用于膜中自限性蛋白质孔插入的系统和方法与流程
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年12月11日提交的美国临时申请第62/777,976号的优先权，该美国专利临时申请的公开内容全文出于所有目的以引用方式并入本文。
以引用方式并入
本说明书中提到的所有出版物和专利申请都以引用方式并入本文，所达到的程度如同每个单独的出版物或专利申请都被具体地和单独地指出以引用方式并入。
背景技术：
基于纳米孔的测序芯片是一种可用于dna测序的分析工具。这些装置可包含配置为阵列的大量传感器单元。例如，测序芯片可包括一百万个单元的阵列，具有例如1000行乘以1000列单元。阵列的每个单元可包括膜和孔径内径为一纳米量级的蛋白质孔。这种纳米孔已被证明在快速核苷酸测序中有效。
当跨浸入导电流体的纳米孔施加电压电位时，可存在归因于离子跨纳米孔传导的小离子电流。电流的大小对孔径和定位于纳米孔内的分子类型敏感。分子可以是附接到特定核苷酸的特定标签，从而允许检测核酸特定位置处的核苷酸。作为测量分子电阻的一种方式，可以测量包括纳米孔的电路中的电压或其他信号(例如，在积分电容器处)，从而允许检测纳米孔中的分子。
为了使测序芯片正常工作，对于给定的单元，通常只需将一个孔插入膜中。如果将多个孔插入单个膜中，则由核苷酸同时通过多个孔产生的电信号将更难解释。
在孔插入步骤期间跨膜施加电压可以促进孔插入过程，可能是通过降低膜的稳定性并允许孔更容易地将自身插入膜中。然而，跨膜施加过大的电压会导致膜的广泛破坏，从而使单元无法使用。
因此，提供一种用于将单个孔可靠地插入膜中同时降低过度损坏膜的风险的系统和方法将是有利的。
技术实现要素：
各种实施例提供了与将单个孔插入基于纳米孔的测序芯片的单元中的膜相关的技术和系统。在一些实施例中，将孔插入到膜中降低了将额外孔插入到膜中的可能性。
其他实施例涉及与这里描述的方法相关联的系统和计算机可读介质。
在一些实施例中，提供了形成纳米孔传感器单元阵列的方法。所述方法包括在单元附近引入纳米孔，该单元具有工作电极和密封单元的膜，其中工作电极由ac耦合的电源供电；跨单元膜施加电压波形，其中电压波形从第一电压开始并且历经一段时间在大小方面增大到第二电压；在施加电压波形的步骤期间将纳米孔插入膜中。
在一些实施例中，第一电压介于大约0和100mv之间并且第二电压介于大约100到2000mv之间。
在一些实施例中，工作电极是电容式电极。
在一些实施例中，电压波形包括第一电压和第二电压之间的多个递增步长。
在一些实施例中，多个递增步长是以大约1到100mv递增。
在一些实施例中，多个递增步长是以大约1到25mv递增。
在一些实施例中，每个递增步长具有介于大约0.1到60秒之间的持续时间。
在一些实施例中，递增步长的持续时间是可变的。
在一些实施例中，更低电压下递增步长的持续时间大于更高电压下递增步长的持续时间。
在一些实施例中，递增步长的持续时间是恒定的。
在一些实施例中，电压波形包括第一电压和第二电压之间的斜升。
在一些实施例中，斜升介于每分钟大约0.1到2.0v之间。
在一些实施例中，斜升具有恒定斜率。
在一些实施例中，斜升具有可变斜率。
在一些实施例中，斜升在更低电压下的斜率小于在更高电压下的斜率。
在一些实施例中，将施加电压波形的步骤施加到未经减薄的膜。
在一些实施例中，方法进一步包括用施加的电压波形减薄未经减薄的膜。
在一些实施例中，提供了用于对分子进行测序的系统。所述系统包括基板上的单元的阵列，每个单元具有工作电极和配置为由膜密封的开口，其中工作电极由ac耦合的电源供电；对电极；电源，其中电源ac耦合至每个工作电极；控制器，其编程为：使用工作电极和对电极将电压波形传送到单元，其中电压波形从第一电压开始，并且历经一段时间在大小方面增大到第二电压。
在一些实施例中，工作电极是电容式电极。
在一些实施例中，电压波形包括第一电压和第二电压之间的多个递增步长。
在一些实施例中，电压波形包括第一电压和第二电压之间的斜升。
在一些实施例中，控制器进一步编程为将电压波形传送到未经减薄的膜。
在一些实施例中，提供了形成纳米孔传感器单元阵列的方法。所述方法可包括在单元附近引入纳米孔，该单元具有工作电极和密封单元的膜，其中工作电极由电耦合的电源供电；跨单元膜施加电压波形，其中电压波形从第一电压开始并且历经一段时间在大小方面增大到第二电压；其中电压波形包括ac调制分量，该ac调制分量配置为允许在跨单元膜施加电压波形时通过工作电极进行电测量；并在施加电压波形的步骤期间将纳米孔插入膜中。
在一些实施例中，ac调制分量具有小于100mv的振幅。在一些实施例中，ac调制分量具有介于10hz和1000hz之间的频率。
在一些实施例中，提供了一种形成膜覆盖单元的方法。该方法可包括使成膜材料流过单元，该单元具有工作电极，其中工作电极由电耦合的电源供电；在单元上设置成膜材料层；使用工作电极和成膜材料层相对侧上的对电极跨成膜材料层施加电压波形，其中电压波形包括ac调制分量，ac调制分量配置为允许在跨成膜材料层施加电压波形时通过工作电极进行电测量；并且将成膜材料层减薄成膜，该膜配置为接纳纳米孔。
在一些实施例中，ac调制分量具有小于100mv的振幅。在一些实施例中，ac调制分量具有介于10hz和1000hz之间的频率。
参考以下具体实施方式和附图，可以更好地理解本发明的实施例的性质和优点。
附图说明
本发明的新颖特征在所附的权利要求书中具体阐述。通过参考以下具体实施方式并结合附图，可以更好地理解本发明的特征和优点，具体实施方式阐述了其中利用本发明原理的说明性实施例，在附图中：
图1是具有纳米孔单元的阵列的纳米孔传感器芯片的实施例的俯视图。
图2示出可以用于表征多核苷酸或多肽的纳米孔传感器芯片中的纳米孔单元的实施例。
图3示出使用基于纳米孔的边合成边测序(nano-sbs)技术执行核苷酸测序的纳米孔单元的实施例。
图4示出表示纳米孔单元的电模型的电路的实施例。
图5显示在ac循环的亮周期和暗周期期间从纳米孔单元捕获的数据点实例。
图6示出纳米孔传感器单元的电路图的实施例。
图7示出可用于促进孔插入的步进电压波形。
图8a和8b示出可用于促进孔插入的斜升电压波形。
图9a和9b示出，在一些实施例中，一旦孔已插入，孔可消散跨膜本身的电压积累，从而降低在孔已插入后进一步增加电压时膜损坏的风险，并且减少额外孔插入的可能性。
图10a示出阵列中孔插入的数量作为电压和时间的函数的曲线图，并且图10b示出由膜破裂引起的失活/短路的数量作为电压和时间的函数的曲线图。
图11是根据本公开的某些方面的计算机系统。
具体实施方式
术语
除非另外定义，本文所用的科学技术术语具有本领域的普通技术人员通常理解的相同意义。与本文上述类似或等同的方法、装置和材料可用于所公开技术的实践。提供以下术语是为了便于理解某些经常使用的术语，并不意味着限制本公开的范围。本文使用的缩写具有其在化学和生物学领域内的常规含义。
“纳米孔”指在膜中形成或以其他方式提供的孔、通道或通路。膜可以是有机膜，诸如脂质双分子层，或合成膜，诸如由聚合材料形成的膜。纳米孔可以设置成邻近或接近于传感电路或耦合至传感电路的电极，诸如，例如，互补金属氧化物半导体(cmos)或场效应晶体管(fet)电路。在一些实例中，纳米孔具有约0.1纳米(nm)至约1000nm数量级的特征宽度或直径。在一些实施方式中，纳米孔可以是蛋白质。
“核酸”可以指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰的骨架残基或键的核酸，这些核苷酸是合成的、天然存在的和非天然存在的，它们具有与参考核酸相似的结合特性，并且其以类似于参考核苷酸的方式代谢。此类类似物的示例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、手性甲基磷酸酯、2-o-甲基核糖核苷酸和肽-核酸(pna)。除非另外指出，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如，简并密码子替换)和互补序列，以及明确指出的序列。具体而言，简并密码子替换可通过产生序列来实现，其中一个或多个所选(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基替换(batzer等人，nucleicacidres.19:5081(1991)；ohtsuka等人，j.biol.chem.260:2605-2608(1985)；rossolini等人，mol.cell.probes8:91-98(1994))。术语核酸可与基因、cdna、mrna、寡核苷酸和多核苷酸互换使用。
除非上下文另外明确指出，否则术语“核苷酸”除了指天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体外，还可理解为是指其相关的结构变体，包括衍生物和类似物，其在使用该核苷酸的特定情况下(例如，与互补碱基杂交)在功能上是等同的。
术语“标签”是指可检测部分，该可检测部分可以是原子或分子，或者原子或分子的集合。标签可提供光学、电化学、磁性或静电(例如，感应、电容)标记，该标记可以借助纳米孔来检测。通常，当核苷酸附接到标签时，它被称为“带标签的核苷酸”。标签可以经由磷酸部分附接到核苷酸上。
术语“模板”指复制到dna核苷酸的互补链中用于dna合成的单链核酸分子。在一些情况下，模板可指在mrna合成期间复制的dna序列。
术语“引物”指为dna合成提供起点的短核酸序列。催化dna合成的酶(诸如dna聚合酶)可以添加新的核苷酸至引物以用于dna复制。
“聚合酶”指进行模板指导的多核苷酸合成的酶。该术语包括全长多肽和具有聚合酶活性的结构域。dna聚合酶是本领域技术人员熟知的，包括但不限于分离或衍生自激烈火球菌(pyrococcusfuriosus)、滨海嗜热球菌(hermococcuslitoralis)和海栖热袍菌(thermotogamaritime)的dna聚合酶，或其修饰形式。它们包括dna依赖性聚合酶和rna依赖性聚合酶，诸如逆转录酶。已知至少有五个dna依赖性的dna聚合酶家族，尽管大多数属于家族a、b和c。各个家族之间几乎没有或完全没有序列相似性。大多数家族a聚合酶是单链蛋白，可包含多种酶促功能，包括聚合酶、3'到5'核酸外切酶活性和5'到3'核酸外切酶活性。家族b聚合酶通常具有单一的催化结构域，具有聚合酶和3'到5'外切核酸酶活性，以及辅助因子。家族c聚合酶通常是多亚基蛋白质，具有聚合和3'到5'外切核酸酶活性。在大肠杆菌(e.coli)中，已发现三种类型的dna聚合酶：dna聚合酶i(家族a)、ii(家族b)和iii(家族c)。在真核细胞中，三种不同的家族b聚合酶(dna聚合酶α、β和ε)参与核复制，而家族a聚合酶(聚合酶γ)用于线粒体dna复制。其他类型的dna聚合酶包括噬菌体聚合酶。类似地，rna聚合酶通常包括真核rna聚合酶i、ii和iii，细菌rna聚合酶以及噬菌体和病毒聚合酶。rna聚合酶可以是dna依赖性和rna依赖性的。
术语“亮周期”通常指带标签的核苷酸的标签通过ac信号施加的电场而被迫进入纳米孔时的时间段。术语“暗周期”通常指带标签的核苷酸的标签通过ac信号施加的电场被推出纳米孔时的时间段。ac循环可包括亮周期和暗周期。在不同的实施例中，施加至纳米孔单元以将纳米孔单元置于亮周期(或暗周期)的电压信号的极性可不同。
术语“信号值”指从测序单元输出的测序信号的值。根据某些实施例，测序信号是从一个或多个测序单元的电路中的点测量和/或输出的电信号，例如，信号值是(或代表)电压或电流。信号值可以表示电压和/或电流的直接测量的结果和/或可以表示间接测量，例如，信号值可以是所测量的持续时间，在该持续时间内，电压或电流达到指定值。信号值可以表示与纳米孔的电阻率相关的任何可测量的量，并且可以从中推导出纳米孔(穿线和/或未穿线)的电阻率和/或电导。作为另一个示例，信号值可以对应于光强度，例如，来自附接到核苷酸的荧光团，该核苷酸被添加到包含聚合酶的核酸。
术语“渗透压浓度”，也称为渗透浓度，指溶质浓度的量度。渗透压浓度衡量的是每单位体积溶液中溶质颗粒的渗透压克分子数。渗透压克分子是影响溶液渗透压的溶质摩尔数的量度。渗透压浓度允许测量溶液的渗透压，并确定溶剂将如何扩散跨过半透膜(渗透)，将两种不同渗透浓度的溶液分开。
术语“渗透剂”是指当溶解于溶液中时会增加该溶液的渗透压浓度的任何可溶性化合物。
根据某些实施例，本文公开的技术和系统涉及将单个孔插入到基于纳米孔的测序芯片的单元中的膜中。在一些实施例中，将孔插入膜中降低了将额外孔插入膜中的可能性，从而自限制进一步孔插入并减少或消除了在插入步骤期间对主动反馈的需要。
首先描述了示例纳米孔系统、电路和测序操作，然后是替换dna测序单元中纳米孔的示例技术。本发明的实施例可以以多种方式实现，包括作为体现在计算机可读存储介质和/或处理器上的过程、系统和计算机程序产品，诸如配置为执行与处理器耦合的存储器上存储和/或提供的指令的处理器。
i.基于纳米孔的测序芯片
图1是具有纳米孔单元150的阵列140的纳米孔传感器芯片100的实施例的俯视图。每个纳米孔单元150包括集成在纳米孔传感器芯片100的硅基板上的控制电路。在一些实施例中，列140中包括侧壁136以分离多个纳米孔单元150的组，使得每一组可以接纳不同的样品以用于表征。每个纳米孔单元可用于对核酸进行测序。在一些实施例中，纳米孔传感器芯片100包括盖板130。在一些实施例中，纳米孔传感器芯片100还包括多个引脚110，用于与诸如计算机处理器的其他电路交互。
在一些实施例中，纳米孔传感器芯片100在同一封装中包括多个芯片，例如，多芯片模块(mcm)或系统级封装(sip)。这些芯片可以包括，例如，存储器、处理器、现场可编程门阵列(fpga)、专用集成电路(asic)、数据转换器、高速i/o接口等。
在一些实施例中，纳米孔传感器芯片100耦合到(例如，对接到)纳米芯片工作站120，该纳米芯片工作站120可包括用于执行(例如，自动执行)本文公开的过程的各种实施例的各种组件。这些过程可包括，例如，分析物递送机制，诸如用于递送脂质悬浮液或其他膜结构悬浮液、分析物溶液和/或其他液体、悬浮液或固体的移液管。纳米芯片工作站组件可进一步包括机械臂、一个或多个计算机处理器和/或存储器。可以在纳米孔单元150的阵列140上检测到多个多核苷酸。在一些实施例中，每个纳米孔单元150是可单独寻址的。
ii.纳米孔测序单元
纳米孔传感器芯片100上的纳米孔单元150可以以许多不同方式实施。例如，在一些实施例中，不同尺寸和/或化学结构的标签附接至待测序的核酸分子中的不同核苷酸。在一些实施例中，待测序的核酸分子的模板的互补链可以通过使带不同聚合物标签的核苷酸与模板杂交来合成。在一些实施方式中，核酸分子和附接的标签均移动通过纳米孔，并且由于附接至核苷酸的标签的特定尺寸和/或结构，因此流过纳米孔的离子电流可指示纳米孔中的核苷酸。在一些实施方式中，仅将标签移入纳米孔中。还可以有许多不同的方式可以检测纳米孔中的不同标签。
a.纳米孔测序单元结构
图2示出可以用于表征多核苷酸或多肽的纳米孔传感器芯片中的纳米孔单元200的实施例，诸如图1的纳米孔芯片100中的纳米孔单元150。纳米孔单元200可包括由介电层201和204形成的阱205；在阱205上方形成的膜，诸如脂质双层214；以及在脂质双层214上并通过脂质双层214与阱205分离的样品室215。阱205可包含一定体积的电解质206，并且样品室215可容纳包含纳米孔的主体电解质208，例如，可溶性蛋白纳米孔跨膜分子复合物(pntmc)，以及目标分析物(例如，待测序的核酸分子)。
纳米孔单元200可包括阱205底部处的工作电极202和设置在样品室215中的对电极210。信号源228可在工作电极202与对电极210之间施加电压信号。单个纳米孔(例如，pntmc)可通过由电压信号引起的电穿孔工艺插入脂质双层214中，从而在脂质双层214中形成纳米孔216。阵列中的各个膜(例如，脂质双层214或其他膜结构)可以彼此既不化学连接也不电连接。因此，阵列中的每一个纳米孔单元可以是独立的测序仪，产生与纳米孔相关的单个聚合物分子所特有的数据，所述纳米孔对目标分析物起作用，并调节通过其他不可透过的脂质双层的离子电流。
用于孔插入的系统和方法的其他实施例如下面部分iii中所述。特别地，这些系统和方法描述了自限性孔插入，其有效地实现了单元膜中的单个孔插入。
如图2所示，纳米孔单元200可在基板230(诸如硅基板)上形成。介电层201可以在基板230上形成。用于形成介电层201的介电材料可以包括，例如，玻璃、氧化物、氮化物等。用于控制电刺激并用于处理从纳米孔单元200检测到的信号的电路222可在基板230上和/或在介电层201内形成。例如，多个图案化的金属层(例如，金属1至金属6)可以在介电层201中形成，并且多个有源器件(例如，晶体管)可以在基板230上制造。在一些实施例中，信号源228被包括作为电路222的一部分。电路222可包括，例如，放大器、积分器、模数转换器、噪声滤波器、反馈控制逻辑和/或各种其他部件。电路222还可耦合至处理器224，所述处理器耦合至存储器226，其中处理器224可以分析测序数据以确定已在阵列中测序的聚合物分子的序列。
工作电极202可在介电层201上形成，并且可形成阱205的底部的至少一部分。在一些实施例中，工作电极202是金属电极。对于非法拉第传导，工作电极202可由抗腐蚀和抗氧化的金属或其他材料制成，例如，铂、金、氮化钛和石墨。例如，工作电极202可以是具有电镀铂的铂电极。在另一个实例中，工作电极202可以是氮化钛(tin)工作电极。工作电极202可以是多孔的，从而增加其表面积以及与工作电极202相关的产生的电容。因为纳米孔单元的工作电极可以不依赖于另一纳米孔单元的工作电极，所以在本公开中，该工作电极可以称为单元电极。
介电层204可以在介电层201之上形成。介电层204形成环绕阱205的壁。用于形成介电层204的介电材料可以包括，例如，玻璃、氧化物、一氮化硅(sin)、聚酰亚胺或其他合适的疏水绝缘材料。介电层204的顶表面可以硅烷化。硅烷化可以在介电层204的顶表面之上形成疏水层220。在一些实施方案中，疏水层220具有约1.5纳米(nm)的厚度。
由介电层壁204形成的阱205包括工作电极202之上的电解质206的体积。电解质206的体积可以缓冲，并且可以包括以下项的一种或多种：氯化锂(licl)、氯化钠(nacl)、氯化钾(kcl)、谷氨酸锂、谷氨酸钠、谷氨酸钾、乙酸锂、乙酸钠、乙酸钾、氯化钙(cacl2)、氯化锶(srcl2)、氯化锰(mncl2)和氯化镁(mgcl2)。在一些实施例中，电解质206的体积具有约三微米(μm)的厚度。
同样如图2所示，可以在介电层204之上形成膜并跨过阱205。在一些实施例中，膜包括在疏水层220的顶部上形成的脂质单层218。当膜到达阱205的开口时，脂质单层208可以转变为跨阱205的开口的脂质双层214。脂质双层可以包括磷脂或由诸如磷脂的脂质组成，例如，选自二植烷酰基-磷脂酰胆碱(dphpc)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二-o-植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dophpc)、棕榈酰基-油酰基-磷脂酰胆碱(popc)、二油酰基-磷脂酰-甲基酯(dopme)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(dppc)、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、鞘磷脂、1,2-二-o-植烷酰基-sn-甘油、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-350]、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-550]、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-750]、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-1000]、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-乳糖酰基、gm1神经节苷脂、溶血磷脂酰胆碱(lpc)或其任意组合。也可以使用其他磷脂衍生物，诸如磷脂酸衍生物(例如，dmpa、ddpa、dspa)、磷脂酰胆碱衍生物(例如，ddpc、dlpc、dmpc、dppc、dspc、dopc、popc、depc)、磷脂酰甘油衍生物(例如，dmpg、dppg、dspg、popg)、磷脂酰乙醇胺衍生物(例如，dmpe、dppe、dspe、dope)、磷脂酰丝氨酸衍生物(例如，dops)、peg磷脂衍生物(例如，mpeg-磷脂、聚甘油-磷脂、功能化-磷脂、末端活化-磷脂)、二植烷酰基磷脂(例如，dphpc、dophpc、dphpe和dophpe)。在一些实施例中，双层可以使用基于非脂质的材料形成，例如两亲性嵌段共聚物(例如，聚(丁二烯)-嵌段-聚(环氧乙烷)、peg二嵌段共聚物、peg三嵌段共聚物、ppg三嵌段共聚物和泊洛沙姆)和其他两亲性共聚物，其可能是非离子的或离子的。在一些实施例中，双层可以由基于脂质的材料和基于非脂质的材料的组合形成。在一些实施例中，双层材料可以在包括诸如烷烃(例如癸烷、十三烷、十六烷等)的一种或多种有机溶剂和/或一种或多种硅油(例如ar-20)的溶剂相中递送。
如所示，脂质双层214嵌有单个纳米孔216，所述纳米孔例如由单个pntmc形成。如上所述，纳米孔216可以通过电穿孔将单个pntmc插入脂质双层214中形成。纳米孔216可以足够大以使至少一部分目标分析物和/或小离子(例如，na+、k+、ca2+、ci-)在脂质双层214的两侧之间通过。
样品室215位于脂质双层214上方，并且可以容纳目标分析物的溶液以用于表征。所述溶液可以是含有主体电解质208的水溶液，并缓冲至最佳离子浓度且维持在最佳ph以保持纳米孔216开放。纳米孔216穿过脂质双分子层214，并且为从主体电解质208至工作电极202的离子流动提供唯一路径。除纳米孔(例如，pntmc)和目标分析物之外，主体电解质208还可以包括以下项的一种或多种：氯化锂(licl)、氯化钠(nacl)、氯化钾(kcl)、谷氨酸锂、谷氨酸钠、谷氨酸钾、乙酸锂、乙酸钠、乙酸钾、氯化钙(cacl2)、氯化锶(srcl2)、氯化锰(mncl2)和氯化镁(mgcl2)。
对电极(ce)210可以是电化学电位传感器。在一些实施例中，对电极210可以在多个纳米孔单元之间共享，并且因此可以称为共用电极。在一些情况下，共用电位和共用电极可以为特定分组内的所有纳米孔单元或至少所有纳米孔单元所共用。共用电极可以被配置为向与纳米孔216接触的主体电解质208施加共用电位。对电极210和工作电极202可以耦合至信号源228，以提供跨脂质双层214的电刺激(例如，电压偏置)，并且可以用于感测脂质双层214的电特性(例如，电阻、电容和离子电流)。在一些实施例中，纳米孔单元200还可包括参考电极212。
在一些实施例中，作为校准的一部分，在创建纳米孔单元期间进行各种检查。一旦纳米孔单元创建，可以执行进一步的校准步骤，例如，以识别性能符合期望的纳米孔单元(例如，单元中的一个纳米孔)。此类校准检查可以包括物理检查、电压校准、开放通道校准以及具有单个纳米孔的单元识别。
b.纳米孔测序单元的检测信号
纳米孔传感器芯片中的纳米孔单元，诸如纳米孔传感器芯片100中的纳米孔单元150，可以使用基于单分子纳米孔的边合成边测序(nano-sbs)技术进行平行测序。
图3示出使用nano-sbs技术执行核苷酸测序的纳米孔单元300的实施例。在nano-sbs技术中，可以将待测序的模板332(例如，核苷酸分子或另一目标分析物)和引物引入纳米孔单元300样品室中的主体电解质308中。作为实例，模板332可以呈圆形或线形。核酸引物可以与模板332的一部分杂交，可以向该模板的一部分添加四种带不同聚合物标签的核苷酸338。
在一些实施例中，酶(例如，聚合酶334，诸如dna聚合酶)与纳米孔316缔合，以用于合成模板332的互补链。例如，聚合酶334可以共价附接至纳米孔316。聚合酶334可以使用单链核酸分子作为模板以催化核苷酸338掺入到引物上。核苷酸338可以包括标签种类(“标签”)，其中核苷酸是四种不同类型中的一种：a、t、g或c。当带标签的核苷酸与聚合酶334正确复合时，可以通过电动力将标签拉到(例如，负载)到纳米孔中，诸如在电场作用下产生的力，所述电场由跨脂质双层314和/或纳米孔316施加的电压生成。标签的尾部可以定位于纳米孔316的筒体中。由于标签的独特的化学结构和/或尺寸，保持在纳米孔316的筒体中的标签可以生成独特的离子阻断信号340，从而电子识别标签所附接的添加碱基。
如本文所用，“负载的”或“穿线的”标签是定位在纳米孔中和/或保持在纳米孔中或附近相当长时间的标签，例如，0.1毫秒(ms)至10000ms。在一些情况下，标签在从核苷酸释放之前被负载在纳米孔中。在一些情况下，在核苷酸掺入事件释放后，负载的标签穿过纳米孔(和/或被其检测)的概率适当较高，例如，90％至99％。
在一些实施例中，在将聚合酶334连接至纳米孔316之前，纳米孔316具有高电导，例如，约300皮西门子(300ps)。当标签负载在纳米孔中时，由于标签的独特的化学结构和/或尺寸，生成独特的电导信号(例如，信号340)。例如，纳米孔的电导可以为约60ps、80ps、100ps或120ps，各自对应于四种类型的带标签的核苷酸中的一种。然后，聚合酶可以进行异构化和转磷酸化反应以将核苷酸掺入到正在生长的核酸分子中并释放标签分子。
在一些情况下，一些带标签的核苷酸可以与核酸分子(模板)的当前位置不匹配(互补碱基)。不与核酸分子碱基配对的带标签的核苷酸也可以穿过纳米孔。这些未配对的核苷酸可以在比正确配对的核苷酸保持与聚合酶缔合的时间范围更短的时间范围内被聚合酶拒绝。与未配对核苷酸结合的标签可以快速穿过纳米孔，并在短时间内(例如，少于10ms)检出，而与配对核苷酸结合的标签可以负载到纳米孔中并在长时间内(例如，至少10ms)检出。因此，未配对的核苷酸可以由下游处理器至少部分地基于在纳米孔中检测核苷酸的时间来进行识别。
包括负载的(穿线的)标签的纳米孔的电导(或等效电阻)可以经由信号值(例如，流过纳米孔的电压或电流)来进行测量，从而提供标签种类的识别，并由此提供当前位置的核苷酸的识别。在一些实施例中，直流(dc)信号施加至纳米孔单元(例如，使得标签移动穿过纳米孔的方向不是反向的)。但是，使用直流电长时间操作纳米孔传感器可以改变电极的组成，使穿过纳米孔的离子浓度失衡，并产生其他不期望的效果，从而影响纳米孔单元的寿命。施加交流(ac)波形可以减少电迁移，从而避免这些不期望的效果，并具有如下所述的某些优点。本文所述的利用带标签的核苷酸的核酸测序方法与施加的ac电压完全兼容，因此ac波形可用于实现这些优点。
当使用牺牲电极，即在载流反应中改变分子特性的电极(例如，含银电极)，或在载流反应中改变分子特性的电极时，在ac检测循环期间对电极再充电的能力可能有利。当使用直流信号时，电极可以在检测循环期间耗尽。再充电可以防止电极达到耗尽极限，诸如变得完全耗尽，这在电极较小时(当电极足够小以提供具有每平方毫米至少500个电极的电极阵列时)可能会出现问题。在一些情况下，电极寿命与电极的宽度成比例，并且至少部分取决于电极的宽度。
用于测量流过纳米孔的离子电流的合适条件是本领域已知的，并且本文提供了实例。可以通过跨膜和孔施加电压来进行测量。在一些实施例中，使用的电压在-400mv至+400mv的范围内。使用的电压优选地在具有选自-400mv、-300mv、-200mv、-150mv、-100mv、-50mv、-20mv和0mv的下限和独立地选自+10mv、+20mv、+50mv、+100mv、+150mv、+200mv、+300mv和+400mv的上限的范围内。使用的电压可以更优选地在100mv至240mv的范围内，并且最优选地在160mv至240mv的范围内。使用增加的施加电位，通过纳米孔来增加不同核苷酸之间的区别是可能的。使用ac波形和带标签的核苷酸进行核酸测序在2013年11月6日提交的题为“使用标签的核酸测序”的美国专利公开号us2014/0134616中有描述，该美国专利全文以引用方式并入本文。除了us2014/0134616中描述的带标签的核苷酸外，还可以使用缺少糖或无环部分的核苷酸类似物，例如，五个常见核碱基：腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、尿嘧啶和胸腺嘧啶的(s)-甘油核苷三磷酸(gntp)(horhota等人，organicletters,8:5345-5347[2006])进行测序。
c.纳米孔测序单元的电路
图4示出诸如纳米孔单元400的纳米孔单元中的电路400(该电路可以包括图2中的电路222的部分)的实施例。如上所述，在一些实施例中，电路400包括对电极410，该电极可以在纳米孔传感器芯片中的多个纳米孔单元或所有纳米孔单元之间共享，并且因此也可以称为作为共用电极。共用电极可以被配置为通过连接至电压源vliq420而向与纳米孔单元中的脂质双层(例如，脂质双层214)接触的主体电解质(例如，主体电解质208)施加共用电位。在一些实施例中，利用ac非法拉第模式来用ac信号(例如，方波)调节电压vliq，并将其施加到与纳米孔单元中的脂质双层接触的主体电解质上。在一些实施例中，vliq是大小为±200-250mv且频率介于例如25至400hz之间的方波。对电极410和脂质双层(例如脂质双层214)之间的主体电解质可以通过例如，100μf或更大的大电容器(未示出)来进行建模。
图4还示出表示工作电极402(例如，工作电极202)和脂质双层(例如，脂质双层214)的电特性的电模型422。电模型422包括对脂质双层相关的电容进行建模的电容器426(c双层)和对纳米孔相关的可变电阻进行建模的电阻器428(r孔)，所述电模型可以基于纳米孔中特定标签的存在而变化。电模型422还包括电容器424，所述电容器具有两层电容(c两层)并且表示工作电极402和阱205的电特性。工作电极402可以被配置为不依赖于其他纳米孔单元中的工作电极来施加不同的电位。
通路器件406是开关，该开关可以用于将脂质双层和工作电极连接至电路400或者断开与之的连接。通路器件406可以由控制线407控制，以启用或禁用跨纳米孔单元中的脂质双层施加的电压刺激。在脂质沉积以形成脂质双层之前，两个电极之间的阻抗可以非常低，因为纳米孔单元的阱未密封，因此通路器件406可以保持开放以避免短路情况。在脂质溶剂已经沉积到纳米孔单元以密封纳米孔单元的阱之后，通路器件406可以关闭。
电路400还可以包括芯片上积分电容器408(ncap)。积分电容器408可以通过使用复位信号403来闭合开关401而进行预充电，使得积分电容器408连接至电压源vpre405。在一些实施例中，电压源vpre405提供大小为例如900mv的恒定参考电压。当开关401闭合时，积分电容器408可以预充电至电压源vpre405的参考电压电平。
在对积分电容器408进行预充电之后，复位信号403可以用于断开开关401，以断开积分电容器408与电压源vpre405的连接。此时，根据电压源vliq的电平，对电极410的电位可以处于高于工作电极402(和积分电容器408)的电位的电平，或反之亦然。例如，在来自电压源vliq的方波的正相位期间(例如，ac电压源信号循环的亮周期或暗周期)，对电极410的电位处于高于工作电极402的电位的电平。在来自电压源vliq的方波的负相位期间(例如，ac电压源信号循环的暗周期或亮周期)，对电极410的电位处于低于工作电极402的电位的电平。因此，在一些实施例中，由于对电极410与工作电极402之间的电位差，积分电容器408可以在从电压源vpre405的预充电电压电平预充电至更高电平的亮周期期间进一步充电，并在暗周期期间放电至更低电平。在其他实施例中，充电和放电可以分别在暗周期和亮周期中发生。
根据模数转换器(adc)435的采样率，积分电容器408可以在固定的时间段充电或放电，所述采样率可以高于1khz、5khz、10khz、100khz或更多。例如，以1khz的采样率，积分电容器408可以在约1ms的时间段充电/放电，然后可以在积分周期结束时由adc435对电压电平进行采样和转换。特定的电压电平将对应于纳米孔中的特定标签种类，并且因此对应于模板上当前位置的核苷酸。
在由adc435采样之后，积分电容器408可以通过使用复位信号403来闭合开关401而再次进行预充电，使得积分电容器408再次连接至电压源vpre405。可以在整个测序过程的循环中重复以下步骤：对积分电容器408进行预充电，等待积分电容器408在固定的时间段充电或放电，以及由adc435对积分电容器的电压电平进行采样和转换。
数字处理器430可以处理adc输出数据，例如，用于归一化、数据缓冲、数据过滤、数据压缩、数据缩减、事件提取、或将来自纳米孔单元阵列的adc输出数据组装成各种数据帧。在一些实施例中，数字处理器430执行进一步下游处理，诸如碱基确定。数字处理器430可以作为硬件实施(例如，在图形处理单元(gpu)、fpga、asic等中)或作为硬件和软件的组合。
因此，跨纳米孔施加的电压信号可用于检测纳米孔的特定状态。当纳米孔的筒体中不存在标签附接的多磷酸盐时，纳米孔的一种可能状态是开放通道状态，本文中也称为纳米孔的未穿线状态。纳米孔的另外四种可能状态各自对应于四种不同类型的标签附接的多磷酸核苷酸(a、t、g或c)中的一种被保持在纳米孔的筒体中的状态。纳米孔的另一种可能状态是脂质双层破裂时。
当在固定的时间段之后测量积分电容器408上的电压电平时，纳米孔的不同状态可以产生对不同电压电平的测量。这是因为积分电容器408上的电压衰减率(通过放电降低或通过充电而增加)(即，积分电容器408上的电压斜率的陡度与时间曲线图)取决于纳米孔电阻(例如，电阻器r孔428的电阻)。更特别地，由于分子(标签)的不同化学结构，与处于不同状态的纳米孔相关的电阻不同，因此可以观察到对应的不同电压衰减率，并且可以用于识别纳米孔的不同状态。电压衰减曲线可以是具有rc时间常数τ＝rc的指数曲线，其中r是与纳米孔相关的电阻(即，r孔电阻器428)，c是与r平行的膜相关的电容(即，c双层电容器426)。纳米孔单元的时间常数可以是，例如，约200-500ms。由于双层的详细实施方式，衰减曲线可以非完全拟合指数曲线，但是衰减曲线可以类似于指数曲线并且是单调的，从而实现标签检测。
在一些实施例中，与处于开放通道状态的纳米孔相关联的电阻在100mohm至20gohm的范围内。在一些实施例中，在标签在纳米孔的筒体内的状态下，与纳米孔相关的电阻可以在200mohm至40gohm的范围内。在其他实施例中，可以省略积分电容器408，因为通向adc435的电压仍将随电模型422中的电压衰减而变化。
积分电容器408上的电压衰减率可以以不同的方式确定。如上所述，电压衰减率可以通过在固定的时间间隔内测量电压衰减来确定。例如，可以首先在时间t1处由adc435测量积分电容器408上的电压，然后在时间t2处由adc435再次测量电压。当积分电容器408上的电压斜率相对于时间曲线较陡时，电压差较大，而当电压曲线的斜率较缓时，电压差较小。因此，电压差可以用作确定积分电容器408上的电压衰减率以及纳米孔细胞状态的度量。
在其他实施例中，电压衰减率通过测量所选电压衰减量所需的持续时间来确定。例如，可以测量电压从第一电压电平v1下降或增加至第二电压电平v2所需的时间。当电压相对于时间曲线的斜率较陡时，所需的时间较少，而当电压相对于时间曲线的斜率较缓时，所需的时间较多。因此，所需的测量时间可以用作确定积分电容器ncap408上的电压衰减率以及纳米孔单元状态的度量。本领域技术人员将理解可用于测量纳米孔的电阻的各种电路，例如，包括信号值测量技术，诸如电压或电流测量。
在一些实施例中，电路400不包括在芯片上制造的通路器件(例如，通路器件406)和额外的电容器(例如，积分电容器408(ncap))，从而有助于减小基于纳米孔的测序芯片的尺寸。由于膜(脂质双层)的薄性质，仅与膜相关的电容(例如，电容器426(c双层))就足以产生所需的rc时间常数，而无需额外的芯片上电容。因此，电容器426可以用作积分电容器，并且可以通过电压信号vpre预充电并且随后可以通过电压信号vliq放电或充电。消除原本在电路中的芯片上制造的额外电容器和通路器件，可以显著减小纳米孔测序芯片中单个纳米孔单元的占位面积，从而有利于纳米孔测序芯片的缩放以包括越来越多的单元(例如，在纳米孔测序芯片中具有数百万个单元)。
d.纳米孔单元中的数据采样
为了执行核酸测序，积分电容器(例如，积分电容器408(ncap)或电容器426(c双层))的电压电平可以由adc(例如，adc435)采样和转换，同时将带标签的核苷酸添加到核酸中。例如，当所施加的电压使得vliq低于vpre时，核苷酸的标签可以通过穿过对电极和工作电极施加的跨纳米孔的电场推入纳米孔的筒体中。
1.穿线
穿线事件是将带标签的核苷酸附接至模板(例如，核酸片段)，并且标签移动进出纳米孔的筒体时。在穿线事件期间，这种移动可以发生多次。当标签在纳米孔的筒体中时，纳米孔的电阻可以更高，并且更低的电流可以流过纳米孔。
在测序期间，标签可以不在某些ac循环(称为开放通道状态)的纳米孔中，其中电流最高，因为纳米孔的电阻较低。当标签被吸引至纳米孔的筒体中时，纳米孔处于亮模式。当标签从纳米孔的筒体中推出时，纳米孔处于暗模式。
2.亮周期和暗周期
在ac循环内，adc可以多次采样积分电容器上的电压。例如，在一个实施例中，以例如约100hz跨系统施加ac电压信号，并且adc的获取速率可以是每个单元约2000hz。因此，每个ac循环(ac波形的循环)可以捕获约20个数据点(电压测量)。对应于ac波形的一个循环的数据点可以称为一组。在ac循环的一组数据点中，亚组可以例如在vliq低于vpre时捕获，所述亚组可以对应于亮模式(周期)，在该模式下标签被迫进入纳米孔的筒体中。另一亚组可以对应于暗模式(周期)，在该模式下标签在例如vliq高于vpre时由所施加的电场从纳米孔的筒体中推出。
3.测得电压
对于每个数据点，当开关401断开时，积分电容器(例如，积分电容器408(ncap)或电容器426(c双层))处的电压将因vliq的充电/放电而以衰减的方式发生变化，例如，当vliq高于vpre时从vpre增加到vliq，或者当vliq低于vpre时从vpre减少到vliq。当工作电极充电时，最终电压值可以偏离vliq。积分电容器上电压电平的变化率可以由双层的电阻值控制，所述双层可以包括纳米孔，该纳米孔进而可以包括纳米孔中的分子(例如，带标签的核苷酸的标签)。电压电平可以在开关401断开之后的预定时间测量。
开关401可以以数据获取速率操作。开关401可以在两次数据获取之间相对短的时间段内闭合，通常在adc测量之后立即闭合。所述开关允许在vliq的每一个ac循环的每一个子周期(亮或暗)期间收集多个数据点。如果开关401保持断开，则积分电容器上的电压电平以及adc的输出值完全衰减并保持不动。相反，如果开关401闭合，则积分电容器再次预充电(至vpre)，并且准备好进行另一次测量。因此，开关401允许针对每一个ac循环的每一个子周期(亮或暗)收集多个数据点。如此多次测量可以利用固定的adc实现更高的分辨率(例如，由于更多的测量次数，因此为8位至14位，所述次数可以取平均)。多次测量还可以提供有关进入纳米孔中穿线的分子的动力学信息。定时信息可以确定穿线发生的时间长短。这也可以用于帮助确定添加到核酸链的多个核苷酸是否正在测序。
图5显示在ac循环的亮周期和暗周期期间从纳米孔单元捕获的数据点实例。在图5中，出于说明目的，放大数据点的变化。施加到工作电极或积分电容器的电压(vpre)处于恒定电平，例如900mv。施加到纳米孔单元的对电极的电压信号510(vliq)是显示为矩形波的ac信号，其中占空比可以是任何合适的值，诸如小于或等于50％，例如，约40％。
在亮周期520期间，施加到对电极的电压信号510(vliq)低于施加到工作电极的电压vpre，使得标签可能通过施加在工作电极和对电极上的不同电压电平(例如，由于标签上的电荷和/或离子的流动)所引起的电场而被迫进入纳米孔的筒体中。当开关401断开时，adc之前的节点处(例如，积分电容器处)的电压将减小。在捕获电压数据点之后(例如，在指定时间段之后)，开关401可以闭合，并且测量节点处的电压将再次增加回到vpre。该工艺可以重复以测量多个电压数据点。以这种方式，可以在亮周期期间捕获多个数据点。
如图5所示，在vliq信号的符号改变之后的亮周期中的第一数据点522(也称为第一点变化量(fpd))可以低于随后的数据点524。这可能是因为纳米孔(开放通道)中没有标签，因此它具有低电阻和高放电速率。在一些情况下，第一数据点522可以超过如图5所示的vliq电平。这可能是由将信号耦合到芯片上电容器的双层的电容引起的。数据点524可以在发生穿线事件之后捕获，即，标签被迫进入纳米孔的筒体中，其中纳米孔的电阻以及积分电容器的放电速率取决于被迫进入纳米孔筒体中的标签的特定类型。如下所述，由于电荷在c两层424处累积，因此对于每次测量，数据点524可能稍微减小。
在暗周期530期间，施加到对电极的电压信号510(vliq)高于施加到工作电极的电压(vpre)，使得任何标签将被推出纳米孔的筒体。当开关401断开时，因为电压信号510的电压电平(vliq)高于vpre，所以测量节点处的电压增加。在捕获电压数据点之后(例如，在指定时间段之后)，开关401可以闭合，并且测量节点处的电压将再次降低回到vpre。该工艺可以重复以测量多个电压数据点。因此，可以在暗周期期间捕获多个数据点，包括第一点变化量532和后续数据点534。如上所述，在暗周期期间，任何核苷酸标签被推出纳米孔，因此除了用于归一化之外，还获得了关于任何核苷酸标签的最少信息。
图5还示出在亮周期540期间，即使施加到对电极的电压信号510(vliq)低于施加到工作电极的电压(vpre)，也不会发生穿线事件(开放通道)。因此，纳米孔的电阻低，并且积分电容器的放电速率高。结果，包括第一数据点542和后续数据点544的捕获数据点显示低电压电平。
对于纳米孔的恒定电阻的每一次测量，可以预期在亮周期或暗周期期间测量的电压大致相同(例如，在既定ac循环的亮模式下，当一个标签在纳米孔中时进行测量)，但是当电荷在两层电容器424(c两层)处累积时，情况可以并非如此。这种电荷累积可以导致纳米孔单元的时间常数变长。结果，电压电平可以发生偏移，从而导致在循环中每一个数据点的实测值减小。因此，在循环内，数据点可以从一个数据点到另一个数据点有所变化，如图5所示。
关于测量的更多详细信息可见，例如，题为“具有可变电压刺激的基于纳米孔的测序”的美国专利公开号2016/0178577、题为“具有可变电压刺激的基于纳米孔的测序”的美国专利公开号2016/0178554、题为“使用对电刺激的双层响应测量进行无损双层监测”的美国专利申请号15/085,700和题为“双层形成的电增强”的美国专利申请号15/085,713，其公开全文出于所有目的以引用方式并入本文。
4.归一化和碱基调用
对于纳米孔传感器芯片的每一个可用的纳米孔单元，可以运行生产模式以对核酸进行测序。测序期间捕获的adc输出数据可以进行归一化以提供更高准确度。归一化可以考虑偏移效应，诸如循环形状、增益漂移、电荷注入偏移和基线移位。在一些实施方式中，可以将对应于穿线事件的亮周期循环的信号值平坦化，以便为该循环获得单个信号值(例如，平均值)或者可以对测量的信号进行调整以减少循环内衰减(一种循环形状效应)。增益漂移通常会缩放整个信号，并以数百到数千秒的数量级变化。例如，增益漂移可由溶液(孔电阻)的变化或双层电容的变化触发。基线移位发生在约100ms的时间尺度上，并且与工作电极上的电压偏移有关。由于在测序单元中从亮周期到暗周期需要保持电荷平衡，因此可以通过有效整流比的变化来驱动基线移位。
在归一化之后，实施例可以确定用于穿线的通道的电压群集，其中每一个群集对应于不同的标签种类，并且因此对应于不同的核苷酸。群集可用于确定对应于既定核苷酸的既定电压的概率。作为另一个实例，群集可以用于确定区分不同核苷酸(碱基)的截止电压。
iii.自限性孔插入
在孔插入单元的膜后，由于孔的电导相对较高，跨膜电压开始迅速下降。跨膜电压的下降降低了膜中额外孔插入的驱动力。
图6示出用于纳米孔传感器单元的电路图600的实施例，其突出了可以与本文描述的系统和方法相关的传感器单元的各种电压和组件中的一些，例如施加在工作电极和对电极之间的电压(vapp)602、跨双层的电压(vbly)604、用于对工作电极(cdoublelayer)608和积分电容器(ncap)610进行预充电的电压(vpre)606，以及施加于对电极的电压(vliq)612。
本文描述的是利用该特性插入蛋白质孔并控制单孔插入，同时在插入步骤期间没有主动反馈的方法和系统。在该孔插入方法的一些实施例中，经由电容式工作电极施加ac耦合电压，并且通过无孔膜的低电导维持跨膜电压。在一些实施例中，电压可以施加到整个单元的阵列，与孔插入的当前状态无关。在一些实施例中，电压可以施加到具有膜的单元。所施加的电压波形可以作为斜升、作为多个递增步长或设计为产生额外蛋白质孔插入的低概率同时还降低膜损坏风险的其他形状逐渐增加。这可以通过使用小电压步长、电压斜升中的适度电压递增率等限制电压施加瞬变来实现。
例如，在如图7所示的一些实施例中，孔插入电压(vapp)可以作为步进电压波形700施加，其从0mv开始并且每5秒以100mv的递增增加到600mv的最大电压。在一些实施例中，初始电压可以是约0、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100mv。在一些实施例中，步长增加可以是约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300mv。在一些实施例中，每个步长的持续时间可以是约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50或60秒。在一些实施例中，步长可以具有可变的持续时间。例如，在一些实施例中，更低电压下的一些或所有步长可以具有长于更高电压下步长的持续时间。在一些实施例中，最大电压是大约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000mv。在一些实施例中，孔插入电压波形的一个或多个元素可以是预定的，诸如初始起始电压、电压步长增加的大小、每个步长的持续时间和/或最大电压。
在如图8a所示的一些实施例中，孔插入电压可以作为斜升电压波形800施加，其从0mv开始并且以每分钟1v的速率增加到600mv的最大电压。在一些实施例中，初始电压可以是约0、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100mv。在一些实施例中，电压增加的速率是每分钟约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0v。在一些实施例中，最大电压是大约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900或2000mv。在一些实施例中，孔插入电压波形的一个或多个元素可以是预定的，例如初始起始电压、电压增加速率和/或最大电压。
在一些实施例中，孔插入电压波形的一个或多个元素可基于所测量的单元组件的电和/或物理特性来确定，例如膜密封电阻，其是膜跨单元形成密封之后的跨膜电阻。在一些实施例中，与使用在刺激期间进行的测量来改变一个或多个刺激参数的基于主动反馈的方法相反，这些测量可以在施加电压波形之前进行，使得波形在施加之前完全确定。因为本文描述的穿孔方法是自限性的，所以不需要使用涉及测量由孔插入膜中引起的系统或系统组件的电或物理特性的变化，然后调整穿孔电压以防止第二个孔插入膜中的主动穿孔方法。
在一些实施例中，本文描述的方法可以应用于在带有悬浮膜的微孔底部具有电容式电极并在膜的另一侧具有对电极的传感器阵列。传感器可用于在从所有单元移除插入驱动电压施加之后检测孔的存在。尽管可以在施加电压期间检测到孔的存在，但在该方法中不是必需的，并且可以在不对阵列中或聚合中任何单个传感器上的电压施加进行反馈的情况下插入孔。
该方法有效地扫描了克服孔插入激活障碍所需的电压，该电压可能在阵列中的各个膜之间、阵列上的小区域或大区域之间、或在来自一个装置的阵列到来自第二个装置的另一个阵列之间变化。此外，穿孔电压可以在孔突变体之间、膜组成和构象之间变化，包括脂质双层、嵌段共聚物或其他实施方式。通过跨低到高范围扫描或搜索电压，单个电压波形可以足够稳健以有效处理大量不同类型的孔阵列或具有一定变异性的相同类型的孔阵列。
此外，通过从低到高电压进行搜索，更有可能在双层达到损坏膜的临界电压电平之前将孔插入膜中。此外，如图9a和9b所示，一旦孔已插入，孔可以消散跨膜的电压积累，从而降低在孔已插入后进一步增加电压时膜损坏的风险，并且减少额外孔插入的可能性。只要电压步长的大小或电压斜升的增加速率不太大，孔就可以有效地消散跨膜积累的过多电压，从而降低损坏膜的风险并降低额外孔插入的可能性.另一方面，期望增加电压步长的大小或增加电压斜升的增加速率以减少完成穿孔步骤所需的时间。
在一些实施例中，电压波形的上限可以通过比较作为电压和时间的函数的孔插入的动力学和/或概率与作为电压和时间的函数的膜损伤的动力学和/或概率来确定。例如，图10a示出阵列中孔插入的数量作为电压的函数的曲线图，并且图10b示出通常由膜破裂和损坏引起的失活/短路的数量作为电压的函数的曲线图。从这两个曲线图中，可以确定最佳的最大电压，以平衡大量孔插入与少量失活/短路。
在一些实施例中，将孔插入步骤期间溶液中孔的浓度选择为足够低以减少孔被动插入到膜中，同时仍然足够高以允许电压辅助孔插入到膜中。孔被动插入是指孔插入到膜中而没有跨膜施加电压来辅助孔插入。在一些实施例中，通过被动插入插入的孔的百分比小于50％、40％、30％、20％或10％，并且通过电压辅助插入插入的孔的百分比为至少50％、60％、70％、80％或90％。降低被动孔插入的速率可以降低多个孔插入单个膜的可能性。
在一些实施例中，一旦将膜放置在单元上，泄漏电流可导致电压在阵列中的一个或多个单元中积累。这种被捕获电荷在大小上会随着时间并在单元之间变化，因此在诱导穿孔时很难跨越单元的所有膜施加均匀电压。例如，当阵列中的单元中存在不同数量的被捕获电荷时，向所有单元施加均匀电压(vapp)可能导致单元在穿孔步骤期间经历不同数量的有效电压，这可能导致有单个孔插入的单元数量存在高度变异性和/或在一些单元中施加过量电压，从而可能导致对膜的损害。使用步进或斜升电压波形可以解决这些问题。
在一些实施例中，通过使诸如脂质或嵌段共聚物的溶剂和膜材料流过单元的开口，在单元的开口上形成膜。然后，例如，如果使用脂质，则可以通过如美国专利公开号20170283867a1中进一步描述的跨膜施加电压，和/或通过如国际专利公开号wo2018001925中描述的进一步操纵跨膜的渗透压浓度不平衡，将膜减薄成双层，所述专利中的每个全文出于所有目的以引用方式并入本文。如本文所述，减薄的膜是充分减薄的膜(即，例如，厚度小于孔的长度)使得孔可以插入膜中，而未经减薄的膜是具有太大厚度(即，例如，厚度大于孔的长度)以致不允许插入孔的膜。在一些实施例中，在开始穿孔过程并将孔插入膜中之前，可以在阵列中的单元上形成减薄的膜(即，脂质双层)。在其他实施例中，可以通过，例如，对减薄过程和穿孔过程使用相同的电压波形，诸如本文所述的任何电压波形，将减薄膜的过程与将孔插入膜的过程组合起来，并且在组合的减薄和穿孔过程中，可以使孔复合物流过膜。在一些实施例中，可以在膜材料已经被分配到单元上并且跨阵列中的单元形成未经减薄的膜之后应用组合的减薄和穿孔过程，因为在膜材料分配和初始未经减薄的膜的形成期间施加电压可能不均匀地捕获电荷。此外，在组合的减薄和穿孔过程中，可以跨膜建立渗透不平衡。组合减薄步骤和穿孔步骤可以大大减少在阵列中制备孔传感器所需的时间，从而提高传感器阵列系统的通量。
本文所述的方法提供了许多益处，包括提高单个孔插入成功率、降低多个孔插入率和降低损坏膜的可能性。
iv.电压波形的ac调制
在一些实施例中，如图7所示，孔插入波形700可以是具有ac调制的电压波形。如图所示，孔插入波形702是步进的，并且ac调制702分量可以叠加在电压波形700之上以在每个步进电压处提供快速电压波动。电压波动或变化允许在孔插入期间在电穿孔步骤期间施加孔插入波形700的同时进行电测量。这些电测量可用于检查膜完整性(即检测膜失效作为短路条件)、膜泄漏(即膜电阻和/或电导)、孔的插入，并且通常可用于监测电穿孔步骤的进展。在一些实施例中，测量不能在施加电压波形的同时进行，并且在那些实施例中，测量通常在施加电压波形之前、之后或之间进行。将ac调制分量叠加到电压波形允许同时施加电压波形和进行测量。
在一些实施例中，其他电压波形也可以与ac调制分量重叠。例如，可以对膜形成波形进行ac调制，以允许在阱上形成膜的步骤中，在施加膜形成波形的同时进行电测量。这些电测量可用于检查阱是否覆盖有成膜材料(即，检查有无短路情况)、检查膜完整性(即，检测膜失效作为短路情况)、膜泄漏(即膜电阻和/或电导)、膜是否具有适合孔插入的厚度，并且通常可用于监测膜形成步骤的进展。
在一些实施例中，另一种可ac调制的电压波形是可用于将分子转运通过孔的转运电压波形。
在一些实施例中，可以使ac调制分量的振幅最小化以减少ac调制分量对电压波形的主要功能(即，膜形成或孔插入)的影响，同时仍然允许获得准确测量。在膜形成步骤和/或孔插入步骤期间，相对大振幅的ac调制分量可能显著地使膜经受高于预期的瞬态电压，这可能导致例如膜失效或多孔化。因此，在一些实施例中，ac调制分量的振幅可以小于200、190、180、170、160、150、140、130、120、110、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10mv。在一些实施例中，ac调制分量的振幅可以小于被调制的电压波形的振幅的50％、40％、30％、20％或10％。在其他实施例中，ac调制分量的振幅可以随着被调制的电压波形的振幅而缩放。
在一些实施例中，可以使ac调制分量的频率最小化，同时仍然允许精确测量。在一些实施例中，ac调制的频率可以小于采样最大频率的10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、0.5、0.1倍。在一些实施例中，频率为至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000hz。在一些实施例中，频率小于1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20或10hz。在一些实施例中，频率介于10到1000hz之间，或25到750hz之间，或50到500hz之间。
图8b示出图8a中所示的自限性穿孔波形的实施例，增加了用于进行测量的ac调制组件802。在该实施例中，ac调制分量的幅度为100mv，并且在图表上以线的粗细表示。
任何其他电压波形都可以与ac调制组件叠加，以允许在施加电压波形时进行测量。
v.计算机系统
本文提到的任何计算机系统视情况均可以利用任何数量的子系统，其中许多可以是可选的。这种子系统的实例在图11的计算机系统1110中示出。在一些实施例中，计算机系统包括单个计算机设备，其中子系统可以是计算机设备的组件。在其他实施例中，计算机系统包括多个计算机设备，每个计算机设备是具有内部组件的子系统。计算机系统可以包括台式计算机和膝上型计算机、平板电脑、移动电话和其他移动装置。
图11所示的子系统经由系统总线1180互连。示出附加子系统，诸如打印机1174、键盘1178、存储装置1179、监视器1176(其与显示适配器1182联接)等。耦合至i/o控制器1171的外围器件和输入/输出(i/o)器件可以通过本领域已知的任何数量的装置，诸如i/o端口1177(例如，usb、
计算机系统可以包括多个相同的部件或子系统，例如，通过外部接口1181、通过内部接口或经由可移动存储器件连接在一起，该可移动存储器件可以从一个部件连接或移动至另一个部件。在一些实施例中，计算机系统、子系统或装置可以在网络上通信。在这种情况下，一台计算机可视为客户端，另一台计算机可视为服务器，其中每台计算机可视为同一计算机系统的一部分。客户端和服务器可以各自包含多个系统、子系统或组件。
实施例的各方面可以使用硬件电路(例如，apsic或fpga)和/或使用具有一般可编程处理器的计算机软件，以控制逻辑的形式，以模块化或集成方式来实施。如本文所用，处理器可以包括单核处理器、在同一集成芯片上的多核处理器、或在单电路板上或联网的多个处理单元，以及专用硬件。基于本文提供的公开内容和教导，本领域普通技术人员将知道并理解使用硬件以及硬件和软件的组合来实现本发明的实施例的其他方式和/或方法。
可以使用任何合适的计算机语言诸如java、c、c++、c#、objective-c、swift或脚本语言诸如perl或python，使用例如传统技术或面向对象技术，将本申请中描述的任何软件组件或功能实现为由处理器执行的软件代码。软件代码可以作为一系列指令或命令存储在计算机可读介质上，以进行存储和/或传输。合适的非暂时性计算机可读介质可以包括随机存取存储器(ram)、只读存储器(rom)、磁性介质诸如硬盘驱动器或软盘、或者光学介质诸如光盘(cd)或dvd(数字通用光盘)、闪存等。所述计算机可读介质可以是这种存储或传输装置的任何组合。
也可以使用载波信号对此类程序来编码和发送，载波信号适合于经由符合包括互联网在内的各种协议的有线、光学和/或无线网络来传输。如此，计算机可读介质可以使用经这种程序编码的数据信号来创建。以程序代码编码的计算机可读介质可与兼容装置一起打包，或者与其他装置分开提供(例如经由互联网下载)。任何此类计算机可读介质可以驻留在单个计算机产品(例如，硬盘驱动器、cd或整个计算机系统)上或内部，并且可以存在于系统或网络内的不同计算机产品上或内部。计算机系统可以包括监测器、打印机或其他合适的显示器，用于向用户提供本文提到的任何结果。
本文描述的任何方法可以由包括一个或多个处理器的计算机系统完全或部分地执行，该计算机系统可以构造为用于执行步骤。因此，实施例可以针对构造为用于执行本文描述的任何方法的步骤的计算机系统，可能具有执行相应步骤或相应步骤组的不同组件。尽管本文方法的步骤标有编号，但是可以同时或不同时或以不同顺序执行这些步骤。此外，部分步骤可以与其他方法中的部分步骤一起使用。另外，全部或部分步骤可以是可选的。另外，任何方法的任何步骤可以用模块、单元、电路或用于执行这些步骤的系统的其他装置来执行。
在不脱离本发明实施例的精神和范围的情况下，可以以任何合适的方式组合特定实施例的具体细节。然而，本发明的其他实施例可以针对与每个单独方面或者这些单独方面的特定组合有关的特定实施例。
尽管为了清楚理解的目的已经相当详细地描述了前述实施例，但是本发明不限于所提供的细节。有许多实施本发明的替代方式。所公开的实施例是说明性的而非限制性的。为了说明和描述的目的，已经给出了本发明的实例实施例的以上描述。并不旨在穷举本发明或将本发明限制为所描述的精确形式，并且根据以上教导，许多修改和变化是可能的。
当特征或要素在本文中被称为在另一特征或要素“上”时，它可以直接在另一特征或要素上，或者也可以存在中间特征和/或要素。相反，当特征或要素被称为“直接在”另一特征或要素“上”时，则不存在中间特征或要素。还将理解，当特征或要素被称为“连接”、“附接”或“耦接”至另一特征或要素时，它可以直接连接、附接或耦接至另一特征或要素，或者可以存在中间特征或要素。相反，当特征或要素被称为“直接连接”、“直接附接”或“直接耦接”至另一特征或要素时，则不存在中间特征或要素。尽管对于一个实施方案进行了描述或示出，但是如此描述或示出的特征和要素可以应用于其他实施方案。本领域的技术人员还将认识到，提及与另一特征“相邻”设置的结构或特征可以具有与相邻特征重叠或位于其之下的部分。
本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，而并非旨在限制本发明。例如，如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”也旨在包括复数形式，除非上下文另外明确地指出。还将进一步理解，当在本说明书中使用术语“包括”和/或“包含”时，其指定了所规定的特征、步骤、操作、要素和/或组分的存在，但并不排除存在或添加一个或多个其他特征、步骤、操作、要素、组分和/或它们的组。如本文所用，术语“和/或”包括相关联的列出项目中的一者或多者的任何组合和所有组合，并且可以缩写为“/”。
为了便于描述，在本文中可以使用空间上相对的术语，诸如“下方”、“下面”、“低于”、“上方”、“上面”等，以描述一个要素或特征与另外的要素或特征的关系，如附图中所展示。应当理解，除了附图中描绘的取向之外，空间上相对的术语还旨在涵盖装置在使用或操作中的不同取向。例如，如果附图中的装置是倒置的，则描述为在其他要素或特征“下方”或“之下”的要素于是将定向为在其他要素或特征“上方”。因此，示例性术语“下方”可以涵盖“上方”和“下方”这两个取向。可以以其他方式定向该装置(旋转90度或以其他取向)，并且据此解释本文所用的空间上相对的描述语。类似地，除非另外具体地指出，否则“向上”、“向下”、“垂直的”、“水平的”等术语在本文中仅用于解释的目的。
尽管本文可以使用术语“第一”和“第二”来描述各种特征/要素(包括步骤)，但是除非上下文另外指出，否则这些特征/要素不应受这些术语的限制。这些术语可以用于将一个特征/要素与另一个特征/要素区分开。因此，在不脱离本发明的教导内容的情况下，下面讨论的第一特征/要素可以被称为第二特征/要素，并且类似地，下面讨论的第二特征/要素可以被称为第一特征/要素。
在整个本说明书和随后的权利要求书中，除非上下文另外要求，否则词语“包括”和诸如“包含”和“含有”的变型意味着可以在方法和物品(例如，组合物以及包括装置和方法的设备)中共同采用各种组分。例如，术语“包括”将被理解为暗示包括任何所规定的要素或步骤，但是不排除任何其他要素或步骤。
如本文在说明书和权利要求书中所用，包括如在示例中所用，并且除非另外明确地指定，否则所有数字都可以被解读为好像前面有词语“约”或“大约”，即使该术语没有明确地出现。当描述幅度和/或位置时，可以使用短语“约”或“大约”来指示所描述的值和/或位置在值和/或位置的合理预期范围内。例如，数值可以具有为规定值(或值的范围)的+/-0.1％、规定值(或值的范围)的+/-1％、规定值(或值的范围)的+/-2％、规定值(或值的范围)的+/-5％、规定值(或值的范围)的+/-10％等的值。除非上下文另外指出，否则本文给出的任何数值也应当被理解为包括约或大约该值。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“约10”。本文叙述的任何数值范围旨在包括其中所包含的所有子范围。还应当理解，如本领域技术人员适当理解的那样，当公开了某个值时，则还公开了“小于或等于”该值、“大于或等于该值”以及值之间的可能范围。例如，如果公开了值“x”，则还公开了“小于或等于x”以及“大于或等于x”(例如，在x是数值的情况下)。还应当理解，在整个本申请中，数据以多种不同格式提供，并且该数据表示端点和起点以及数据点的任何组合的范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点“15”，则应当理解，大于、大于或等于、小于、小于或等于、等于10和15以及介于10和15之间的值被认为是公开的。还应当理解，还公开了两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。
尽管上面描述了各种说明性实施方案，但是在不脱离如权利要求书所描述的本发明范围的情况下，可以对各种实施方案进行多种改变中的任一种。例如，在替代性实施方案中，可以经常改变执行所描述的各种方法步骤的顺序，而在其他替代性实施方案中，可以完全跳过一个或多个方法步骤。在一些实施方案中，可以包括各种装置和系统实施方案的任选特征，而在其他实施方案中可以不包括。因此，前面的描述主要是为示例性目的而提供的，并且不应当解释为限制在权利要求书中阐述的本发明范围。
本文所包括的示例和图示以图示而非限制的方式示出了其中可以实践本主题的具体实施方案。如所提及的，可以利用其他实施方案并且从中得出其他实施方案，使得可以在不脱离本公开范围的情况下进行结构上和逻辑上的代替和改变。本发明主题的这些实施方案在本文可以单独或共同地由术语“本发明”来指代，这仅仅是为了方便，而并非要在实际上公开了多于一个本发明构思的情况下将本申请的范围主动限制于任何单个本发明构思。因此，尽管本文已经展示和描述了具体实施方案，但是为实现相同目的而计算的任何布置可以代替所示的具体实施方案。本公开旨在覆盖各种实施方案的任何和所有的修改或变型。在回顾以上描述之后，以上实施方案的组合以及本文未明确描述的其他实施方案对于本领域的技术人员将是显而易见的。
本文提及的所有专利、专利申请、出版物和说明书全文出于所有目的以引用方式并入本文。没有一项被认为是现有技术。
- 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞！