个配体基团而使接枝产物官能化为色谱介质。为避免疑义，步骤(iii)可包括单个步骤或多个步骤，该多个步骤一起将步骤(ii)的产物官能化为色谱介质。
该试剂通常通过引入一个或多个配体基团来官能化色谱介质，这使得包含所述一个或多个配体基团的官能化产物适于用作色谱介质。引入的所述一个或多个配体基团将取决于使用该介质的特定色谱技术。配体基团为引入到接枝产物上的基团，其使得接枝产物适于用作色谱介质。合适的配体基团和试剂将在下文进一步讨论。在一些实施方案中，接枝产物仅用一种类型的配体基团官能化。在其他实施方案中，接枝产物用两种或更多种类型的配体基团官能化。因此，该方法的步骤(iii)通常涉及使接枝产物与试剂接触，所述试剂通过向接枝产物上引入一个或多个可相同或不同的配体基团而使步骤(ii)的产物官能化为色谱介质。
在其中基材包含一个或多个由不同聚合物形成的聚合物纳米纤维的实施方案中，每一不同种类的聚合物纳米纤维可用一个或多个配体基团官能化(接枝后)，所述配体基团可相同或不同。
在其中可向基材接枝不止一种类型的聚合物的实施方案中，每个聚合物接枝可用一个或多个配体基团官能化，所述配体基团可相同或不同。
虽然本发明设想了仅包括用试剂进行单次处理的方法，但也可使用包括多个官能化步骤的方法。这样的实施方案包括通过以分批方式使接枝产物与试剂接触两次或更多次来进行官能化。分批官能化是指使接枝产物与试剂反应以使其官能化，然后停止反应并使所得(部分)官能化的物质与单独的一批试剂反应。以分批方式反应不仅仅是指例如向反应容器中加入更多份试剂。分批官能化通常进行两至十次，即2、3、4、5、6、7、8、9或10次。用于分批官能化的优选加工条件可见于wo-a-2015/052460和wo-a-2015/052465中，其全部内容通过引用并入本文。
在某些情况下，与试剂接触可包括将接枝产物放置在贮器中，并使试剂流过贮器以便试剂在流动时与接枝产物接触，这使得接枝产物官能化为色谱介质。在某些情况下，以这种方式官能化材料可比在例如烧瓶或烧杯中简单地使接枝产物与试剂接触更有效。
用于流动官能化的优选加工条件可见于wo-a-2015/052460和wo-a-2015/052465中，其全部内容通过引用并入本文。
该试剂使接枝产物官能化以产生色谱介质，特别是官能化色谱介质。通常，该试剂使接枝产物官能化，使得其适于用在离子交换、亲和捕获或疏水色谱方法中。因此，与试剂接触将产生色谱介质，该色谱介质由一个或多个配体基团(即一个或多个带负电荷的部分、一个或多个带正电荷的部分、一种或多种蛋白、模拟蛋白配体的作用的模拟或合成配体、肽、抗体或其片段、染料、组氨酸、含有金属阳离子的基团或疏水基团)官能化。特别是当官能化色谱介质用于阴离子交换色谱方法中时，优选使用2-氯-n,n-二乙胺盐酸盐(deach)和缩水甘油基三甲基氯化铵作为试剂。特别是当官能化色谱介质用于阳离子交换色谱方法中时，其他优选的试剂有1,4-丁磺酸内酯；氯乙酸钠；tempo，然后是高氯酸钠；或烯丙基缩水甘油基醚，然后是亚硫酸氢钠。特别是当官能化色谱介质用于亲和色谱方法中时，另一优选的试剂为naio4；二乙烯基砜，然后是蛋白a；烯丙基缩水甘油基醚，然后首先是卤代醇形成试剂(例如，n-溴代琥珀酰亚胺)，随后是蛋白a；或烯丙基缩水甘油基醚，然后首先是环氧化物形成试剂，随后是蛋白a。特别是当官能化色谱介质用于疏水色谱方法中时，另一优选的试剂为氧化苯乙烯。
通常，所述试剂为缩水甘油基三甲基氯化铵；1,4-丁磺酸内酯；氯乙酸钠；naio4，然后是蛋白a；二乙烯基砜，然后是蛋白a；烯丙基缩水甘油基醚，然后首先是卤代醇形成试剂(例如，n-溴代琥珀酰亚胺)，随后是蛋白a；或者烯丙基缩水甘油基醚，然后首先是环氧化物形成试剂，随后是蛋白a。优选地，所述试剂为二乙烯基砜，然后是蛋白a；或烯丙基缩水甘油基醚，然后首先是卤代醇形成试剂(例如，n-溴代琥珀酰亚胺)，随后是蛋白a。
因此，在优选的实施方案中，本发明提供了一种制备官能化聚合物色谱介质的方法，其中官能化步骤(iii)包括一起将步骤(ii)的产物官能化为色谱介质的多个步骤。在一个特别优选的实施方案中，本发明提供了一种制备官能化聚合物色谱介质的方法，其中在官能化步骤(iii)中：
(a)首先使接枝产物与选自二乙烯基砜、烯丙基缩水甘油基醚及其组合的试剂接触；
(b)任选地用卤代醇形成试剂或环氧化物形成试剂、优选地卤代醇形成试剂处理步骤(a)的产物；和
(c)使步骤(b)的产物与蛋白a接触。
在此特别优选的实施方案中，如果接枝产物首先在步骤(a)中与二乙烯基砜接触，则步骤(a)的产物通常不用卤代醇形成试剂或环氧化物形成试剂处理。因此，在一些实施方案中，在官能化步骤(iii)中，首先使接枝产物与二乙烯基砜接触，然后使该步骤的产物与蛋白a接触。在此特别优选的实施方案中，如果接枝产物首先在步骤(a)中与烯丙基缩水甘油基醚接触，则随后在步骤(b)中用卤代醇形成试剂或环氧化物形成试剂、优选卤代醇形成试剂处理步骤(a)的产物。因此，在一些实施方案中，在官能化步骤(iii)中，首先使接枝产物与烯丙基缩水甘油基醚接触，并用卤代醇形成试剂处理该步骤的产物，然后使该步骤的产物随后与蛋白a接触。
在另一个特别优选的实施方案中，本发明提供了一种制备官能化聚合物色谱介质的方法，其中在官能化步骤(iii)中：
(a)使接枝产物与选自二乙烯基砜、烯丙基缩水甘油基醚及其组合的试剂接触；
(b)任选地用卤代醇形成试剂或环氧化物形成试剂、优选卤代醇形成试剂处理步骤(a)的产物；和
(c)使步骤(b)的产物与蛋白a接触。
在此特别优选的实施方案中，如果接枝产物首先在步骤(a)中与二乙烯基砜接触，则步骤(a)的产物通常不用卤代醇形成试剂或环氧化物形成试剂处理。因此，在一些实施方案中，在官能化步骤(iii)中，首先使接枝产物与二乙烯基砜接触，然后使该步骤的产物与蛋白a接触。在此特别优选的实施方案中，如果接枝产物首先在步骤(a)中与烯丙基缩水甘油基醚接触，则随后在步骤(b)中用卤代醇形成试剂或环氧化物形成试剂、优选卤代醇形成试剂处理步骤(a)的产物。因此，在一些实施方案中，在官能化步骤(iii)中，使接枝产物与烯丙基缩水甘油基醚接触，并用卤代醇形成试剂处理该步骤的产物，然后使该步骤的产物随后与蛋白a接触。
色谱介质和方法
本发明的方法的产物是官能化色谱介质，即已自其接枝聚合物并且已然后通过向接枝产物上引入一个或多个配体基团来官能化使得它们适于用在一种或多种色谱方法中的色谱介质。
下面更详细地讨论具体的化学官能化。一般而言，这样的化学官能化通过引入一个或多个带电基团来改变官能化色谱介质的化学和/或物理性质。这又会影响当用在色谱方法中时官能化色谱介质的行为表现。例如，与其未官能化形式相比，所述改性可改变官能化色谱介质的极性、疏水性或生物结合性质。在某些情况下，与其未官能化形式相比，所述改性可改变官能化色谱介质的极性、疏水性或生物结合性质中的不止一者。在一个实施方案中，与其未官能化形式相比，所述改性将改变官能化色谱介质的极性和疏水性。
官能化色谱介质通常呈膜的形式。这样的膜适于用在膜色谱方法中。膜色谱方法是本领域技术人员熟知的并在“membraneprocessesinbiotechnologiesandpharmaceutics”catherinecharcosset编辑,elsevier,2012中有讨论，其全部内容通过引用并入本文。
通常，官能化聚合物色谱介质适于用在选自离子交换色谱、亲和捕获色谱、疏水色谱和混合模式色谱的色谱方法中。在某些情况下，色谱方法以“混合模式”操作，即利用不止一种形式的相互作用，即离子交换、亲和捕获和疏水相互作用。通常，这样的“混合模式”色谱法涉及离子交换(离子)和疏水相互作用。优选地，官能化聚合物色谱介质适于用在选自离子交换色谱法、亲和捕获色谱法和疏水色谱法的色谱方法中，优选离子交换色谱法和亲和捕获色谱法中。在操作中，此类色谱方法涉及使含有所需分子的流动相通过吸附剂相(这里为官能化色谱介质)。通常选择吸附剂相使得所需分子相对于流动相中还存在的其他组分优先地保留在其上。
通常，聚合物色谱介质用deae、q、sp、cm、蛋白a、苯基或mep基团官能化，例如用deae、q、sp、cm或蛋白a基团官能化。通常，所述聚合物为纤维素并且色谱介质用deae、q、sp、cm、蛋白a、苯基或mep基团官能化，例如用deae、q、sp、cm或蛋白a基团官能化。因此，官能化色谱介质可以是用deae、q、sp、cm、蛋白a、苯基或mep基团衍生化的纤维素，例如用deae、q、sp、cm或蛋白a基团衍生化的纤维素。在一个优选的实施方案中，聚合物色谱介质用蛋白a官能化。
离子交换色谱法是一种基于其离子电荷分离分子(通常是离子或极性分子)的技术。因此用于此类方法中的官能化色谱介质含有一个或多个带正电荷或带负电荷的部分。官能化色谱介质中的正电荷和/或负电荷通常用一种或多种抗衡离子平衡。离子交换色谱法包括阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法中的一者或多者。
用于阳离子交换色谱法中的官能化色谱介质含有一个或多个带负电荷的部分。典型的带负电荷的部分包括一个或多个羧酸根、磺酸根或膦酸根基团或其混合物，即所述部分通常含有一个或多个-coo-、-so3-或-p(oh)2o-基团或其混合物。磺酸根基团被认为是强阳离子交换配体，而羧酸根和膦酸根被分类为弱阳离子交换配体，具有ph-依赖性程度的解离。用于阳离子交换色谱法中的典型官能化色谱介质含有一个或多个-o-ch2coo-、-ch2coo-、-so3-、-ch2ch2ch2so3-、-ch2ch2so3-或-p(oh)2o-部分。
用于阴离子交换色谱法中的官能化色谱介质含有一个或多个带正电荷的部分。典型的带正电荷的部分包括一个或多个季胺基团(强阴离子交换配体)或叔胺基团(弱阴离子交换配体)。用于阴离子交换色谱法中的典型官能化色谱介质含有一个或多个-n+(ch3)3、-n+(c2h5)h、-ch2ch2n+(c2h5)h、-ch2ch2n+(c2h5)2(ch2ch(oh)ch3)、-o-ch2ch2-n+(ch3)3、-ch2ch2n+(ch3)3或-ch2ch2n+(ch3)2h部分。
为避免疑义，“带电基团”是指包含离子化的部分使得其带正电荷或负电荷的基团，即“带电基团”包括阴离子或阳离子部分。带电基团为配体基团的一个特定实例。
通常，所述一个或多个带电基团包括一个或多个羧酸根(-coo-)、磺酸根(-so3-)或膦酸根(-p(oh)2o-)基团、或季胺基团、或其混合物。通常，所述一个或多个带电基团包括所有阴离子基团或所有阳离子基团，然而在某些情况下，考虑阴离子和阳离子基团的混合物。通常，仅使用一种类型的阴离子基团，但也可使用混合物。通常，仅使用一种类型的阳离子基团，但也可使用混合物。代表性的带电基团包括-o-ch2coo-、-ch2coo-、-so3-、-ch2ch2ch2so3-、-ch2ch2so3-、-p(oh)2o-、-n+(ch3)3、-n+(c2h5)h、-ch2ch2n+(c2h5)h、-ch2ch2n+(c2h5)2(ch2ch(oh)ch3)、-o-ch2ch2-n+(ch3)3、-ch2ch2n+(ch3)3和-ch2ch2n+(ch3)2h部分。
典型的带电基团包括deae、q、sp和cm基团。通常，官能化聚合物色谱介质用deae、q、sp或cm基团官能化。因此，官能化色谱介质可以是用deae、q、sp或cm基团衍生化的纤维素。
亲和捕获色谱法是一种基于分子对特定配体(通常但不总是生物配体)的亲和力来分离分子的技术。这种方法可例如依赖于抗体与抗原或者酶与底物之间的吸引力。用于亲和捕获色谱法中的官能化色谱介质通常含有一个或多个选自一种或多种蛋白、肽、抗体或其片段、染料、组氨酸或含有金属阳离子的基团的部分。因此，所述一个或多个配体基团可包含一个或多个这样的部分。或者，用于亲和捕获色谱法中的官能化色谱介质可含有模拟蛋白配体的作用的模拟或合成配体。
用于亲和捕获色谱法中的典型蛋白是本领域技术人员熟知的并包括蛋白a、蛋白g和蛋白l。优选蛋白a。
蛋白a是技术人员熟知的蛋白。如本文所用，对“蛋白a”的提及包括重组蛋白a(其与金黄色葡萄球菌中发现的蛋白a相比可具有改变的序列)和标签蛋白a(如ep-b-0873353和us6399750中所述，其全部内容通过引用并入本文)。蛋白a可以是蛋白a的修饰变体，例如蛋白a的半胱氨酸修饰变体或突变的蛋白a免疫球蛋白结合结构域的碱稳定多聚体，例如描述于us8198404或us20170334954，通过引用以其整体并入本文。
用于亲和捕获色谱法中的典型抗体及其片段是本领域技术人员熟知的并包括igg。
用于亲和捕获色谱法中的典型染料是本领域技术人员熟知的并包括yellowhe-4r、redhe-3b和cibacronbluef3g。
用于亲和捕获色谱法中的含有金属阳离子的典型基团是本领域技术人员熟知的。这样的基团通常含有螯合剂以固定金属阳离子。金属阳离子通常选自铜、镍、锌和钴阳离子，优选地cu2+、ni2+、zn2+和co2+。疏水相互作用色谱法是基于分子的疏水性来分离分子的技术。因此用于此类方法中的官能化色谱介质含有一个或多个含有一个或多个疏水基团的部分。典型的疏水基团包括丙基、丁基、苯基和辛基。
混合模式(亦称为多模式)色谱法是基于两种或更多种特征(通常为疏水性和离子电荷)来分离分子的技术。这可能涉及疏水性和阴离子性的组合，或疏水性和阳离子性的组合。因此用于此类方法中的官能化色谱介质通常含有一个或多个通常如上文所限定的带正电荷或带负电荷的部分，并且其含有一个或多个通常如上文所限定的疏水基团。
官能化色谱介质中的正电荷和/或负电荷通常用一种或多种抗衡离子平衡。用于此类方法中的官能化色谱介质还可含有一个或多个可电离的疏水基团，以用在所谓的疏水电荷诱导色谱法(hcic)中。因此，在一个实施方案中，混合模式色谱法为疏水电荷诱导色谱法。用于此类方法中的合适基团有4-巯基-乙基-吡啶(mep)基团和辛胺基团。
用于涉及疏水和阴离子相互作用的组合的混合模式色谱方法中的官能化色谱介质含有一个或多个通常如上文所限定的带正电荷的部分和一个或多个通常如上文所限定的疏水基团。用于此类方法中的合适基团有n-苄基甲基乙醇胺基团和n-苯甲酰-高半胱氨酸基团。用于涉及疏水和阳离子相互作用的组合的混合模式色谱方法中的官能化色谱介质含有一个或多个通常如上文所限定的带负电荷的部分和一个或多个通常如上文所限定的疏水基团。用于此类方法中的合适基团有n-苯甲酰-高半胱氨酸基团。
本发明中要求保护的用于制备官能化色谱介质的方法通常在步骤(iii)中涉及向接枝产物中引入一个或多个配体基团使得包含所述一个或多个配体基团的所得官能化产物适于在色谱方法中用作色谱介质。典型的部分、介质、试剂和方法为如上文所限定。通过使合适的试剂与接枝产物上包含的一个或多个官能团反应来引入所述一个或多个配体基团。典型的官能团包括羟基、氨基、卤素和羧基。由于方法的步骤(ii)可涉及缩水甘油聚合，故所述官能团通常为羟基。用于引入所述一个或多个配体基团的合适试剂将在别处讨论。
所述一个或多个官能团可在与试剂反应之前活化。可采用本领域已知的常规活化方法。因此，在其中官能团为羟基的情况下，这样的基团可通过用羰基二咪唑(cdi)、双环氧乙烷、氰尿酸、n-羟基琥珀酰亚胺酯(nhs)、2-氟-1-甲基吡啶鎓甲苯-4磺酸盐(fmp)、naio4、二乙烯基砜或烯丙基缩水甘油基醚处理来活化。在其中所述官能团为氨基的情况下，这样的基团可通过用表氯醇、戊二醛或环氧化物处理来活化。在其中所述官能团为羧基的情况下，这样的基团可通过用cdi或1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(edc)处理来活化。在其中所述官能团为卤素原子的情况下，这样的基团可通过用二乙烯基砜处理来活化。
技术人员可选择合适的试剂来向特定的聚合物中引入特定的基团和部分，例如基于所需的配体基团和部分以及那些聚合物中所含的官能团。典型的试剂包括2-氯-n,n-二乙基胺盐酸盐(deach)；缩水甘油基三甲基氯化铵(gmac)；1,4-丁磺酸内酯；氯乙酸钠；naio4，然后是蛋白a；二乙烯基砜，然后是蛋白a；烯丙基缩水甘油基醚，然后首先是卤代醇形成试剂，随后是蛋白a；或者烯丙基缩水甘油基醚，然后首先是环氧化物形成试剂，随后是蛋白a。
典型的卤代醇形成试剂包括卤素的亲电子源和羟基的亲核源。因此，典型的卤代醇形成试剂包括在水中的双原子卤素(通常为cl2、br2或i2)、n-氯代琥珀酰亚胺、n-溴代琥珀酰亚胺或n-碘代琥珀酰亚胺。通常，卤代醇形成试剂从烯烃产生卤代醇物质。卤代醇形成反应可以是区域选择性的以主要产生其上卤素原子与聚合物链的末端碳原子键合的卤代醇产物，或者其可以是区域选择性的以主要产生其上羟基与聚合物链的末端碳原子键合的卤代醇产物，或者其可具有低的区域选择性。优选地，卤代醇形成反应可以是区域选择性的以主要产生其上卤素原子与聚合物链的末端碳原子键合的卤代醇产物。
典型的环氧化物形成试剂包括过氧酸(如间-氯过氧苯甲酸(mcpba))、在naoh或h2o存在下的过氧化氢、在乙酰丙酮氧钒存在下的叔丁基过氧化氢、在ti(oipr)4和酒石酸二乙酯存在下的叔丁基过氧化氢、在ti(oipr)4和酒石酸二异丙酯存在下的叔丁基过氧化氢、或在果糖衍生的催化剂和碱存在下的臭氧。
通常，
-色谱方法为阳离子交换法，所述试剂用一个或多个带电基团官能化色谱介质，所述带电基团包括一个或多个羧酸根、磺酸根或膦酸根部分；或
-色谱方法为阴离子交换法，所述试剂用一个或多个带电基团官能化色谱介质，所述带电基团包括一个或多个季氨基或二乙胺部分；
-色谱方法为亲和捕获色谱法，所述试剂用一种或多种蛋白、肽、抗体或其片段、染料、组氨酸基团或含有金属阳离子的基团官能化色谱介质；
-色谱方法为疏水相互作用色谱法，所述试剂用一个或多个丙基、丁基、苯基或辛基官能化色谱介质；或
-色谱方法为混合模式色谱法，所述试剂用一个或多个mep、辛胺、n-苄基甲基乙醇胺或n-苯甲酰-高半胱氨酸基团官能化色谱介质。
合适地，官能化色谱介质是碱稳定的，即能够用碱性清洁溶液进行清洁，所述溶液包含至少0.1mnaoh，例如至少1mnaoh。为此，接枝聚合物涂层可以是碱稳定的，通常不含碱不稳定性的酯或酰胺基团。此外，配体应该是碱稳定的，对于上文列出的离子交换、混合模式和疏水配体是这种情况。蛋白质亲和配体可以是碱不稳定的，但通过如上文对于碱稳定性蛋白a配体所述的选择性突变，可以是碱稳定的。
本发明的特定实施方案
如上所述，本发明提供由聚合物纳米纤维基材制备官能化聚合物色谱介质的两步法，这两个步骤为(i)聚合物接枝步骤和(ii)官能化步骤。
聚合物接枝步骤通常向基材中引入500-60,000μmol/g、优选地1000-60,000μmol/g的聚合物。在一些实施方案中，接枝步骤引入1000-2000μmol/g。在其他实施方案中，接枝步骤引入5000-10,000μmol/g。在还其他的实施方案中，接枝步骤引入30,000-60,000μmol/g。该量通常可通过测量通过接枝方法加到基材的特定官能团(例如，羟基)的量的测定方法来确定。技术人员应清楚用来确定给定接枝材料样品中存在的特定官能团的量的合适方法。
通过使用增加的量或更高浓度的聚合试剂，或通过在更高的温度下或更长的时间内进行反应，可获得增加的聚合物密度。
在缩水甘油聚合的情形中，接枝步骤通常向接枝产物引入500-60,000μmol/g的缩水甘油，如通过接枝产物的-oh密度所测定。接枝产物的-oh密度可通过滴定法测定，通常用四丁基氢氧化铵滴定。
通过使用增加的量的缩水甘油或具有式(i)的缩水甘油衍生物可获得增加的-oh密度。
优选地，通过以下测定方法来确定特定聚合物样品的-oh含量：
1)将接枝材料的样品放置在位于布氏过滤漏斗中的润湿滤纸上，用超纯水洗涤，同时施加真空以确保水洗涤通过样品；
2)在60℃的烘箱中干燥样品至恒重并测定样品的质量。
3)将样品切碎并悬浮在含有10ml对甲苯磺酰异氰酸酯溶液(20ml对甲苯磺酰异氰酸酯/500ml乙腈)的50ml离心管中；
4)将管密封并在水浴中于加热(60℃)下搅拌混合物1小时；
5)让管及其内容物冷却至室温，用10ml超纯h2o小心淬灭，然后将混合物转移到滴定杯中并用异丙醇补足至80ml；
6)将混合物于室温下搅拌30分钟，然后用四丁基氢氧化铵(在甲醇中的0.481m溶液)滴定，以测定存在的羟基的绝对浓度。
特定聚合物样品的-oh浓度(mol/g)可通过用上述测定方法测定样品中羟基的绝对浓度并除以测定方法的步骤(2)中获得的干燥样品的总质量来确定。
在步骤(ii)和(iii)之后，在本发明的方法的步骤(iii)中引入的配体基团的密度通常为100-2,000μmol/g官能化色谱介质。密度优选为300-1,500μmol/g，更优选500-1200μmol/g。在一些实施方案中，密度为100-500μmol/g。在其他实施方案中，密度为1200-2000μmol/g。远高于2,000μmol/g的官能化色谱介质的密度可能导致材料难以用作色谱介质。
通常通过滴定法测定密度来确定官能化材料中的部分的数目。技术人员应清楚用来确定给定官能化材料样品中存在的特定部分的量的合适方法。
在用三甲基氯化铵官能化的情形中，密度可确定为三甲基氯化铵密度，其可通过以下测定方法来确定：
1)在布氏过滤漏斗上用100ml0.1mhcl溶液洗涤50mg材料，然后再用100ml0.01mhcl溶液洗涤；
2)将材料在75℃的干燥烘箱中干燥至恒重，然后撕成小块并置于装配有小磁力搅拌棒的50ml离心管中；
3)加入15ml去离子水和大约1ml(通过橡皮头移液管加入)铬酸钾溶液，其使混合物颜色变黄；
4)剧烈搅拌混合物20分钟，然后用0.1m硝酸银滴定，滴定的终点通过颜色从澄清的黄色变为雾浊的棕色来识别；
5)以加入以达到终点的硝酸银的微摩尔数/滴定中使用的纳米纤维材料的克数来计算该三甲基氯化铵含量(μmol/g)。
在用磺酸(s)基团官能化的情形下，密度可确定为磺酸密度，其可通过以下测定方法来确定：
1)用0.1mhcl和0.01mhcl洗涤干燥的官能化材料样品；
2)在烘箱中干燥材料并称重；
3)用为达到ph7而必须加入的naoh的量来确定材料的摩尔浓度；
4)以加入以达到ph7的naoh的微摩尔数/滴定中使用的纳米纤维材料的克数来计算磺酸(s)含量(μmol/g)。
本发明的两步法允许对材料样品上压降的高度控制。这是有利的，因为色谱材料上的绝对压降在工业规模上是限制因素。具体而言，大多数市售泵的正常运行参数使得2mpa的压降是最大可容许压降。本发明人已发现，在2mpa的压降下令人惊奇地高流速的材料可以通过根据本发明产生的材料。因此，当液相以每分钟1至640倍膜体积的流速通过厚度为0.05至10mm的官能化聚合物色谱介质时，通常经过介质的压降小于2mpa或小于1mpa/mm床高。这可使用标准手段确定，例如äkta蛋白纯化系统，使用水性缓冲液，其通常具有小于1.2mpas的粘度。这是材料的流动阻力的量度。
通常，压降小于1mpa，优选小于0.5mpa。通常，通过介质的流速介于每分钟1至60倍膜体积之间，优选介于5至40倍之间。
通过介质的液相不是特别重要。典型的液相包括标准缓冲液，例如tris缓冲液，优选10mmtris。通常，使液相通过0.1至5mm厚的材料。
优选地，当tris缓冲液以每分钟1至60倍膜体积的流速通过厚度为0.1至5mm的官能化聚合物色谱介质时，介质上的压降小于1mpa。更优选地，当10mm的tris以每分钟5至40倍膜体积的流速通过厚度为0.1至5mm的官能化聚合物色谱介质时，介质上的压降小于0.5mpa。接枝和官能化步骤的组合允许实现具有高的动态结合容量(dbc)的材料。因此，通常，官能化色谱材料具有10至210mg/ml(10%穿透)、优选地20至195mg/ml(10%穿透)、30至180mg/ml(10%穿透)、40至165mg/ml(10%穿透)、或50至150mg/ml(10%穿透)的dbc。对于其中步骤(ii)涉及缩水甘油聚合的材料，通常官能化色谱材料具有50-150mg/ml(10%穿透)的dbc。10%穿透下的dbc可按标准手段确定，例如使用äktapure系统。
通常按以下测定方法测定10%穿透下的dbc：
1)使装载材料(对于阴离子交换材料，装载材料为1mg/ml的bsa/10mmtris(ph8)；对于阳离子交换材料，装载材料为1mg/ml的溶菌酶/乙酸钠ph4.710mm)通过äktapure系统(gehealthcare)上贮器内所含的官能化材料；
2)在确定的每分钟膜体积流速(mv/min)下装载材料直至贮器出口后的浓度超过装载量的10%，如由uv流量单元所测定；
3)考虑到系统和贮器设备中的死体积，通过在unicorn软件(gehealthcare)中分析色谱图来确定10%穿透下装载到圆盘上的蛋白的总量。本发明的官能化材料高的动态结合容量和通过本发明的官能化材料的高的可能流速能够有利地实现高的生产率。因此，通常，所述官能化聚合物色谱介质的生产率为50mg/ml/min至75,000mg/ml/min。优选地，生产率为600mg/ml/min或更高。更优选地，生产率为1200mg/ml/min或更高。甚至更优选地，生产率为2400mg/ml/min或更高。生产率可为10,000mg/ml/min或更高或者甚至15,000mg/ml/min或更高，或者20,000mg/ml/min或更高。使用缩水甘油聚合通常可实现10,000mg/ml/min、15,000mg/ml/min或20,000mg/ml/min或更高的生产率。如本文所用，材料的生产率决定于每单位时间每单位体积材料可装载多少材料到吸附材料上。在实践中，这确定为dbc(10%穿透)除以装载材料在贮器中的停留时间。停留时间又可由通过贮器的材料的流速来确定。
如上文所讨论，本发明人已彻底研究了接枝步骤(ii)和官能化步骤(iii)之间的关系并已发现通过将这些步骤彼此分离可产生高度优化的材料。
因此，在某些实施方案中，已发现接枝步骤(ii)具有增加官能化聚合物色谱介质的动态结合容量(dbc)的作用。因此，对于给定配体基团密度的两种材料，已发现具有较高接枝程度的材料通常具有较高的dbc。对于用带正电荷的基团官能化的材料——即当官能化色谱材料适于用在阴离子交换色谱法中时，情况尤其是这样。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种制备官能化聚合物色谱介质的方法，所述方法包括：
(i)如本文所限定，提供由一个或多个聚合物纳米纤维形成的基材，
(ii)如本文所限定，从基材接枝一个或多个中性聚合物链，和
(iii)如本文所限定，使接枝产物与试剂接触，所述试剂使步骤(ii)的产物官能化为如本文所限定的色谱介质，其中接枝步骤(ii)包括使多个式
与纳米纤维基材上存在的一个或多个官能团反应，其中r1、r2、r3、r4和r5可相同或不同，并选自h、卤素、c1-c4烷基或c1-c4烷氧基，前提条件是r1、r2、r3、r4或r5中的至少一个不为氢，并具有增加官能化聚合物色谱材料的dbc的作用。
在其他实施方案中，通常用带负电荷的基团官能化的材料——即当官能化色谱材料适于用在阳离子交换色谱法中时，已发现改变所要求保护的方法的步骤(iii)中使用的官能化试剂的量仅对电荷密度有小的影响，但当与接枝步骤组合时，对于相同程度的官能化，可实现结合容量的显著增加。同样，因此显然接枝和官能化步骤的组合对dbc产生了积极的影响。
通常，官能化色谱介质为官能化纤维素色谱介质并且基材由一个或多个乙酸纤维素纳米纤维形成，在步骤(i)和(ii)之间，处理乙酸纤维素以将其转化为纤维素，从基材接枝一个或多个中性聚合物链的步骤涉及缩水甘油聚合，使接枝产物与选自以下的试剂接触：缩水甘油基三甲基氯化铵(gmac)；1,4-丁磺酸内酯；氯乙酸钠；naio4，然后是蛋白a；二乙烯基砜，然后是蛋白a；烯丙基缩水甘油基醚，然后首先是卤代醇形成试剂(例如，n-溴代琥珀酰亚胺)，随后是蛋白a；或烯丙基缩水甘油基醚，然后首先是环氧化物形成试剂，随后是蛋白a。
或者，官能化色谱介质为官能化纤维素色谱介质并且基材由一个或多个乙酸纤维素纳米纤维形成，接枝步骤包括乙酸纤维素向纤维素的转化(皂化)和一个或多个中性聚合物链经由缩水甘油聚合向所得纤维素基材上的接枝二者，使接枝产物与选自以下的试剂接触：缩水甘油基三甲基氯化铵(gmac)；1,4-丁磺酸内酯；氯乙酸钠；naio4，然后是蛋白a；二乙烯基砜，然后是蛋白a；烯丙基缩水甘油基醚，然后首先是卤代醇形成试剂(例如，n-溴代琥珀酰亚胺)，随后是蛋白a；或烯丙基缩水甘油基醚，然后首先是环氧化物形成试剂，随后是蛋白a。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种制备官能化纤维素色谱介质的方法，所述方法包括：
(i)提供由一个或多个乙酸纤维素纳米纤维形成的基材，处理乙酸纤维素以将其转化为纤维素，
(ii)如本文所限定，从所得纤维素基材接枝一个或多个中性聚合物链，和
(iii)如本文所限定，使接枝产物与试剂接触，所述试剂将步骤(ii)的产物官能化为如本文所限定的色谱介质，其中接枝步骤(ii)包括使多个式
通常，在此优选的实施方案中，步骤(i)包括提供由一个或多个非织造片材形成的基材，每个非织造片材包含一个或多个乙酸纤维素纳米纤维。
优选地，在此优选的实施方案中，步骤(i)包括提供一个堆叠在另一个之上的两个或更多个非织造片材，每个所述片材包含一个或多个乙酸纤维素纳米纤维，并同时加热和压制该片材的叠层以熔合相邻片材的纳米纤维之间的接触点。
在一个替代的优选实施方案中，本发明提供了一种制备官能化纤维素色谱介质的方法，所述方法包括：
(i)提供由一个或多个乙酸纤维素纳米纤维形成的基材，
(ii)使基材经受在其下乙酸纤维素转化为纤维素并且随后一个或多个中性聚合物链接枝到所得纤维素基材上的条件，和
(iii)如本文所限定，使接枝产物与试剂接触，所述试剂将步骤(ii)的产物官能化为如本文所限定的色谱介质，其中接枝步骤(ii)包括使多个式
通常，在此替代的优选实施方案中，步骤(i)包括提供由一个或多个非织造片材形成的基材，每个非织造片材包含一个或多个乙酸纤维素纳米纤维。
优选地，在此替代的优选实施方案中，步骤(i)包括提供一个堆叠在另一个之上的两个或更多个非织造片材，每个所述片材包含一个或多个乙酸纤维素纳米纤维，并同时加热和压制该片材的叠层以熔合相邻片材的纳米纤维之间的接触点。在一个更优选的实施方案中，本发明提供了一种制备官能化纤维素色谱介质的方法，所述方法包括：
(i)提供由一个或多个乙酸纤维素纳米纤维形成的基材，处理乙酸纤维素以将其转化为纤维素，
(ii)通过使多个式
(iii)如本文所限定，使接枝产物与试剂接触，所述试剂将步骤(ii)的产物官能化为色谱介质。
通常，在此更优选的实施方案中，步骤(i)包括提供由一个或多个非织造片材形成的基材，每个非织造片材包含一个或多个乙酸纤维素纳米纤维。优选地，在此更优选的实施方案中，步骤(i)包括提供一个堆叠在另一个之上的两个或更多个非织造片材，每个所述片材包含一个或多个乙酸纤维素纳米纤维，并同时加热和压制该片材的叠层以熔合相邻片材的纳米纤维之间的接触点。在一个替代的更优选实施方案中，本发明提供了一种制备官能化纤维素色谱介质的方法，所述方法包括：
(i)提供由一个或多个乙酸纤维素纳米纤维形成的基材，
(ii)使基材经受在其下乙酸纤维素转化为纤维素并且随后一个或多个中性聚合物链通过多个式
(iii)如本文所限定，使接枝产物与试剂接触，所述试剂将步骤(ii)的产物官能化为色谱介质。通常，在此替代的更优选实施方案中，步骤(i)包括提供由一个或多个非织造片材形成的基材，每个非织造片材包含一个或多个乙酸纤维素纳米纤维。
优选地，在此替代的更优选实施方案中，步骤(i)包括提供一个堆叠在另一个之上的两个或更多个非织造片材，每个所述片材包含一个或多个乙酸纤维素纳米纤维，并同时加热和压制该片材的叠层以熔合相邻片材的纳米纤维之间的接触点。
在一个甚至更优选的实施方案中，本发明提供了一种制备官能化纤维素色谱介质的方法，所述方法包括：
(i)提供由一个或多个乙酸纤维素纳米纤维形成的基材，处理乙酸纤维素以将其转化为纤维素，
(ii)通过使多个式
(iii)使接枝产物与试剂接触，所述试剂将步骤(ii)的产物官能化为适于用在离子交换或亲和色谱方法中的色谱介质。
通常，在此甚至更优选的实施方案中，步骤(i)包括提供由一个或多个非织造片材形成的基材，每个非织造片材包含一个或多个乙酸纤维素纳米纤维。
优选地，在此甚至更优选的实施方案中，步骤(i)包括提供一个堆叠在另一个之上的两个或更多个非织造片材，每个所述片材包含一个或多个乙酸纤维素纳米纤维，并同时加热和压制该片材的叠层以熔合相邻片材的纳米纤维之间的接触点。
在一个替代的甚至更优选的实施方案中，本发明提供了一种制备官能化纤维素色谱介质的方法，所述方法包括：
(i)提供由一个或多个乙酸纤维素纳米纤维形成的基材，
(ii)使基材经受在其下乙酸纤维素转化为纤维素并且随后一个或多个中性聚合物链通过多个式
(iii)使接枝产物与试剂接触，所述试剂将步骤(ii)的产物官能化为适于用在离子交换或亲和色谱方法中的色谱介质。
通常，在此替代的甚至更优选的实施方案中，步骤(i)包括提供由一个或多个非织造片材形成的基材，每个非织造片材包含一个或多个乙酸纤维素纳米纤维。优选地，在此替代的甚至更优选的实施方案中，步骤(i)包括提供一个堆叠在另一个之上的两个或更多个非织造片材，每个所述片材包含一个或多个乙酸纤维素纳米纤维，并同时加热和压制该片材的叠层以熔合相邻片材的纳米纤维之间的接触点。
在一个还更优选的实施方案中，本发明提供了一种制备官能化纤维素色谱介质的方法，所述方法包括：
(i)提供由一个或多个乙酸纤维素纳米纤维形成的基材，处理乙酸纤维素以将其转化为纤维素，
(ii)通过使多个式
(iii)使接枝产物与试剂接触，所述试剂将步骤(ii)的产物官能化为适于用在离子交换或亲和色谱方法中的色谱介质，所述试剂为缩水甘油基三甲基氯化铵(gmac)；1,4-丁磺酸内酯；氯乙酸钠；naio4，然后是蛋白a；二乙烯基砜，然后是蛋白a；烯丙基缩水甘油基醚，然后首先是卤代醇形成试剂(例如，n-溴代琥珀酰亚胺)，随后是蛋白a；或烯丙基缩水甘油基醚，然后首先是环氧化物形成试剂，随后是蛋白a。
通常，在此还更优选的实施方案中，步骤(i)包括提供由一个或多个非织造片材形成的基材，每个非织造片材包含一个或多个乙酸纤维素纳米纤维。
优选地，在此还更优选的实施方案中，步骤(i)包括提供一个堆叠在另一个之上的两个或更多个非织造片材，每个所述片材包含一个或多个乙酸纤维素纳米纤维，并同时加热和压制该片材的叠层以熔合相邻片材的纳米纤维之间的接触点。
在一个替代的还更优选的实施方案中，本发明提供了一种制备官能化纤维素色谱介质的方法，所述方法包括：
(i)提供由一个或多个乙酸纤维素纳米纤维形成的基材，
(ii)使基材经受在其下乙酸纤维素转化为纤维素并且随后一个或多个中性聚合物链通过多个式
(iii)使接枝产物与试剂接触，所述试剂将步骤(ii)的产物官能化为适于用在离子交换或亲和色谱方法中的色谱介质，所述试剂为缩水甘油基三甲基氯化铵(gmac)；1,4-丁磺酸内酯；氯乙酸钠；naio4，然后是蛋白a；二乙烯基砜，然后是蛋白a；烯丙基缩水甘油基醚，然后首先是卤代醇形成试剂(例如，n-溴代琥珀酰亚胺或溴水)，随后是蛋白a；或烯丙基缩水甘油基醚，然后首先是环氧化物形成试剂，随后是蛋白a。
通常，在此替代的还更优选的实施方案中，步骤(i)包括提供由一个或多个非织造片材形成的基材，每个非织造片材包含一个或多个乙酸纤维素纳米纤维。
优选地，在此替代的还更优选的实施方案中，步骤(i)包括提供一个堆叠在另一个之上的两个或更多个非织造片材，每个所述片材包含一个或多个乙酸纤维素纳米纤维，并同时加热和压制该片材的叠层以熔合相邻片材的纳米纤维之间的接触点。
在一个还甚至更优选的实施方案中，本发明提供了一种制备官能化纤维素色谱介质的方法，所述方法包括：
(i)提供由一个或多个乙酸纤维素纳米纤维形成的基材，处理乙酸纤维素以将其转化为纤维素，
(ii)通过使多个式
(iii)使接枝产物与试剂接触，所述试剂将步骤(ii)的产物官能化为适于用在离子交换或亲和色谱方法中的色谱介质，所述试剂为二乙烯基砜，然后是蛋白a；烯丙基缩水甘油基醚，然后首先是卤代醇形成试剂(例如，n-溴代琥珀酰亚胺或溴水)，随后是蛋白a；或烯丙基缩水甘油基醚，然后首先是环氧化物形成试剂，随后是蛋白a。
通常，在此还甚至更优选的实施方案中，步骤(i)包括提供由一个或多个非织造片材形成的基材，每个非织造片材包含一个或多个乙酸纤维素纳米纤维。
优选地，在此还甚至更优选的实施方案中，步骤(i)包括提供一个堆叠在另一个之上的两个或更多个非织造片材，每个所述片材包含一个或多个乙酸纤维素纳米纤维，并同时加热和压制该片材的叠层以熔合相邻片材的纳米纤维之间的接触点。
在一个替代的还甚至更优选的实施方案中，本发明提供了一种制备官能化纤维素色谱介质的方法，所述方法包括：
(i)提供由一个或多个乙酸纤维素纳米纤维形成的基材，
(ii)使基材经受在其下乙酸纤维素转化为纤维素并且随后一个或多个中性聚合物链通过多个式
(iii)使接枝产物与试剂接触，所述试剂将步骤(ii)的产物官能化为适于用在离子交换或亲和色谱方法中的色谱介质，所述试剂为二乙烯基砜，然后是蛋白a；烯丙基缩水甘油基醚，然后首先是卤代醇形成试剂(例如，n-溴代琥珀酰亚胺)，随后是蛋白a；或烯丙基缩水甘油基醚，然后首先是环氧化物形成试剂，随后是蛋白a。通常，在此替代的还甚至更优选的实施方案中，步骤(i)包括提供由一个或多个非织造片材形成的基材，每个非织造片材包含一个或多个乙酸纤维素纳米纤维。
优选地，在此替代的还甚至更优选的实施方案中，步骤(i)包括提供一个堆叠在另一个之上的两个或更多个非织造片材，每个所述片材包含一个或多个乙酸纤维素纳米纤维，并同时加热和压制该片材的叠层以熔合相邻片材的纳米纤维之间的接触点。
本发明的色谱柱
本发明还提供了一种色谱柱，如图15所示。本发明的色谱柱(110)包含一种或多种本发明的官能化色谱介质(120)。或者，本发明的色谱柱可通过进行本发明的方法并向柱中引入由此获得的产物而获得。还提供了一种制备色谱柱的方法，其包括进行本发明的方法并向柱中引入由此获得的产物。
所述色谱柱通常适于用在色谱法中，优选如本文所限定的色谱方法。
本发明的色谱柱通常在贮器(190)、例如如上文所限定的贮器内包含一种或多种本发明的官能化色谱介质。尽管图15显示轴向色谱柱，但同样可能具有径向流动柱，其中几个不同结构是本领域技术人员已知的。贮器通常是圆柱形的，但它也可能是矩形的。通常，色谱柱包含堆叠在圆柱形或矩形贮器内的一种或多种本发明的官能化色谱介质。通常，色谱柱包含两种或更多种本发明的官能化色谱介质。通常，色谱柱包含至多二十种本发明的官能化色谱介质。官能化色谱介质(120)的第一侧(130)通过入口流体分配器(150)流体连接至入口(140)，而官能化色谱介质的第二侧通过出口流体收集器(180)流体连接至出口(170)。流体分配器和流体收集器的结构是本领域技术人员众所周知的。
通常，色谱柱还在通常圆柱形或矩形的贮器内包含一个或多个滤头(frits)。滤头是本领域技术人员熟知的，是指刚性多孔结构，通常是刚性金属、聚合物或陶瓷的多孔结构，优选刚性金属或陶瓷的多孔结构。通常在色谱柱中包括滤头以改善通过柱的流量分布和/或支持所述一种或多种本发明的官能化色谱介质。典型的滤头中的孔具有1至1000μm、优选5至500μm、更优选10至150μm的直径。其他合适的滤头孔径包括1至20μm、优选5至10μm、更优选3至7μm。通常，所述柱包含两种或更多种本发明的官能化色谱介质和一个或多个滤头，所述滤头位于官能化色谱介质之间。
在一些实施方案中，所述柱不包含滤头。代替滤头或除滤头之外，所述柱可包含替代的间隔材料。典型的替代间隔材料包括非织造和织造材料。
非织造聚合物材料是本领域技术人员已知的。这样的非织造材料是多孔的，即允许液体通过，通常没有明显的压降。通常，非织造聚合物材料为聚丙烯。通常，非织造材料的面密度为45-150gsm。
在一些实施方案中，所述柱包含两种或更多种本发明的官能化色谱介质和一个或多个如上文所限定的非织造聚合物材料层，所述一个或多个非织造聚合物材料层位于官能化色谱介质之间。
织造材料是本领域技术人员已知的。这样的织造材料是多孔的，即允许液体通过，通常没有明显的压降。通常，织造材料为织造聚合物材料，优选织造聚丙烯。通常，织造材料的厚度小于1mm。
色谱柱通常可适合单次使用应用，即由低成本、容易处置的材料例如塑料构成。合适地，色谱柱被预灭菌，例如通过γ辐射或者通过汽蒸/高压灭菌，并且被无菌包装用于直接使用。色谱柱可配备有本领域已知的无菌连接器，例如readymate(gehealthcare)或kleenpak(pall)。
本发明的色谱方法
本发明还提供了本发明的官能化色谱介质或本发明的色谱柱在色谱法中的用途，特别是在如本文所限定的色谱方法中的用途。
本发明还提供了一种从流动相分离一种或多种生物分子(也称为靶生物分子)的方法，该方法包括使流动相中的一种或多种生物分子与本发明的官能化色谱介质或本发明的色谱柱接触。所述色谱介质或色谱柱优先与流动相中的所述一种或多种生物分子结合，通常优先于也存在于流动相中的其他组分(例如其他生物分子)。这可根据已知用于此类色谱方法的结合阶段的常规方法进行。因此，通常，此色谱方法为离子(阴离子或阳离子)交换、亲和捕获、疏水相互作用或混合模式色谱方法。优选地，色谱方法为阴离子交换色谱方法并且色谱介质用deae或q官能化；色谱方法为阳离子交换色谱方法并且色谱介质用sp或cm官能化；色谱方法为亲和捕获色谱方法并且色谱介质用蛋白a官能化；或者色谱方法为疏水相互作用色谱方法并且色谱介质用苯基官能化。因此，本发明提供了一种包括上述步骤的色谱方法。通常，所述色谱方法根据如上文所限定的色谱方法进行。
本发明的有利发现之一是通过本发明的方法产生的官能化色谱材料具有高的结合容量并可在高流速下工作。因此，通常在本发明的色谱方法中，流动相中的所述一种或多种生物分子与官能化色谱介质接触一分钟或更短、优选50秒或更短、更优选40秒或更短、仍更优选30秒或更短、还更优选20秒或更短、或甚至15秒或更短、12秒或更短、10秒或更短、8秒或更短、6秒或更短、4秒或更短、2秒或更短、1.5秒或更短、或甚至1秒或更短的时间。合适地，该步骤中的停留时间可以是0.1-30s，在工业应用中优选2-10s。然而，r&d/实验室应用可显著更快运行，例如具有0.1–10s的停留时间。
该方法可以是流通方法，其中靶生物分子不结合官能化色谱介质或与官能化色谱介质仅弱相互作用，并且可在流通液中回收，而其他生物分子(污染物和/或杂质)被官能化色谱介质保留。或者，该方法可以是结合-洗脱方法，如下文所述。
所述色谱方法通常包括从官能化色谱介质或色谱柱回收所述一种或多种生物分子的又一步骤。此步骤通常可通过使吸附了所述一种或多种生物分子的官能化色谱介质或色谱柱与洗脱缓冲液接触来实现。这可根据已知用于此类色谱方法的洗脱阶段的常规方法进行。因此，此方法通常为结合-洗脱色谱方法。在结合步骤和洗脱步骤之间，此方法可还包括洗涤吸附了所述一种或多种生物分子的本发明的官能化色谱介质或色谱柱的步骤。用洗涤液进行该洗涤步骤以除去未与官能化色谱介质或色谱柱结合的任何组分。这可根据已知用于此类色谱方法的洗涤阶段的常规方法进行。在洗脱步骤之后，此方法可还包括再生本发明的官能化色谱介质或色谱柱的步骤。通常，这通过使已自其洗脱所述一种或多种生物分子的官能化色谱介质或色谱柱与一种或多种再生液接触来实现。这可根据已知用于此类色谱方法的再生阶段的常规方法进行。再生液可包括汽提缓冲液、清洁液和/或平衡缓冲液。清洁液可以是碱性液体，例如包含至少0.1mnaoh或koh，例如0.1-1mnaoh或koh。再生之后，柱可重新用于一个或多个分离循环，例如五个或更多个分离循环。通常，所述一种或多种生物分子选自细胞、蛋白、多肽、抗体、氨基酸、病毒和核酸，包括例如重组蛋白、单克隆抗体、病毒疫苗、病毒载体、rna、外来体、细胞和质粒dna。
单克隆抗体可以是多特异性抗体(例如，双特异性抗体)或结构域缺失抗体。优选地，单克隆抗体为人源化抗体或人抗体。可使用单克隆抗体的抗原结合片段。抗体片段的实例包括fab、fab'、f(ab')2和fv片段、双抗体和单链抗体。
通常，所述一种或多种生物分子为一种或多种单克隆抗体，或经工程改造以呈现对蛋白a结合具有亲和力的位点的蛋白，并且任选地含在柱中的官能化色谱介质携带至少一个蛋白a配体基团。
通常，色谱方法采用模拟或实际移动床系统。因此，通常，所述方法包括将流动相中的所述一种或多种生物分子引入到一个或多个模拟或实际移动床色谱装置中，所述装置具有多个连接的色谱柱，这些色谱柱含有本发明的官能化色谱介质作为吸附剂。可使用任何已知的模拟或实际移动床装置来进行所述色谱方法，前提条件是其包含本发明的官能化色谱介质作为吸附剂。模拟和实际移动床色谱是本领域技术人员熟悉的已知技术。工作原理涉及液体洗脱剂相和固体吸附剂相的逆流运动。这种操作允许最少地使用溶剂，这使得此方法经济上可行。这样的分离技术已在不同领域得到应用，包括使用膜吸附剂纯化生物分子。
模拟移动床系统(亦称为周期逆流色谱系统)包含串联一起连接的许多含有吸附剂的单个柱子/柱(column/cartridge)。洗脱剂以第一方向通过柱子/柱。原料和洗脱剂的注入点及系统中分离的组分收集点通过一系列阀门周期性地改变。总体效果是模拟含有固体吸附剂的移动床的单个柱子的运行。因此，模拟移动床系统包含柱子，同在常规固定床系统中一样，这些柱子含有固体吸附剂的固定床，洗脱剂通过这些固定床，但在模拟移动床系统中，操作是模拟连续逆流移动床。本发明的色谱柱是特别合适的模拟移动床或周期逆流色谱操作，因为停留时间可以非常短，允许该方法的迅速循环并因此允许高的总体生产率。
实际的移动床系统在运行上类似于模拟移动床系统。然而，不是通过阀门系统来改变进料混合物和洗脱剂的注入点及分离组分的收集点，而是相对于进料和排出点物理地移动一系列吸附单元(即，柱子)。同样，操作是模拟连续逆流移动床。
本发明的材料也适于用在固定化酶生物催化、金属清除和水处理的方法中。因此，本发明提供了一种酶生物催化方法，其涉及本发明的官能化色谱材料。本发明还提供了一种金属清除方法，其涉及本发明的官能化色谱材料。本发明还提供了一种水处理方法，其涉及本发明的官能化色谱材料。应理解，为使得产品适于用在这些方法中，可能需要对本发明的方法和产品做某些微小的修改。
实施例
以下实施例举例说明本发明。
材料和设备
除非另有指出，否则所有化学品均来自或可得自各公司如fisherscientific、sigma-aidrich、fluorochem、repligen和vwr。
洗涤方案
洗涤方案a
用等体积的去离子水替换反应介质并循环1小时。再次重复漂洗程序。最后，用等体积的含水乙醇(h2o:乙醇为2:1)处理材料，然后从反应容器中取出。
洗涤方案b
用等体积的去离子水替换反应介质并循环1小时。其后，用0.01mhcl替换洗涤介质，将其循环1小时，然后用0.001mhcl替换并循环1小时。最后，用h2o:etoh的2:1混合物替换介质，将其循环1小时。然后从反应容器取出衍生化的纳米纤维。
洗涤方案c
用等体积的温热(60℃)去离子水:丙酮的1:1混合物替换反应介质，将其循环30分钟。洗涤程序再重复两次。最后，用h2o:etoh的2:1混合物替换介质，将其循环1小时。然后从反应容器取出衍生化的纳米纤维。
洗涤方案d
将2升超纯水泵送通过纳米纤维材料。
洗涤方案e
用等体积的1:1的去离子水:etoh替换反应介质并循环1小时。洗涤程序再重复两次。最后，用h2o:etoh的2:1混合物替换介质，将其循环1小时。然后从反应容器取出衍生化的纳米纤维。最后，用h2o:etoh的2:1混合物替换介质，将其循环1小时。然后从反应容器取出衍生化的纳米纤维。
洗涤方案f
用超纯去离子水替换反应介质。将纳米纤维材料在清水中温和搅拌30分钟。其后，替换洗涤介质并重复洗涤循环。
洗涤方案g
倒出反应介质并向烧杯中补充水直至流出物的ph为中性或微酸性。
洗涤方案h(对于卤代醇纳米纤维)
用等体积的去离子水:丙酮的1:1混合物替换反应介质，将其循环1小时。其后，更新洗涤溶液并在剧烈搅拌的同时再洗涤纤维1小时。此过程再重复3次，然后再用去离子水最后洗涤1小时。然后从反应容器取出衍生化的卤代醇纳米纤维并准备好用于下一步骤。
i材料的制备
制备实施例1
将相对分子质量为29,000g/mol的乙酸纤维素溶液溶解在普通溶剂中，然后电纺以产生直径在300-600nm之间的纤维。纳米纤维制备的优化条件可见于例如o.hardick等人,j.mater.sci.46(2011)3890中，其全部内容通过引用并入本文。将大约20g/m2材料的片材层叠并进行加热和加压组合处理。
实施例1-缩水甘油/三甲基氯化铵官能化
按下面概述的方案衍生化纳米纤维材料：
步骤(i)：乙酸纤维素(ca)皂化为再生纤维素(rc)
将根据制备实施例1的方法获得的乙酸纤维素片材(0.44×32mm×150mm)置于含有5l0.075m氢氧化钠溶液(在2:1的水:乙醇中)的大烧杯中。反应混合物于室温下搅拌48小时。然后根据洗涤方案a洗涤材料。
步骤(ii)：缩水甘油聚合
将来自(i)的材料悬浮在1l0.5mnaoh中。让反应介质循环15分钟，然后小心地一次性加入不同量的缩水甘油(15ml、30ml、60ml、120ml、180ml)。反应介质在室温下循环16小时，随后根据洗涤方案b洗涤材料。
步骤(iii)：缩水甘油基三甲基氯化铵衍生化
通常将步骤(ii)中获得的材料悬浮在1l0.5mnaoh中。让反应介质循环15分钟，然后一次性加入缩水甘油基三甲基氯化铵(25ml、50ml、100ml和200ml)。反应介质在室温下再循环16小时。然后根据洗涤方案c洗涤材料。通过以下方法测定该三甲基氯化铵含量。在布氏过滤漏斗上用100ml0.1mhcl溶液洗涤50mg材料，然后再用100ml0.01mhcl溶液洗涤。然后将材料置于75℃的干燥烘箱中并干燥至恒重，然后撕成小块并然后置于50ml离心管中。然后加入小磁力搅拌棒和15ml去离子水及大约1ml(通过橡皮头移液管加入)铬酸钾溶液，其使混合物颜色变黄。将混合物剧烈搅拌20分钟，然后用0.1m硝酸银滴定。滴定的终点通过颜色从澄清的黄色变为雾浊的棕色来识别。以加入以达到终点的硝酸银的微摩尔数/滴定中使用的纳米纤维材料的克数计算该三甲基氯化铵含量(μmol/g)。
实施例2-缩水甘油/s官能化
按下面概述的方案衍生化纳米纤维材料：
步骤(i)：乙酸纤维素(ca)皂化为再生纤维素(rc)
将根据制备实施例1的方法获得的乙酸纤维素片材(0.44×32mm×150mm)悬浮在5l0.075m氢氧化钠溶液(在2:1的水:乙醇中)中。反应混合物于室温下循环48小时。然后根据洗涤方案a洗涤材料。
步骤(ii)：缩水甘油衍生化
将来自(i)的材料悬浮在1l0.5mnaoh中。让反应介质循环15分钟，然后小心地一次性加入不同量的缩水甘油(15ml、30ml、120ml、180ml)。反应介质在室温下循环16小时，随后根据洗涤方案b洗涤材料。
步骤(iii)：1,4-丁磺酸内酯衍生化
将由150ml1mnaoh(水溶液)组成的反应介质加热至53℃。将步骤(ii)中得到的缩水甘油官能化材料与1,4-丁磺酸内酯(6ml，53℃，58.6mmol)一起悬浮于其中。反应介质于60℃下搅拌15分钟、30分钟和60分钟。然后根据洗涤方案b洗涤材料。通过滴定计算材料的磺酸(s)含量(µmol/g)。用0.1mhcl和0.01mhcl洗涤来自(iii)的干燥材料。然后将材料烘箱干燥并称重。洗涤后，由为达到ph7而加入的naoh的量来确定材料的摩尔浓度。
实施例3-缩水甘油/羧甲基(cm)官能化
按下面概述的方案衍生化纳米纤维材料：
步骤(i)：乙酸纤维素(ca)皂化为再生纤维素(rc)
将根据制备实施例1的方法获得的乙酸纤维素片材(0.44×32mm×150mm)置于含有5l0.075m氢氧化钠溶液(在2:1的水:乙醇中)的大烧杯中。反应混合物于室温下搅拌48小时。然后根据洗涤方案a洗涤材料。
步骤(ii)：缩水甘油聚合
将来自(i)的材料悬浮在1l0.5mnaoh中。让反应介质循环15分钟，然后小心地一次性加入不同量的缩水甘油(15ml、30ml、60ml、120ml、180ml)。反应介质在室温下循环16小时，随后根据洗涤方案b洗涤材料。
步骤(iii)：羧甲基(cm)衍生化
将来自(ii)的材料悬浮在62℃的水(66ml)中。新鲜制备氯乙酸钠(12.8g)在水(27.5ml)中的溶液。还新鲜制备koh(6.2g)在水(27.5ml)中的溶液。将两种溶液以13.75ml/小时的速率加到反应中，同时将温度保持在62℃。于62℃下剧烈搅拌反应物，总共搅拌4小时。在62℃下4小时后，除去反应介质并在连续的水流下洗涤纳米纤维材料直至流出物的ph为中性。然后将烧杯在0.01m盐酸水溶液中搅拌直至达到2-3的稳定ph。
参考实施例1-atrp官能化以提供二甲基氨基衍生化纳米纤维材料
按下面概述的方案衍生化纳米纤维材料：
步骤(i)：乙酸纤维素(ca)皂化为再生纤维素(rc)
将根据制备实施例1的方法获得的乙酸纤维素片材(0.44×32mm×150mm)置于含有5l0.075m氢氧化钠溶液(在2:1的水:乙醇中)的大烧杯中。反应混合物于室温下搅拌48小时。然后根据洗涤方案a洗涤材料。
步骤(ii)：二乙烯基砜衍生化
将步骤(i)中获得的材料悬浮在k2co3溶液(24.4g,176.54mmolk2co3在275mlh2o中))和乙腈(75ml)中。将混合物搅拌15分钟，然后逐滴加入二乙烯基砜(50ml，498.1mmol)，2.5小时加完。加完二乙烯基砜后，将反应物再搅拌1.5小时。其后，根据洗涤方案c洗涤纳米纤维材料。
步骤(iii)
将步骤(ii)中获得的材料悬浮在含有乙二胺(125ml,1870mmol)或2-巯基乙胺盐酸盐(37.5g,167mmol)的375mlh2o中。混合物于室温下搅拌过夜。其后，根据洗涤方案a洗涤衍生化的纳米纤维材料。
步骤(iv)：α-溴代异丁酰溴化物衍生化：
将步骤(iii)中获得的干燥材料置于离心管中并加入2ml乙腈和0.4ml(3.24mmol)α-溴代异丁酰溴。将管在轨道振荡器上于室温下温和搅动5分钟，随后逐滴加入三乙胺(0.4ml，2.86mmol)。将反应混合物搅动1小时。其后，根据洗涤方案a洗涤衍生化的纳米纤维材料。
步骤(v)：atrp
通常，将步骤(iv)中获得的衍生化纳米纤维材料置于反应容器中，向其中加入2.5ml饱和抗坏血酸、0.33ml催化剂溶液a和n-[3-(二甲基氨基)丙基]甲基丙烯酰胺(1.66ml，9.2mmol)。将反应混合物在轨道振荡器上于室温下温和搅动4小时。其后，根据洗涤方案a洗涤衍生化的纳米纤维材料。
催化剂溶液a
cubr2(0.3g，1.343mmol)溶解在10mlh2o和0.45ml(1.650mmol)1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺中。
实施例4-缩水甘油接枝、醛官能化、蛋白a偶联的材料
按下面概述的方案衍生化纳米纤维材料：
步骤(i)：乙酸纤维素(ca)皂化为再生纤维素(rc)
将根据制备实施例1的方法获得的乙酸纤维素片材(0.44×32mm×150mm)置于含有5l0.075m氢氧化钠溶液(在2:1的水:乙醇中)的大烧杯中。反应混合物于室温下搅拌48小时。然后根据洗涤方案a洗涤材料。
步骤(ii)：缩水甘油聚合
将来自(i)的材料悬浮在1l0.5mnaoh中。让反应介质循环15分钟，然后小心地一次性加入180ml缩水甘油。反应介质在室温下循环16小时，随后根据洗涤方案b洗涤材料。
步骤(iii)：氧化成醛
将来自(ii)的材料悬浮在17.5l调节至ph5.5的0.05mnaoac缓冲液中。让反应介质循环30分钟，然后加入naio4(200g，0.94摩尔，溶解在2l反应介质中)。让反应介质再循环30分钟。然后根据洗涤方案c洗涤材料以提供醛官能化材料。
步骤(iv)：蛋白a偶联
将来自步骤(iii)的材料加到6孔板中。向每个孔中加入2ml蛋白-a溶液(rspa，50mg/ml的蛋白a/去离子水)。将板在轨道振荡器上温和搅动1小时。其后，除去上清液并替换成还原性缓冲溶液a(每孔2.5ml，以向10ml碳酸盐缓冲液中加入0.0762gnacnbh3来制备，碳酸盐缓冲液以向100ml去离子水中加入0.0603gna2co3(0.569mmol)和0.337gnahco3(4.012mmol)来制备)并再搅动15分钟。其后，根据方案d洗涤蛋白-a偶联材料。
实施例5-缩水甘油接枝、dvs官能化、蛋白a偶联的材料
按下面概述的方案衍生化纳米纤维材料：
步骤(i)：乙酸纤维素(ca)皂化为再生纤维素(rc)
将根据制备实施例1的方法获得的乙酸纤维素片材(0.44×32mm×150mm)置于含有5l0.075m氢氧化钠溶液(在2:1的水:乙醇中)的大烧杯中。反应混合物于室温下搅拌48小时。然后根据洗涤方案a洗涤材料。
步骤(ii)：缩水甘油聚合
将来自(i)的材料悬浮在1l1mnaoh中。让反应介质循环15分钟，然后一次性加入180ml缩水甘油。反应介质在室温下循环16小时，随后根据洗涤方案b洗涤材料。
步骤(iii)：二乙烯基砜衍生化
将来自(ii)的材料悬浮在由其中溶解了k2co3(48.8g，0.35mol)的550mlh2o和150ml乙腈组成的溶液中。让反应介质循环15分钟，然后逐滴加入二乙烯基砜(100ml，0.86mol)，其后让反应介质再循环1.5小时。然后根据洗涤方案c洗涤材料。
步骤(iv)：蛋白-a偶联：
将来自步骤(iii)的材料悬浮在70ml蛋白a溶液(50mg/ml蛋白a悬浮液，其中加入了668mg(na2co3)和58mgnahco3及naoh以达到ph11.1)中。让溶液循环16小时。然后根据洗涤方案d洗涤材料。
参考实施例2-atrp接枝、蛋白a偶联的材料
按下面概述的方案衍生化纳米纤维材料：
步骤(i)：乙酸纤维素(ca)皂化为再生纤维素(rc)
将乙酸纤维素片材(5×65cm×100cm)悬浮在17.5l0.075mnaoh(在2:1的h2o:etoh)中。反应介质于室温下循环48小时。然后根据洗涤方案a洗涤材料。
步骤(ii)：α-溴乙酰化
将来自(i)的干燥材料悬浮在其中溶解了α-溴代异丁酰溴(6.24ml，50.4mmol)的240ml四氢呋喃(thf)中。将反应混合物冷却至0℃，然后逐滴加入三乙胺(7.2ml，51.6mmol)。混合物于0℃下搅拌2小时，然后温热至室温。混合物于室温下再搅拌16小时。其后，根据洗涤方案a洗涤衍生化的纳米纤维材料。
步骤(iii)：atrp聚合
向容器中加入5ml丙酮、5ml饱和抗坏血酸、cubr2(30mg，0.134mmol)和1,1,4,7,10,10-六甲基三亚乙基四胺(45μl，0.165mmol)。将来自(ii)的材料与二乙烯基砜(2.5ml，24.9mmol)一起悬浮在反应混合物中。使用轨道振荡器于室温下温和搅动反应混合物，持续1小时。其后，根据洗涤方案a洗涤纳米纤维材料。
步骤(iv)：蛋白-a衍生化
将来自步骤(iii)的材料的26mm圆盘置于6孔板中。向每个圆盘加入1ml蛋白-a溶液(如上文所限定的50mg/ml溶液)以及1ml碳酸盐缓冲溶液(如上文所限定)。将圆盘温和搅动16小时。其后，使用洗涤方案d洗涤圆盘。
参考实施例3-三甲基氯化铵官能化
按下面概述的方案衍生化纳米纤维材料：
步骤(i)：乙酸纤维素(ca)皂化为再生纤维素(rc)
将根据制备实施例1的方法获得的乙酸纤维素片材(0.44×32mm×150mm)置于含有5l0.075m氢氧化钠溶液(在2:1的水:乙醇中)的大烧杯中。反应混合物于室温下循环48小时。然后根据洗涤方案a洗涤材料。
步骤(ii)：缩水甘油基三甲基氯化铵衍生化
将自步骤(i)获得的材料悬浮在1l0.5mnaoh中。让反应介质循环15分钟，然后一次性加入缩水甘油基三甲基氯化铵(25ml、50ml、100ml)。反应介质在室温下再循环16小时。然后根据洗涤方案b洗涤材料。
通过以下方法测定该三甲基氯化铵含量。在布氏过滤漏斗上用100ml0.1mhcl溶液洗涤50mg材料，然后再用100ml0.01mhcl溶液洗涤。然后将材料置于75℃的干燥烘箱中并干燥至恒重，然后撕成小块并然后置于50ml离心管中。然后加入小磁力搅拌棒和15ml去离子水及大约1ml(通过橡皮头移液管加入)铬酸钾溶液，其使混合物颜色变黄。将混合物剧烈搅拌20分钟，然后用0.1m硝酸银滴定。滴定的终点通过颜色从澄清的黄色变为雾浊的棕色来识别。以加入以达到终点的硝酸银的微摩尔数/滴定中使用的纳米纤维材料的克数计算该三甲基氯化铵含量(μmol/g)。
参考实施例4-缩水甘油接枝
步骤(i)：乙酸纤维素(ca)皂化为再生纤维素(rc)
将根据制备实施例1的方法获得的乙酸纤维素片材(0.44×32mm×150mm)置于含有5l0.075m氢氧化钠溶液(在2:1的水:乙醇中)的大烧杯中。反应混合物于室温下搅拌48小时。然后根据洗涤方案a洗涤材料。
步骤(ii)：缩水甘油聚合
将来自(i)的材料悬浮在1l0.5mnaoh中。让反应介质循环15分钟，然后小心地一次性加入不同量的缩水甘油(15ml、30ml、60ml、120ml、180ml)。反应介质在室温下循环16小时，随后根据洗涤方案g洗涤材料。
实施例6-缩水甘油接枝、dvs官能化、蛋白a偶联的材料的替代方案
按下面概述的方案衍生化纳米纤维材料：
步骤(i)：缩水甘油聚合和皂化
通过取ca纳米纤维材料(0.11×80×50mm)并将其悬浮在1l去离子水中来实现ca纳米纤维材料的缩水甘油聚合和皂化。让溶剂循环3小时，然后再重新加入1l去离子水。重复此过程4次后，将纳米纤维材料悬浮在350ml1mkoh中。让反应介质循环60分钟，然后小心地加入不同量的缩水甘油(100ml)，其中一次性加入25%的缩水甘油，剩余部分逐滴加入，90分钟加完。反应介质在室温下循环4小时，随后根据洗涤方案b洗涤材料。
步骤(ii)：二乙烯基砜衍生化
将来自(i)的材料悬浮在由其中溶解了k2co3(48.8g，0.35摩尔)的550mlh2o和150ml乙腈组成的溶液中。让反应介质循环15分钟，然后逐滴加入二乙烯基砜(100ml，0.86摩尔)，其后让反应介质再循环1.5小时。然后根据洗涤方案c洗涤材料。
步骤(iii)：蛋白-a偶联：
将来自步骤(ii)的材料悬浮在70ml蛋白a溶液(50mg/ml蛋白a悬浮液，其中加入了668mg(na2co3)和58mgnahco3及naoh以达到ph11.1)中。让溶液循环16小时。然后根据洗涤方案d洗涤材料。
实施例7-卤代醇形成和衍生化
按下面概述的方案衍生化纳米纤维材料：
步骤(i)：乙酸纤维素(ca)皂化为再生纤维素(rc)
将根据制备实施例1的方法获得的乙酸纤维素片材(0.11×80×50mm)置于含有5l0.075m氢氧化钠溶液(在2:1的水:乙醇中)的大烧杯中。反应混合物于室温下搅拌48小时。然后根据洗涤方案a洗涤材料。
步骤(ii)：缩水甘油聚合
将来自(i)的材料悬浮在350ml1mkoh中。让反应介质循环60分钟，然后小心地加入不同量的缩水甘油(60ml)，其中一次性加入25%的缩水甘油，剩余部分逐滴加入，90分钟加完。反应介质在室温下循环4小时，随后根据洗涤方案b洗涤材料。
步骤(iii)烯丙基缩水甘油基醚衍生化
将来自(ii)的材料悬浮在1l1mkoh中。加入不同量的烯丙基缩水甘油基醚(20、30、40、50、60、70、80、90、100ml)，做法是先加入25%的烯丙基缩水甘油基醚，然后逐滴加入剩余部分，90分钟加完。在室温下搅拌4小时维持反应。其后，根据洗涤方案b洗涤材料。
步骤(iv)：卤代醇形成
将来自(iii)的材料悬浮在其中溶解了25gn-溴代琥珀酰亚胺的1l3:1的h2o:mecn中。使反应介质通过材料循环4小时。其后，除去反应介质并根据洗涤方案h洗涤剩余材料。
步骤(v)：蛋白固定化
将来自步骤(iv)的单条材料放置在聚乙烯小袋中。然后向该小袋中加入25ml蛋白a溶液(50mg/ml蛋白a悬浮液，其中加入了668mgna2co3和58mgnahco3及naoh以达到ph11.1。密封小袋，并将所得混合物在轨道振荡器上缓慢搅动16小时。其后，从袋中取出衍生化的材料并根据洗涤方案h洗涤。
实施例8-替代的卤代醇形成和衍生化
按下面概述的方案衍生化纳米纤维材料：
步骤(i)：缩水甘油聚合和皂化
通过取ca纳米纤维材料(6×120mm×90mm)并将其悬浮在1l去离子水中来实现ca纳米纤维材料的缩水甘油聚合和皂化。让溶剂循环3小时，然后再重新加入1l去离子水。重复此过程4次后，将纳米纤维材料悬浮在350ml1mkoh中。让反应介质循环5分钟，然后小心地加入100ml缩水甘油，其中一次性加入25%的缩水甘油，剩余部分逐滴加入，90分钟加完。反应介质在室温下循环4小时，随后根据洗涤方案b洗涤材料。
步骤(ii)烯丙基缩水甘油基醚衍生化
将来自(i)的材料悬浮在350l1mkoh中。加入不同量的烯丙基缩水甘油基醚(20、30、40、50、60、70、80、90、100ml)，做法是先加入25%的烯丙基缩水甘油基醚，然后逐滴加入剩余部分，90分钟加完。在室温下搅拌6小时维持反应。其后，根据洗涤方案b洗涤材料。
使用较少量的烯丙基缩水甘油基醚产生了具有特别有利的流动特性的材料。使用较高量的烯丙基缩水甘油基醚产生了具有较高结合容量的材料。
步骤(iii)：卤代醇形成
将来自(ii)的材料悬浮在其中溶解了25gn-溴代琥珀酰亚胺的1l3:1的h2o:mecn中。使反应介质通过材料循环4小时。其后，除去反应介质并根据洗涤方案h洗涤剩余材料。
步骤(iv)：蛋白固定化
将来自步骤(iii)的单条材料放置在聚乙烯小袋中。然后向该小袋中加入25ml蛋白a溶液(50mg/ml蛋白a悬浮液，其中加入了668mgna2co3和58mgnahco3及1mnaoh(以达到ph11.1)。密封小袋，并将所得混合物在轨道振荡器上缓慢搅动16小时。其后，从袋中取出衍生化的材料并根据洗涤方案h洗涤。
ii分析方法
实施例9-动态结合容量的测定
使装载材料通过äktapure系统(gehealthcare)上贮器内所含的选定官能化纳米纤维圆盘。在确定的每分钟膜体积流速(mv/min)下装载材料直至贮器出口后的浓度超过装载量的10%，如由uv流量池所测定。考虑到系统和贮器设备中的死体积，通过在unicorn软件(gehealthcare)中分析色谱图来确定10%穿透下装载到圆盘上的蛋白的总量。对于阴离子交换材料，装载材料为1mg/ml的bsa/10mmtris(ph8)。对于阳离子交换材料，装载材料为1mg/ml的溶菌酶/乙酸钠ph4.7mm。
实施例10-流动阻力的测定
使用äktapure系统(gehealthcare)测定选定官能化纳米纤维材料上的压降(∆p)。使10mmtris(ph8)的缓冲液通过贮器内所含的官能化纳米纤维圆盘。记录δ柱压力(δp)等于0.5mpa的流速。
iii具体材料的分析和比较
实施例11-根据本发明增加单独的接枝步骤后，电荷密度与三甲基铵官能化之间的关系
按参考实施例3制造和测试材料以产生三甲基铵官能而使材料能够作为阴离子交换剂。将它们与根据实施例1制备和测定的本发明接枝材料进行比较。对三甲基铵官能化材料获得的电荷密度示于图4中。图4中每个数据点的平均值绘制在图5中。从图4和图5清楚可见，当使用设定量的官能化试剂gmac时，增加接枝量不会显著影响电荷密度。
参考实施例5-电荷密度与三甲基铵官能化之间的关系
按参考实施例3制造和测试材料以产生三甲基铵官能而使材料能够作为阴离子交换剂。结果示于图2中。从图2可以看出，在没有接枝步骤的情况下，增加官能化剂(缩水甘油基三甲基氯化铵)的量会增加电荷密度。
实施例12-根据本发明增加单独的接枝步骤后，动态结合容量(dbc)与三甲基铵官能化之间的关系
使用实施例9中的方法确定实施例11中测定的相同材料的动态结合容量(dbc)。按实施例1制造的本发明材料的dbc图示于图6中。图7中比较了这些材料的dbc与未经历本发明的两步接枝过程的材料(即参考实施例3的材料)的dbc。可以看出，根据本发明产生的接枝材料的结合容量比未使用接枝的材料的结合容量高4倍以上。与参考实施例6(下文)中看到的非接枝材料的情况相反，很显然，对于接枝材料，当电荷密度保持恒定时，增加接枝量引起材料结合容量的增大。
参考实施例6-对于三甲基氯化铵材料，电荷密度与动态结合容量(dbc)之间的关系
按参考实施例3制造和测试材料以产生三甲基铵官能而使材料能够作为阴离子交换剂。这些材料的动态结合容量按实施例9测定。结果示于图3中。如本领域技术人员所预期，从图3可以看出，在没有接枝步骤的情况下，增加官能化剂缩水甘油基三甲基氯化铵的量会增大结合容量。
实施例13-根据本发明增加单独的接枝步骤后，电荷密度与磺酸(s)官能化之间的关系
赋予本发明的材料s官能以使材料能够作为阳离子交换材料起作用并按实施例2进行测定。如实施例2中所述测定材料的磺酸含量。结果示于图8中。可以观察到，接枝步骤而不是官能化步骤对材料的电荷密度具有更大影响。
实施例14-根据本发明增加单独的接枝步骤后，动态结合容量(dbc)与磺酸(s)官能化之间的关系
使用实施例9中的方法确定按实施例2制造的材料的动态结合容量(dbc)。结果示于图9中。从图9可以看出，如实施例13中所见，在接枝步骤和官能化步骤之间也存在相依性。根据本发明产生的这些材料在160倍膜体积(mv)/min的流速下产生47和207mg/ml之间的结合容量。
实施例15-根据本发明增加单独的接枝步骤后，动态结合容量(dbc)与羧甲基(cm)官能化之间的关系
按实施例3赋予本发明的材料羧甲基(cm)官能以使材料能够作为阳离子交换材料起作用。使用实施例9中的方法确定与本发明有关的这些材料的动态结合容量(dbc)。结果示于图10中。从图10可以看出，根据本发明制造的材料在160mv/min的流速下可达到20至149mg/ml之间的结合容量。
参考实施例7-使用atrp接枝的二甲基氨基衍生化材料的结合容量
按参考实施例1赋予根据本发明的材料二甲基氨基官能以使材料能够作为阴离子交换膜起作用。使用实施例9中的方法确定本发明的这些材料的动态结合容量(dbc)。
实施例16-在设定的电荷密度下聚合物接枝程度和流动阻力之间的关系
使用实施例10的方法确定实施例11中测定的相同材料的流动阻力。该测定的结果示于图11中。这表明在电荷官能化材料的聚合物接枝程度与流动阻力之间存在明显的关系。还可看出电荷密度与流动阻力之间的明显关系。
参考实施例8-接枝后oh密度的测定
取出根据参考实施例4产生的材料样品并用大量水(使用布氏漏斗)洗涤，然后干燥至恒重。然后将样品称重并撕碎置于50ml离心管中。向管中加入恰好10ml对甲苯磺酰异氰酸酯(20ml对甲苯磺酰异氰酸酯在500ml乙腈中)。向离心管中加入小搅拌棒，然后将其密封，置于60℃的水浴中并搅拌60分钟。其后，用20mlh2o稀释样品并再搅拌10分钟。然后加入40ml异丙醇，将样品再搅拌10分钟，然后在自动滴定器上使用0.481mbu4noh滴定(使用方法caoh滴定)。在滴定曲线中观察到两个拐点。第一个发生在大约ph5.5(vep1)处，第二个发生在大约ph9.5(vep2)处。由此计算样品中存在的游离oh的量：
ohv=((vep2-vep1*f*c(tbah)*ma))/ms
ohv：样品的羟值(koh/g样品)
vep1：直至第一等当点的滴定剂消耗量(ml)
vep2：直至第二等当点的滴定剂消耗量(ml)
c(tboah)：四丁基氯化铵的浓度(mol/l)
f：校正系数(滴定度)，无单位
ma：koh的分子量；这里为56.11g/mol
ms：样品量(g)
根据参考实施例5产生的材料的分析表明，对于该特定的基材和接枝方法，改变缩水甘油试剂的量会产生-oh基团密度高达6000μmol/g的材料。这在图13中示出。
参考实施例9-增加聚合物接枝对不荷电材料的流动阻力的影响
按参考实施例4用不同量的缩水甘油处理材料，并使用实施例10中所述的测定方法测量每种材料(和未接枝的rc材料)的流动阻力。结果示于图12中。从图12可以看出，对于具有不同接枝程度的不荷电材料，关于流动，压降没有可察觉的增加。因此可以得出结论，随着接枝程度增加，材料中没有可察觉的孔堵塞。可以清楚地观察到，一旦材料用带电基团官能化，就可如实施例16(上文)和图11中所报道看到接枝量与流动阻力之间的关系。
实施例17-本发明材料的生产率
测定若干本发明材料的容量(dbc)和生产率值。所得结果列于表1中。
表1：本发明要求保护的材料的容量和生产率
实施例18–通过毛细流动分析测量孔隙大小
使用的设备是poroluxtm100测孔仪(ib-ftgmbh,berlin,germany)，并且方法如表2中提供。关于测量原理的进一步的细节可见于制造商的网站http://www.ib-ft.com/measurement_principle.html。从测量获得的三个孔隙大小是最小孔隙大小、平均流动孔隙(mfp)大小和泡点孔隙大小(最大孔隙大小)。
表2：毛细流动测孔术
来自毛细流动测孔术的结果以及来自sem图像的平均纳米纤维直径的估计显示在表3中。来自图像分析软件的sem图像和纤维直径直方图显示在图17-19中。可以看出，在缩水甘油q和缩水甘油dvs蛋白a样品中存在接枝聚合物不影响纤维网络的总体结构，即接枝涂层具有保形性质，并且非常薄。如果引入过度大量的接枝聚合物，聚合物材料可能在纳米纤维之间形成，负面影响材料的流速性能。
表3：孔隙大小和纳米纤维直径
实施例19–缓冲液电导率对流动阻力的影响
以固定的0.4s停留时间或基于0.2ml的膜的流速30ml/min，测量缓冲液ph和电导率对dvs-蛋白a官能化纳米纤维材料的跨膜压力的影响。向20mm乙酸盐缓冲液ph5.0和20mmtris缓冲液ph8.0中加入0-1mnacl以得到1.7–83ms/cm的缓冲液电导率(在22°c下)，并将不同的缓冲液用于背压测定，结果显示在图16中。结果一式三份来自在peek外壳中的3个不同的0.2ml膜床，并绘出误差棒。在不同的工作日测试20mmtris,ph8.0,15.5ms/cm缓冲液系统，这可解释略微升高的跨膜压力。除了该略微的偏离，在不同的缓冲液之间没有见到显著的背压差异。
对比实施例1
从制造商处获得各种市售多孔珠粒材料的结合容量、停留时间和生产率值。所得结果列于表4中。
表4：多孔珠粒容量和生产率的实例
对比实施例2
测定a)captoq和牛血清白蛋白(bsa)和b)qsepharosefastflow9的动态结合容量-停留时间函数。所得结果在图1中呈现。这显示，在这些大规模的多孔珠粒柱子中低于2分钟的停留时间是不可能的。
对比实施例3
从制造商的数据确定各种市售膜和整料材料的结合容量、停留时间和生产率值。所得结果列于表5中。
表5：膜和整料容量及生产率的实例
本发明的其他通用方面
1.一种制备官能化聚合物色谱介质的方法，所述方法包括
(i)提供由一个或多个聚合物纳米纤维形成的基材，
(ii)从基材接枝一个或多个中性聚合物链，和
(iii)使接枝产物与试剂接触，所述试剂通过向接枝产物上引入一个或多个带电基团而使步骤(ii)的产物官能化为色谱介质。
2.根据方面1的方法，其中在步骤(ii)中引入的聚合物的量为500-60,000μmol/g接枝产物之间。
3.根据方面1或2的方法，其中步骤(iii)的产物的电荷密度为100-2,000μmol/g色谱介质之间。
4.根据前述方面中任一项的方法，其中当液相以每分钟1至640倍膜体积的流速通过厚度为0.05至10mm的官能化聚合物色谱介质时，介质上的压降小于2mpa。
5.根据前述方面中任一项的方法，其中所述官能化聚合物色谱介质的生产率为50mg/ml/min至75,000mg/ml/min。
6.根据前述方面中任一项的方法，其中所述官能化聚合物色谱介质的生产率高于200mg/ml/min。
7.根据前述方面中任一项的方法，其中接枝步骤(ii)具有增大官能化聚合物色谱介质的动态结合容量(dbc)的作用。
8.根据前述方面中任一项的方法，其中从基材接枝一个或多个中性聚合物链包括从基材上存在的一个或多个官能团生长一个或多个聚合物链，任选地在一种或多种催化剂的存在下。
9.根据方面8的方法，其中在步骤(i)和(ii)之间处理基材以引入所述一个或多个官能团，或者在步骤(i)和(ii)之间处理基材以使基材上的任何官能团脱保护或活化，或者在步骤(i)和(ii)之间处理基材以增加基材上官能团的数量/密度。
10.根据方面8或9的方法，其中所述官能团为羟基、氨基或羧酸基团。
11.根据方面8至10中任一项的方法，其中生长一个或多个聚合物链包括从基材上存在的一个或多个官能团聚合多个单体，任选地在一种或多种催化剂的存在下。
12.根据方面8至11中任一项的方法，其中所述聚合物链中的一个或多个是支化的。
13.根据方面8至12中任一项的方法，其中生长聚合物链包括从基材上存在的一个或多个官能团聚合缩水甘油。
14.根据前述方面中任一项的方法，其中所述一个或多个聚合物链为一个或多个聚甘油链。
15.根据前述方面中任一项的方法，其中步骤(ii)包括使多个式
16.根据前述方面中任一项的方法，其中在步骤(iii)中，所述试剂将接枝产物官能化使得所得官能化色谱介质适于用在阴离子交换色谱方法中。
17.根据方面16的方法，其中
-色谱方法为阳离子交换法，所述试剂用一个或多个带电基团官能化色谱介质，所述带电基团包括一个或多个羧酸根、磺酸根或膦酸根部分；或者
-所述色谱方法为阴离子交换法，所述试剂用一个或多个带电基团官能化色谱介质，所述带电基团包括一个或多个季氨基或二乙胺部分。
18.根据前述方面中任一项的方法，其中所述基材呈膜的形式。
19.根据前述方面中任一项的方法，其中所述聚合物选自纤维素、乙酸纤维素、聚砜、聚酰胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯腈、聚苯乙烯、聚环氧乙烷及其混合物。
20.根据前述方面中任一项的方法，其中所述纳米纤维具有10nm至1000nm的平均直径。
21.根据前述方面中任一项的方法，所述方法包括
(i)提供由一个或多个纤维素纳米纤维形成的基材，
(ii)通过使多个式
(iii)使接枝产物与试剂接触，所述试剂将步骤(ii)的产物官能化为适于用在离子交换色谱方法中的色谱介质。
22.一种可通过根据前述方面中任一项的方法获得的官能化色谱介质。
23.一种制备色谱柱的方法，所述方法包括进行方面1至21中任一项的方法并向柱中引入由此获得的产物。
24.一种色谱柱，其(a)可通过方面23的方法获得，或(b)其包含一种或多种根据方面22的官能化色谱介质。
25.根据方面22的官能化色谱介质或根据方面24的色谱柱在色谱法中的用途。
26.一种从流动相分离一种或多种生物分子的方法，所述方法包括使流动相中的一种或多种生物分子与根据方面22的官能化色谱介质或根据方面24的色谱柱接触。
27.根据方面26的方法，其中使流动相中的所述一种或多种生物分子与官能化色谱介质接触一分钟或更短的时间段。
28.一种制备官能化聚合物色谱介质的方法，所述方法包括
(i)提供由一个或多个聚合物纳米纤维形成的基材，
(ii)从所述基材接枝一个或多个中性聚合物链，和
(iii)使接枝产物与试剂接触，所述试剂将步骤(ii)的产物官能化为色谱介质。
29.根据方面28的方法，其中在步骤(ii)中引入的聚合物的量在500-60,000μmol/g接枝产物之间。
30.根据方面28或29的方法，其中使接枝产物与试剂接触的步骤向接枝产物中引入一个或多个配体基团，这使得包含所述一个或多个配体基团的官能化产物适合用作色谱介质。
31.根据方面30的方法，其中在步骤(iii)的产物中所述配体基团的密度在100-2,500μmol/g色谱介质之间。
32.根据方面28至31中任一项的方法，其中当液相以每分钟1至640倍膜体积的流速通过厚度为0.05至10mm的官能化聚合物色谱介质时，介质上的压降小于2mpa。
33.根据方面28至32中任一项的方法，其中所述官能化聚合物色谱介质的生产率为50mg/ml/min至75,000mg/ml/min。
34.根据方面28至33中任一项的方法，其中所述官能化聚合物色谱介质的生产率高于200mg/ml/min。
35.根据方面28至34中任一项的方法，其中接枝步骤(ii)具有增大官能化聚合物色谱介质的动态结合容量(dbc)的作用。
36.根据方面28至35中任一项的方法，其中从基材接枝一个或多个中性聚合物链包括从基材上存在的一个或多个官能团生长一个或多个聚合物链，任选地在一种或多种催化剂的存在下。
37.根据方面36的方法，其中在步骤(i)和(ii)之间处理基材以引入所述一个或多个官能团，或者在步骤(i)和(ii)之间处理基材以使基材上的任何官能团脱保护或活化，或者在步骤(i)和(ii)之间处理基材以增加基材上官能团的数量/密度。
38.根据方面36或37的方法，其中所述官能团为羟基、氨基或羧酸基团。
39.根据方面36至38中任一项的方法，其中生长一个或多个聚合物链包括从基材上存在的一个或多个官能团聚合多个单体，任选地在一种或多种催化剂的存在下。
40.根据方面36至39中任一项的方法，其中所述聚合物链中的一个或多个是支化的。
41.根据方面36至40中任一项的方法，其中生长聚合物链包括从基材上存在的一个或多个官能团聚合缩水甘油。
42.根据方面28至41中任一项的方法，其中所述一个或多个聚合物链为一个或多个聚甘油链。
43.根据方面28至42中任一项的方法，其中步骤(ii)包括使多个式
44.根据方面28至43中任一项的方法，其中在步骤(iii)中，所述试剂将接枝产物官能化使得所得官能化色谱介质适于用在选自离子交换、亲和捕获、疏水相互作用和混合模式方法的色谱方法中。
45.根据方面44的方法，其中
-所述色谱方法为阳离子交换法，所述试剂用一个或多个带电基团官能化所述色谱介质，所述带电基团包括一个或多个羧酸根、磺酸根或膦酸根部分；
-所述色谱方法为阴离子交换法，所述试剂用一个或多个带电基团官能化所述色谱介质，所述带电基团包括一个或多个季氨基或二乙胺部分；
-所述色谱方法为亲和捕获色谱法，所述试剂用一种或多种蛋白、肽、抗体或其片段、染料、组氨酸基团或含有金属阳离子的基团官能化所述色谱介质；
-所述色谱方法为疏水相互作用色谱法，所述试剂用一个或多个丙基、丁基、苯基或辛基官能化所述色谱介质；或
-所述色谱方法为混合模式色谱法，所述试剂用一个或多个mep、辛胺、n-苄基甲基乙醇胺或n-苯甲酰-高半胱氨酸基团官能化所述色谱介质。
46.根据方面28至45中任一项的方法，其中在步骤(iii)中，所述试剂用一种或多种蛋白a分子官能化接枝产物。
47.根据方面28至46中任一项的方法，其中所述基材呈膜的形式。
48.根据方面28至47中任一项的方法，其中所述聚合物选自纤维素、乙酸纤维素、聚砜、聚酰胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯腈、聚苯乙烯、聚环氧乙烷及其混合物。
49.根据方面28至48中任一项的方法，其中所述纳米纤维具有10nm至1000nm的平均直径。
50.根据方面28至49中任一项的方法，所述方法包括
(i)提供由一个或多个纤维素纳米纤维形成的基材，
(ii)通过使多个式
(iii)使接枝产物与试剂接触，所述试剂将步骤(ii)的产物官能化为适于用在选自离子交换、亲和捕获、疏水相互作用和混合模式方法的色谱方法中的色谱介质。
51.一种可通过根据方面28至50中任一项的方法获得的官能化色谱介质。
52.一种制备色谱柱的方法，所述方法包括进行方面28至50中任一项的方法并向柱中引入由此获得的产物。
53.一种色谱柱，其(a)可通过方面52的方法获得，或(b)其包含一种或多种根据方面51的官能化色谱介质。
54.根据方面51的官能化色谱介质或根据方面53的色谱柱在色谱法中的用途。
55.一种从流动相分离一种或多种生物分子的方法，所述方法包括使流动相中的一种或多种生物分子与根据方面51的官能化色谱介质或根据方面53的色谱柱接触。
56.根据方面55的方法，其中使流动相中的所述一种或多种生物分子与官能化色谱介质接触一分钟或更短的时间段。
57.根据方面55或方面56的方法，其中所述一种或多种生物分子为一种或多种单克隆抗体，或经工程改造以呈现对蛋白a结合具有亲和力的位点的蛋白，并且所述官能化色谱介质携带至少一个蛋白a配体基团。
58.根据方面28至50中任一项的方法，其中所述方法的步骤(iii)包括使接枝产物与烯丙基缩水甘油基醚和卤代醇形成试剂接触。
59.根据方面28至50中任一项的方法，其中在步骤(iii)中：
(a)使接枝产物与烯丙基缩水甘油基醚接触；
(b)用卤代醇形成试剂处理步骤(a)的产物；和
(c)使步骤(b)的产物与蛋白a接触。
60.根据方面28至50中任一项的方法，其中步骤(iii)包括使接枝产物与多种试剂接触，其一起将步骤(ii)的产物官能化为色谱介质，并且其中所述多种试剂包括卤代醇形成试剂。
61.根据方面60的方法，其中使接枝产物与所述多种试剂依次接触。
62.一种制备官能化聚合物色谱介质的方法，所述方法包括
(i)提供由一个或多个聚合物纳米纤维形成的基材，
(ii)从基材接枝一个或多个中性聚合物链，和
(iii)使接枝产物与试剂接触，所述试剂将步骤(ii)的产物官能化为色谱介质，
其中步骤(ii)包括使多个式
与纳米纤维基材上存在的一个或多个官能团反应，
其中r1、r2、r3、r4和r5可相同或不同，并选自h、卤素、c1-c4烷基或c1-c4烷氧基，前提条件是r1、r2、r3、r4或r5中的至少一个不为氢。
63.根据方面62所述的方法，其中步骤(ii)包括使多个式
64.根据方面62或方面63所述的方法，其中所述聚合物纳米纤维包含选自以下的聚合物：纤维素、乙酸纤维素、聚砜、聚酰胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯腈、聚苯乙烯、聚环氧乙烷及其混合物，优选地其中所述聚合物选自纤维素、乙酸纤维素及其混合物。
65.根据方面62至64中任一项所述的方法，其中在步骤(ii)中引入的聚合物的量在500-60,000μmol/g接枝产物之间。
66.根据方面62至65中任一项所述的方法，其中使所述接枝产物与试剂接触的步骤向所述接枝产物中引入一个或多个配体基团，这使得包含所述一个或多个配体基团的所述官能化产物适合用作色谱介质。
67.根据方面66所述的方法，其中在步骤(iii)的产物中所述配体基团的密度在100-2,500μmol/g色谱介质之间。
68.根据方面62至67中任一项所述的方法，其中当液相以每分钟1至640倍膜体积的流速通过厚度为0.05至10mm的官能化聚合物色谱介质时，所述介质上的压降小于2mpa。
69.根据方面62至68中任一项所述的方法，其中所述官能化聚合物色谱介质的生产率为50mg/ml/min至75,000mg/ml/min。
70.根据方面62至69中任一项所述的方法，其中所述官能化聚合物色谱介质的生产率高于200mg/ml/min。
71.根据方面62至70中任一项所述的方法，其中所述接枝步骤(ii)具有增大所述官能化聚合物色谱介质的动态结合容量(dbc)的作用。
72.根据方面62至71中任一项所述的方法，其中在步骤(i)和(ii)之间处理基材以引入所述一个或多个官能团，或者在步骤(i)和(ii)之间处理基材以使基材上的任何官能团脱保护或活化，或者在步骤(i)和(ii)之间处理基材以增加基材上官能团的数量/密度。
73.根据方面62至71中任一项所述的方法，其中所述接枝步骤(ii)在这样的条件下进行：在同一步骤中还引入所述一个或多个官能团，或使基材上的任何官能团脱保护或活化，或增加基材上官能团的数量/密度。
74.根据方面73所述的方法，其中所述接枝步骤(ii)在碱性水溶液的存在下实现，所述碱性水溶液优选naoh或koh在水或水:乙醇中、优选在水中的溶液。
75.根据方面62至74中任一项所述的方法，其中所述纳米纤维基材上存在的所述一个或多个官能团包含羟基。
76.根据方面62至75中任一项所述的方法，其中在官能化步骤(iii)中，所述官能化试剂选自缩水甘油基三甲基氯化铵(gmac)；1,4-丁磺酸内酯；氯乙酸钠；naio4，然后是蛋白a；二乙烯基砜，然后是蛋白a；烯丙基缩水甘油基醚，然后首先是卤代醇形成试剂，优选n-溴代琥珀酰亚胺，随后是蛋白a；烯丙基缩水甘油基醚，然后首先是环氧化物形成试剂，随后是蛋白a；及其组合。
77.根据方面71至76中任一项所述的方法，其中所述聚合物链中的一个或多个是支化的。
78.根据方面62至77中任一项所述的方法，其中在步骤(iii)中，所述试剂将所述接枝产物官能化使得所得官能化色谱介质适于用在选自离子交换、亲和捕获、疏水相互作用和混合模式方法的色谱方法中。
79.根据方面78所述的方法，其中
-所述色谱方法为阳离子交换法，所述试剂用一个或多个带电基团官能化所述色谱介质，所述带电基团包括一个或多个羧酸根、磺酸根或膦酸根部分；
-所述色谱方法为阴离子交换法，所述试剂用一个或多个带电基团官能化所述色谱介质，所述带电基团包括一个或多个季氨基或二乙胺部分；
-所述色谱方法为亲和捕获色谱法，所述试剂用一种或多种蛋白、肽、抗体或其片段、染料、组氨酸基团或含有金属阳离子的基团官能化所述色谱介质；
-所述色谱方法为疏水相互作用色谱法，所述试剂用一个或多个丙基、丁基、苯基或辛基官能化所述色谱介质；或
-所述色谱方法为混合模式色谱法，所述试剂用一个或多个mep、辛胺、n-苄基甲基乙醇胺或n-苯甲酰-高半胱氨酸基团官能化所述色谱介质。
80.根据方面62至79中任一项所述的方法，其中在步骤(iii)中，所述试剂用一种或多种蛋白a分子官能化所述接枝产物。
81.根据方面62至80中任一项所述的方法，其中步骤(iii)涉及多个步骤，这些步骤一起将步骤(ii)的产物官能化为色谱介质。
82.根据方面81所述的方法，其中在步骤(iii)中：
(a)使所述接枝产物与选自二乙烯基砜、烯丙基缩水甘油基醚及其组合的试剂接触；
(b)任选地用卤代醇形成试剂处理步骤(a)的产物；和
(c)使步骤(b)的产物与蛋白a接触。
83.根据方面62至82中任一项所述的方法，其中所述基材呈膜的形式。
84.根据方面62至83中任一项所述的方法，其中所述纳米纤维具有10nm至1000nm的平均直径。
85.根据方面62至84中任一项所述的方法，所述方法包括
(i)提供由一个或多个纤维素纳米纤维形成的基材，
(ii)通过使多个式
与基材上存在的一个或多个羟基反应来从所述基材接枝一个或多个聚甘油聚合物链，和
(iii)使所述接枝产物与试剂接触，所述试剂将步骤(ii)的产物官能化为适于用在选自离子交换、亲和捕获、疏水相互作用和混合模式方法的色谱方法中的色谱介质，
其中r1、r2、r3、r4和r5可相同或不同，并选自h、卤素、c1-c4烷基或c1-c4烷氧基，前提条件是r1、r2、r3、r4或r5中的至少一个不为氢。
86.根据方面85所述的方法，其中步骤(ii)通过使多个式
87.一种可通过根据方面62至86中任一项所述的方法获得的官能化色谱介质。
88.一种制备色谱柱的方法，所述方法包括进行方面62至86中任一项所述的方法并向柱中引入由此获得的产物。
89.一种色谱柱，其(a)可通过方面88所述的方法获得，或(b)其包含一种或多种根据方面87所述的官能化色谱介质。
90.根据方面87所述的官能化色谱介质或根据方面89所述的色谱柱在色谱法中的用途。
91.一种从流动相分离一种或多种生物分子的方法，所述方法包括使流动相中的一种或多种生物分子与根据方面87所述的官能化色谱介质或根据方面89所述的色谱柱接触。
92.根据方面91所述的方法，其中使流动相中的所述一种或多种生物分子与所述官能化色谱介质接触一分钟或更短的时间段。
93.根据方面91或方面92所述的方法，其中所述一种或多种生物分子为一种或多种单克隆抗体，或经工程改造以呈现对蛋白a结合具有亲和力的位点的蛋白，并且所述官能化色谱介质携带至少一个蛋白a配体基团。
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