非牛顿流体的声学液滴喷射的制作方法

背景技术：

自然界中，许多生物溶液、聚合物溶液和聚合物熔体都是非牛顿流体，许多常见物质例如番茄酱、淀粉悬浮液、涂料、蜂蜜、血液、蛋奶冻和洗发水也是如此。对于牛顿流体，剪切应力与应变速率之间的关系是线性的，比例常数是粘度系数。牛顿粘度定律(一维动量传递)的示例在下面的等式[1]中示出：

对于非牛顿流体的情况，剪切应力与应变速率之间的关系是非线性的，甚至可能与时间有关。因此，不能定义恒定的粘度系数。因此，非牛顿流体被定义为对剪切应力分布(或速度相对于流体传输方向的导数)具有非线性响应的流体。非牛顿流体也被称为粘弹性流体，因为非牛顿流体相对于在沿流体流动方向剪切流体时获得的剪切应力分布具有粘性组分和弹性组分。这些流体用以下等式[2]表征，其中，表观粘度对于非牛顿流体不是恒定的。

存在多种类型的非牛顿流体，例如幂律流体，它们可以是假塑性的，其中η(表观粘度)随着剪切速率的增大而减小(剪切速率稀化)，或者是膨胀性的，其中η随着剪切速率的增大而增大(剪切速率稠化)。非牛顿流体最好通过若干其他流变性质(除测量粘度之外)进行研究，在使用不同的设备或流变仪测量的许多不同的流动条件(例如振荡剪切或拉伸流动)下，所述流变性质与应力和应变速率张量相关。使用张量赋值的本构方程更好地研究这些性质，这在连续介质力学领域是常见的。

可以使用多种技术来实现牛顿流体的快速转移，包括通过声学液滴喷射(ade)快速转移，这例如在rgsteams和saqureshi的“methodforacousticallyejectingadropletoffluidfromareservoirbyanacousticfluidejectionapparatus”，美国专利号9,908,133(2018年3月6日)中进行了描述。然而，在尝试利用ade转移非牛顿流体如聚合物溶液时出现了问题。例如，问题包括聚合物链的明显排列，这在拉伸流动中产生聚合物溶液的硬化作用。

该问题可以细分成一种控制方案，在该控制方案中，人们可以基于溶液中聚合物的浓度以及聚合物自身的尺寸(链长)来研究由粘弹性参数限定的“弛豫时间”。在聚合物溶液的理论中，这些方案具有不同的主要化学相互作用，这些相互作用出现并且可以在不同的物理学中表现出来(例如，可以在高速摄像机上观察到)，并且这些方案的特征在于从稀聚合物溶液到浓聚合物溶液到聚合物熔体的范围。另外，在控制聚合物链与溶剂类型(好，坏，西塔(theta))之间的相互作用和溶液化学等时，溶剂系统具有很大的驱动力。

在特定的应用中，dna溶液可以被认为是非牛顿流体。例如，一种研究dna的实验室方法是在缓冲系统(通常是te、pbs、水等)中提供基因组dna(gdna)，而无需尝试“浓缩”聚合物，从而形成了非牛顿的聚合物-溶剂系统。增加了额外的复杂性，流体的特性可以根据溶液的浓度而变化。对于溶剂系统中的稀聚合物溶液(例如天然gdna)，天然gdna链之间几乎没有相互作用，从而得到可以被建模的并且其特征在于弛豫时间、最大伸展和零剪切粘度的简化系统。在较高的天然gdna浓度下，对此类聚合物-溶剂系统的建模变得更加复杂。现在，弛豫时间变得取决于浓度以及链长，并且指数地增长。尽管增长受到限制，但是最大伸展也与gdna浓度相关联。

概括地说，尽管需要用于dna分析的附加处理方法，但是迄今，表征非牛顿含dna溶液的流体性质的问题太复杂，以至于不能通过ade中的已知技术转移一般的含dna流体。因此，需要能够可再现地、准确地且精确地转移天然gdna和其他粘弹性非牛顿流体的新型的ade方法。

附图说明

将参照附图描述根据本公开内容的各种实施方式，其中：

图1示出了在功率不足和功率较高的条件下执行喷射的液滴喷射装置的一组高速图像。

图2是示出牛顿单音脉冲和非牛顿单音脉冲的声波形的振幅曲线图。

图3a示出了利用第一声学单音脉冲的喷射过程。

图3b示出了利用第二单音脉冲的含有人类天然gdna的溶液的喷射过程。

图4a-4d示出了在gdna浓度增大时来自水和人类天然gdna的混合物的一组声信号波形图。

图5是示出人类天然gdna在牛顿喷射功率方案中和增大的功率方案中的样品转移功效的图像。

图6是示出人类天然gdna在牛顿喷射功率方案中和增大的功率方案中的样品转移功效的图像。

图7是示出基于喷射功率的各种人类天然dna溶液的转移成功率的图表。

图8a示出了使用牛顿喷射功率方案从ade转移的gdna溶液获得的人类天然gdna片段大小和gdna浓度。

图8b示出了使用非牛顿喷射功率方案从ade转移的gdna溶液获得的人类天然gdna片段大小和gdna浓度。

图9是示出一系列dna浓度的交点(cp)的图示，其示出了与手动移液相比通过ade(回波)转移的相对成功。

图10a是gdna样品的分析迹线。

图10b是gdna样品的分析迹线。

图11是示出天然gdna的生物学复本和技术复本的cp与log[dna]的图。

图12是示出图11中所示的cp曲线的cv百分比的图。

图13示出了显示大片段大小的人类gdna样品的分析迹线。

图14是示出一系列生物学gdna复本的cp与log[dna]的图。

图15是示出图14中描述的一系列复本的cp的cv百分比与log[dna]数据的图。

图16a示出了dna样品的分析迹线。

图16b示出了dna样品的分析迹线。

图16c-16f示出了第一、第二、第三和第四人类天然gdna样品的一系列分析迹线。

图17是一系列荧光和荧光导数图，示出了用于评估qpcr反应成功的扩增曲线和熔解研究。

图18示出了人类gdna溶液的液滴形成的时间演变。

图19示出了对于不同的人类gdna溶液样品和不同的尺寸标度的液滴形成的时间演变。

图20示出了在各种声学功率水平处以2种不同的单音脉冲比率转移的液滴。

图21是对于2种不同的单音脉冲比率在递增的喷射功率下将喷射体积与喷射功率进行比较的图表。

图22是在变化的喷射功率下以大滴和小滴两者转移的测得体积的散点图。

图23示出了剪切稀化非牛顿流体的液滴转移成功。注意：使用牛顿参数的转移尝试不会产生ade转移。

图24示出了剪切稠化非牛顿流体的液滴转移成功。注意：使用牛顿参数的转移尝试不会产生ade转移。

图25是示出用于定量评估通过ade的dna转移的稳健性的测试板的布局图的示意图。

图26是示出使用小液滴从图25的测试板转移的人类gdna的ct与log[dna]的图。

图27是示出使用大液滴从图25的测试板转移的人类gdna的ct与log[dna]的图。

图28是示出对于每个给定的起始浓度和液滴计数成功地在期望的斜率处实现线性的功率水平的图表。

图29示出了用于设置液滴喷射参数和喷射非牛顿流体的液滴的第一示例过程。

图30示出了用于设置液滴喷射参数和喷射非牛顿流体的液滴的第二示例过程。

图31示出了用于设置液滴喷射参数和喷射非牛顿流体的液滴的第三示例过程。

图32示出了用于设置液滴喷射参数和喷射非牛顿流体的液滴的第四示例过程。

图33示出了用于使用动态堆分析(dma)来表征非牛顿流体并锁定流体身份的示例过程。

图34示出了用于使用动态断裂分析(dba)来实现声学液滴喷射并锁定单音脉冲参数的示例过程。

图35示出了用于使用动态体积分析来表征由声学液滴喷射产生的液滴的体积并锁定液滴体积的示例过程。

具体实施方式

在以下描述中，将描述各种实施方式。出于解释的目的，阐述了具体的配置和细节，以便提供对实施方式的透彻理解。然而，对于所属领域的技术人员而言还将明显的是，可以以其他配置或者无需具体细节来实践实施方式。此外，可以省略或简化熟知的特征，以便不会使所描述的实施方式模糊不清。

本文所述的技术能够利用声学液滴喷射(ade)技术以高度可再现、高度准确和高度精确的方式转移非牛顿流体的样品(例如溶液中的完整的天然基因组dna或粘弹性聚合物)。

更具体地，本文所述的技术能够使用从声学上合格的微板或管中的孔的声学液滴喷射(ade)技术，转移未处理的、未片段化的、完整的天然基因组dna(通篇称为天然gdna)。当前，许多生物测定工作流程都采用了更传统的方法来转移未处理、未片段化的完整gdna，例如使用基于尖端的系统。这种方法为仅用于研究用途或用于临床诊断应用的将来的实验室设置提供了真正无掺杂、无接触、无触碰的液体转移过程。

本文所述的ade技术的特定改进能够转移具有大片段(>20kb)和/或高浓度(>100ng/μl)的天然gdna样品。以前的ade功能具有局限性，并且对于预期的应用而言，在转移过程之前流体可能具有的与牛顿行为的偏差不能足够准确和精确。例如，当形成纳升级的液滴时，当gdna的长度超过20kb并且浓度超过100ng/μl时，流体的非牛顿性阻碍了声学液滴形成过程。因此，非常需要无需任何操作来减小片段尺寸或物理尺寸或浓度以转移天然gdna的能力，所述操作为例如稀释(例如用缓冲液(tris-edta)、水、其他稀释剂)，添加剂(例如盐、表面活性剂)，加热，剪切，片段化(酶、试剂盒)，缩合试剂(例如离子液体、亚精胺、精胺)或其他形式，从而用于转移无掺杂的并且储存在储存库中的天然gdna样品。此功能将使研究人员和临床医生能够真正地将有限的(通常是珍贵的)天然gdna样品或其他有问题的生物或聚合材料的样品处理(包括纳升级)微型化，以用于生命科学和临床诊断应用。此外，这项新功能允许自动化平台工作流程中的较少的步骤，并且甚至减少利用多个不同的自动化液体处理平台或设备来执行上游步骤的需求。

本文所述的技术允许用户从“纯净”无掺杂形式的提取的天然gdna进行工作，并且声学转移较小体积(几纳升或几十纳升)以实现所需的下游生物学测定。也可以利用以下事实转移较大的体积：由于新型声学液滴转移过程是通过多次较小体积样品转移而实现的，而所有这些较小体积样品转移都是高度可再现、高度准确和高度精确的，因此在转移体积的范围内，新型声学液滴转移过程仍然是可再现、准确和精确的。在本文档中，从高速摄像机(visionresearchinc.,phantom)、吸水纸(syngenta)获得的实验结果以及定量pcr(qpcr)(roche和thermofisher)实验结果证明了按照本文所述技术转移的天然gdna的能力、质量和数量。所有已转移样品的可再现性、准确性和精确性都很高，并且对于所述的利用持家基因的qpcr分析，由cp或ct的低变异系数(cv)定量地证明了所有已转移样品的可再现性、准确性和精确性。cp或ct表示dna由此被扩增的交点阈值，并且表示“拐点”在扩增曲线的吸收部分中的值。这是分子生物学家定量研究测定中存在的dna量所关注的有价值的量度。

此外，由于非牛顿声学转移过程的低剪切速率，因此在转移至目标容器例如孔或管后，gdna仍保持完整，在目标容器处将gdna进一步用于下游过程，例如ngs。

下文参照附图详细描述具体实施方式。

根据本发明的至少一个实施方式，公开了一种新型喷射单音脉冲(参见表1和图1)，其与非明显的喷射功率范围(参见图2)协同工作。通常，与牛顿流体一样，正确喷射功率(与标准水性缓冲液牛顿单音脉冲结合)的确定由产生的标记(特征声学反射)确定，并与堆图像信号处理(确定零空间)相关联，例如在美国专利号9,908,133中描述的方法，该专利出于所有目的通过引用并入本文。对于以1-3db的喷射能量(相对于要转移的喷射阈值定义的)进行的声学液滴喷射而言，牛顿流体的堆图像打印(mip)结果产生了高度可再现、高度准确和高度精确的样品转移。该过程用于确定从流体储存器例如牛顿流体的孔或管中喷射液滴的功率要求。在非牛顿流体的情况下，当流体经受拉伸流动时(如在ade过程中)，其理化性质会明显不同。此外，由于在低剪切值下出现与信号处理有关的扰动，因此mip结果不能区分这些差异。因此，在此信号处理步骤中依赖mip指示正确的喷射以转移能量，因为它表现出与牛顿流体的差异不够，在一些情况下，建议对声学液滴喷射用1db喷射功率，该功率对液滴形成无效，以补偿由于提高的声功率而在增加的剪切速率下出现的与牛顿行为的较强偏差。可以使用新的单音脉冲与新的喷射能量方案(通常比喷射阈值高约6-11db)的结合来实现非牛顿流体的基于ade的转移。下面针对1db(牛顿ade情况)至6-11db(正确或非牛顿ade情况)与新的单音脉冲的结合，显示了三种类型的完整gdna样品的结果。

图1示出了在功率不足的情况下(左-102、104、106)和在功率较高的情况下(右-108、110、112)产生成功的ade的液滴喷射装置的一组高速图像100。该图说明了出于ade目的将非牛顿流体视为牛顿流体的不足。根据本发明的实施方式，响应于检测到要通过ade方式转移的流体是非牛顿流体，ade系统采用增大的功率条件来补偿测试储存器中溶液的非牛顿特性。在图1的情况下，使用了非牛顿gdna溶液。以49μs的曝光时间以每秒20,000帧捕获图像。从声学管喷射3种不同的天然gdna样品。从上到下，样品是从商购获得(102,108)和从商购获得(104,110)，而人体样品是使用rochemagna提取的(106,112)。所有样品均>20kb和/或高浓度>100ng/μl。

表1：流体喷射的单音脉冲特征

表1示出了用于成功ade的牛顿流体校准和非牛顿流体校准的单音脉冲段长度的比较结果。通过修改echo声学液滴喷射器，执行对如本文所述的非牛顿样品的成功的ade。该牛顿单音脉冲在labcyteecho525液体处理器上稳健地转移25nl牛顿流体(通常用于缓冲液或水溶液)。非牛顿单音脉冲用于在labcyteecho550/555上转移大于100ng/μl的浓度的较长(>20kb)的天然gdna。图2示出了声学振幅图200，图200示出了牛顿单音脉冲201和非牛顿单音脉冲202的声波形。

生物流体——包括完整的天然gdna或粘弹性聚合物溶液和熔体——通常将显示出对剪切应力分布的非线性响应，作为应变速率的函数，并且是期望用ade进行操作的非牛顿流体的公知的示例。这些流体样品是复杂的大分子溶液，其性质通常难以用mip来表征先验特征。实际上，储存器(例如声学合格的微孔板或声学合格的管)内的牛顿流体和非牛顿流体当使用标准声学回波被询问时在信号处理和ade过程所需的感知能量上几乎没有差异。粘弹性质表现为喷射能量，因此(由具有适当能量的堆产生的)液滴不会被夹断。结果是液滴返回堆，并“回弹”至孔或管中的样品的储存器。在天然gdna的情况下，溶液在一些情况下可以“拉伸”多至1cm(或更大)的长度，而不会使液滴断裂。施加的能量越高，导致聚合物gdna链的排列就越紧密，从而使液滴断裂变得更加困难。类似的是当您拉伸橡皮筋时橡皮筋的伸展，聚合物链进一步排列，变得甚至更难拉伸。此外，非牛顿流体的增加的粘弹性对液滴断裂期间的力的平衡产生不利影响，并且本文所述的新方法已经显示出能够对非牛顿流体实现高度可再现、高度准确和高度精确的声学液滴喷射。

图3a示出了使用水的喷射过程，该过程利用了650mv的声学单音脉冲电压，并且在单音脉冲之后的1400μs的时间处进行了光学选通。图3b是具有以下单音脉冲特性的天然gdna的喷射过程的频闪图像：单音脉冲段1的长度＝275μs，单音脉冲段2的长度＝130μs，单音脉冲段3的长度＝100μs，单音脉冲段1的cf＝5.85mhz，单音脉冲段3的cf＝5.15mhz。声学单音脉冲电压为1100mv，具有相同的牛顿单音脉冲段长度。在施加单音脉冲后约5000μs的时间处捕获图像。喷射单音脉冲产生前导瓣301(图3a、3b)，该前导瓣延伸远离储存器，并由长丝303与流体的其余部分连接。值得注意的是，在天然gdna的情况下，dna聚合物链以如下方式排列：拉伸流动将dna置于“伸展”构型，并随着施加更多的能量而继续伸展(参见图3b)。此外，随着施加更多的能量，将产生更长的天然gdna线(许多mm)，而没有分离的液滴。声学功率为1400mv(比喷射水的声学功率高约6db)时，仍然没有液滴分离。还应该注意的是，对于这些粘弹性流体，通常的mip测量会产生预测的喷射功率，如果天然gdna中不存在粘弹性并且链在接近液滴断裂之前未显著排列，则该预测的喷射功率将是适当的。因此，基于mip的结果无法捕获粘弹性现象的全部影响。

在对充满流体的孔或管进行正常的声学检查时，将声换能器定位在感兴趣的孔下方。水或另一种耦合流体弥合了换能器与储存器底部(例如微孔板的底面或管底部)之间的间隙。声信号从换能器传播，经过耦合流体，经过孔或管的塑料底部膜，进入流体，最后传播到上方的空气中。声信号在这些接口的每一处反射，并由发出原始信号的同一换能器收集。初始波形不与反射信号重叠。在被称为“堆图像打印”(mip)的过程中，从反射信号中提取有关流体特性的信息。在增加gdna浓度的情况下(如图4a-4d所描绘的)，mip结果显示纯缓冲液条件(1xpbs)直至100ng/μl的天然gdna浓度之间都没有差异。具体地，图4a包括示出来自不含天然gdna的水的声信号波形图的图表400a；并且图4b、图4c和图4d分别包括示出来自含有50ng/μl(400b)、120ng/μl(400c)和160ng/μl(400d)的天然gdna的水的声信号波形图的图表。在高于100ng/μl的天然gdna浓度时，存在毛细波，该毛细波表现为表面扰动共振，这实际上表明液滴断裂所需的能量较低。

根据当前公开内容，将替选的喷射单音脉冲或声波形应用于非牛顿流体，例如包括在诸如孔或管的储存器内的天然gdna(参见图2)。将声换能器定位在储存器下方，并聚焦在孔或管内所含流体的表面处。到达流体表面、扰动表面并使液滴断裂所需的单音脉冲的振幅被确定成与牛顿流体(例如，水或1xpbs)显著不同。在将振幅在1-3v范围内的喷射单音脉冲施加至填充有水或1xpbs的孔时，在表面处会出现流体破裂，并喷射出液滴。对于用牛顿类流体操作的ade过程而言，这是预期行为和正常行为。

如图5和图6所示，可以使用echo550/555液体处理器通过在不同功率下进行样品液滴测试来实验性地证明声学喷射的功效。图5示出了可视的/定性的用于使用增大的功率、+0db(左)和标称功率+2.0db(右)进行转移以转移100ng/μl的150kb天然gdna的单个2.5nl样品液滴测试。图6示出了对40kb天然gdna的人体样品的ade转移的视觉测试。水敏纸左半部分上的功率为+0.0db，水敏纸右半部分上的功率为+8.0db。在384个位置中的每个位置处，尝试一次转移2.5nl。当含水流体与纸张接触时，随着水敏纸的颜色从黄色变为蓝色，点的存在或不存在分别指示成功或失败的液滴断裂事件。

以两种方式尝试了高粘弹性的天然gdna溶液(图5中的人体样品和图6中的商业上可获得的天然gdna样品)。首先，我们使用牛顿单音脉冲和能量转移分布(502、602-图的左侧)，然后使用非牛顿单音脉冲和能量分布(504、604-图的右侧)。明显地，使用牛顿分布，天然gdna的液滴没有被转移，并且在非牛顿分布的情况下，由显示蓝点的水敏纸指示了成功的转移。这是定性测量，并且失败的转移具有空白区域，在该空白区域预期会出现蓝点。图5展示了天然gdna的人体样品，图6展示了商业上可获得的样品。

接下来，随着功率的增加，成功转移的数量也增加(参见图7)，这表明“正常”参数空间未包括成功或可再现的成功(稍后将用qpcr结果进行展示)。在标准喷射阈值之上约6db-11db处的成功转移平台期的增加突出显示了一种适用于非牛顿粘弹性流体与新型非牛顿单音脉冲的结合的新型工作方案。如图7中突出显示的那样，用于牛顿流体的正常参数是不够的。这是代表对于非牛顿流体成功进行液滴喷射所需的最小能量的设置。转移成功率以样品(702)、人gdna样品(704)和样品(706)的转移百分比示出。

图7示出了基于喷射功率来确定各种dna溶液的转移成功率的经验方法。当液滴声学地喷射并到达目标板(或如图5和图6所示，附着到目标板的水敏纸)时，定义为成功的转移。根据添加到mip溶液的功率来绘制成功的转移。mip特征已打开，并在该实施方式中用于说明样品填充高度的变化。所有转移均使用固定标记或1.48mrayls的阻抗值执行。

理想的是，在生物学分析和工作流程中，将天然gdna用作起始输入材料。通常，然后对天然gdna进行处理或制备用于下游应用。例如，可以将天然gdna片段化成较短的片段，以用于下一代测序(ngs)应用。当前的先进ade技术可以可再现地、准确地且精确地转移高达100ng/μl的浓度20千碱基(kb)或更短的天然gdna片段，因为与牛顿行为的偏差足够小，以允许在施加预测的更高功率时，仅仅通过形成堆而准确预测喷射功率，所述堆将导致液滴从储存器的稳健断裂。天然gdna的尺寸(以天然gdna片段的平均长度衡量)和浓度都是具有影响可再现ade的能力的已知参数，因为两者均会单独地或组合地导致与牛顿行为的偏离。在图8中突出显示了对多种天然gdna样品的研究结果。图8a展示了可以(利用牛顿参数用于单音脉冲和喷射能量)可再现地、准确地和精确地声学转移小于20kb的天然gdna。此外，用牛顿参数已成功转移了高达100ng/μl的较低浓度。图8b展示了可以利用非牛顿参数可再现地、准确地和精确地转移较大尺寸(高达150kb)的天然gdna和较高浓度(高达200ng/μl)的天然gdna，从而显著拓宽可以通过ade声学访问的天然gdna尺寸和gdna浓度的在二维空间中的包络。

图8a和8b是示出gdna浓度与片段长度的散点图。在功率不足的情况下和牛顿单音脉冲功率下获得了失败的(802)、部分的(804)和成功的(806)转移。在功率较高的条件下并使用非牛顿单音脉冲，均匀地获得了成功的转移(808)。通过qpcr测量声学转移(随后进行进一步分析)。该图用于展示片段尺寸和天然gdna浓度的在二维空间中的较大包络。

本文所述的方法能够从声学合格的管中高度可再现地、高度准确地和高度精确地转移片段尺寸大于20kb且体积浓度大于100ng/μl的天然gdna(但是也可以从在微板、储存器等中的声学合格孔执行)。在不使一个容器与另一个容器物理接触的情况以如此小的体积(2.5nl)转移高浓度天然gdna的较长片段，为使过程微型化的临床应用(诊断)提供了突破性的功能，从而允许用户事半功倍而无需担心对转移设备的交叉污染或粘合或试剂。这些方法可以促进用于新的测定开发和微型化的工作流程，从而为研究和临床实验室提供了机会。通过利用声学管和其他储存器来转移gdna，工作范围可以大大增加至150kb及以上并且高达750ng/μl及以上。

为了定量评估gdna转移，然后利用定量聚合酶链反应(qpcr)来确认和检测持家基因贝塔肌动蛋白(β-actin)的表达。使用β-肌动蛋白正向引物agccatgtacgttgctatcc、β-肌动蛋白反向引物cgtagcacagcttctccttaat，(idt)进行qpcr测定。使用roche系统或thermofisherquantstudio6flex实时pcr系统进行测定。roche系统采用480sybrgreenimaster(roche)、480多孔板384(roche)、480ii仪器(roche)。按如下步骤使用qpcr程序：步骤1，在95℃下60秒；步骤2，在95℃下15秒；在60℃下30秒；在72℃下60秒，单次采集(45个循环)；步骤3，在95℃下10秒；在60℃下60秒，并且在97℃下连续。thermofisherquantstudio6flex实时pcr系统采用powerup^tmmastermix、thermofisher384孔透明光学板。按如下步骤使用qpcr程序：步骤1，在50℃下2分钟；在95℃下2分钟；步骤2，在95℃下15秒，在60℃下1分钟，采集(40个循环)；步骤3，在95℃下15秒，在60℃下1分钟，在95℃下15秒。

使用牛顿校准用于片段化gdna的ade并且将其与手动移液片段化gdna进行比较的对照数据。

通过使用超声发生器(covarisultrasonicatortechnology)剪切(至8kb)，将从商业上获得的人类天然gdna(56kb)片段化，并且手动移液到声学合格的管中。使用初始以100ng/μl为最高浓度的8kb片段创建8点两倍标准曲线。对于每个标准曲线点，转移了32个技术复本，并通过qpcr进行了测定，如下所述：

表2：片段化的8kbgdnapromega商业上可获得样品的qpcrcp结果

对于每个标准曲线点，转移了所有32个复本。将实验结果制成表格，并构成表2中所述的值。对于每个dna浓度，确定平均交点(cp)值以及cp的标准偏差、cp的cv百分比、最小cp和最大cp以及复本数量。这些结果用作对照实验组，展示了利用牛顿参数的声学转移过程(对于较小尺寸的片段化gdna)的预期偏差以及与手动移液对照实验能力的比较结果。

图9是使用转移生成的标准曲线图，其指示了较高的线性度，对于利用标准ade技术的转移而言，由r²值≥0.99突出显示；对于相同片段化gdna样品的手动移液管转移而言，由r²值为约0.98突出显示。具体地，图9示出了剪切的8kb样品的所有技术复本(n＝32)的cp与log[dna]。以cv百分比显示的ade转移精确度小于2％。这组实验用作“预期的”结果质量的基准。注意，虽然仍然可以接受，但是手动移液对照结果的线性度比ade结果的线性度低。

使用来自商业上可获得的来源的未经处理、未片段化的、完整的天然gdna并且利用非牛顿校准的实验数据。

下一步是利用来自两个商业来源和的片段尺寸分别为40kb和56kb的天然gdna测试非牛顿粘弹性流体的新确定的参数空间(单音脉冲和喷射能量方案)。根据本文所述的技术，将这些样品手动移液到声学合格的管中，以准备用于转移。使用aati片段分析仪(aati,ames,ia)对这些样品进行分析，以确定并确认片段尺寸。实验结果示于图10中，图10突出显示了这些样品的长度实际为41kb和56kb。接下来，将非牛顿单音脉冲和更高的能量校准应用于对天然gdna(无掺杂)使用echo550液体处理机的ade转移。源管中每个天然gdna样品的浓度为200ng/μl(也利用nanodrop仪器(thermofisher)确认，结果未显示)。转移到目的板中的体积范围是从2.5nl至320nl(1滴至128滴)，该目标板也用作qpcr测定的源板。为了解决每种生物样品的再现性、准确度和精确度，在每种实验条件下转移了32个技术复本(以例示统计意义上的显著性)。此外，为了确认结果的有效性，这些实验在多天中重复进行。表3、图11和图12示出了cp值，并突出显示了使用针对非牛顿流体的这种新校准的高度可再现、高度准确和高度精确的转移能力的有效性。对于所有转移，除了promega第1天和第2天之外，转移的复本数量为32，其中promega第1天的转移体积为5nl，promega第2天的转移体积为2.5nl。对于所有其他样品，转移了所有32个复本。使用转移生成的标准曲线的线性度均具有≥0.99的r²值。所有转移的cv百分比均小于5％(大多数情况下<3％)。

图10a和图10b示出了(40kb)样品(图10a，图表1002)和(56kb)gdna样品(图10b，图表1004)的aati片段分析仪迹线，突出显示了样品的实际尺寸与商业供应商指示的相同。这些样品的qpcrcp数据在下表3中示出。

表3：天然(40kb)和(56kb)样品的qpcrcp数据

图11示出了针对天然gdna(n＝26-32)的生物复本和技术复本通过cp与log[dna]测量的qpcr数据，并且图12示出了针对表3中所述的所有生物复本和技术复本的cp的cv百分比与log[dna]。图11中的r²值>0.99展示了高线性度。此外，图12中每个实验运行浓度下复本的低cv值显示了较高的精确度和可再现性。

使用来自人体样品的未经处理的、未片段化的、完整的天然gdna并利用非牛顿校准的实验数据

接下来从声学合格的管中转移来自全血的六份人体样品的天然gdna，这些样品的片段尺寸均大于15kb，最大片段群体为约150kb(图13)。确定源管中每个天然gdna样品的浓度在100ng/μl至175ng/μl之间(如通过nanodrop验证的，结果未显示)。将1滴(2.5nl)至128滴(320nl)范围内的体积转移到qpcr源孔中以加载反应。为了解决精确度，对于每种生物样品，每种条件均转移了10个技术复本。鉴于gdna样品的量有限，实验仅进行了一次，但是预计不会有所不同。表4、图14和图15展示了cp值，并再次突出显示了人类天然gdna样品转移的高精确度、高准确度和高可再现性。对于所有样品，所有10个复本均以100％的成功率转移，没有脱落(0％的脱落率)。使用转移生成的标准曲线的线性度均具有0.999的r²值。所有转移的cp的cv百分比均小于2.5％。

表4：6个人类天然gdna样品的qpcrcp数据

图13示出了对于展示较大片段尺寸的人类gdna样品的aati片段分析仪迹线1300。图13中评估了该样品的gdna尺寸，并确认其具有较大片段尺寸。图14示出了针对如表4中所述的所有生物复本和技术复本的通过cp与log[dna]数据1400测量的qpcr数据。转移结果展示了6种不同人类gdna样品的r²值>0.99的高度可再现的转移和高度线性的转移。图15示出了如表4中所述的所有人体样品的生物复本和技术复本的cp的cv百分比与log[dna]数据1500。所有生物复本和技术复本的转移的cp的cv为3.2％或更低。

转移前和转移后分析

基因组dna样品完整性是许多生物学应用、工作流程，尤其是gdna存储装置和储存库的关键问题。在各部分中突出显示的数据证实，通过用新型单音脉冲和声能范围的ade转移的天然gdna以及所转移的gdna可以在qpcr测定中成功扩增，以评估质量。为了进一步评估转移的天然gdna的特性，使用aati片段分析仪(aati)对转移后的样品进行分析，以确定并确认片段尺寸，并且天然gdna保持其完整性(具有最小的剪切)。图16a-16f和表5均示出了人体样品和从和商业上可获得的人类天然gdna样品的aati片段分析仪迹线。

这些样品中的每一个的aati迹线示出了gdna尺寸的微小增加(在技术的实验误差范围内)或转移后条件的较小的向下位移，表明可能存在少量剪切。然而，在所有情况下，这些样品中的任何一个的转移后gdna均大于20kb，这是牛顿单音脉冲和声能转移能力的极限。aati仪器也具有±25％的dna定量准确度和20％cv的dna定量精确度。此处呈现的所有数据均落在这些规格之内。此处生成的数据代表较大片段gdna，并且在下表5中示出，表5示出了手动移液(对照)的商用和人类天然gdna样品相比于利用新型声学非牛顿参数转移前后的相同样品的片段尺寸(kb)。

表5：商用和人类天然gdna样品的片段尺寸(kb)。

对于每种选定类型的gdna样品，针对手动移液(下–1603a–1603f)、转移前(中–1602a–1602f)和转移后(上–1601a–1601f)的aati片段分析仪迹线(图16a-16f)中显示了片段特性。图16a示出了biolinegdna样品的迹线。图16b示出了promegagdna样品的迹线，并且图16c-f示出了人类天然gdna样品样品1(图16c)、样品2(图16d)、样品3(图16e)和样品4(图16f)中的每一个的迹线。

熔解曲线分析

成功的qpcr反应不仅基于dna扩增，而且还基于熔解曲线分析。在qpcr反应期间，随着扩增子的产生，荧光sybr绿色染料结合到双链dna(dsdna)，并且这些复合物发荧光，产生荧光信号和特性扩增曲线。扩增曲线由3个阶段组成：起始阶段、指数阶段和平台阶段。起始阶段几乎总是低于荧光检测水平。在指数阶段，产生新合成的dsdna拷贝，因此由sybr染料结合到dsdna时的荧光增加来表示。最后，平台阶段指示反应结束，也称为稳定阶段。

每个特定的扩增子具有特性扩增曲线。随着扩增出现，记录qpcr循环的次数，以便利用指数阶段中称为循环阈值(ct)或交点阈值(cp)的阈值来评估出现扩增的水平(参见图17，曲线图1702)。将扩增曲线绘制为交点(cp)——也称为循环阈值(ct)或循环次数的函数。循环次数(ct或cp)越低，初始dna量就越高。循环次数(ct或cp)越高，初始dna量就越低，这意味着随着每次循环的dna浓度增加，需要更多的循环。为了确保qpcr反应的特异性，还进行了熔解曲线分析，以测量扩增子从dsdna解离为单链dna(ssdna)的温度。在扩增之后，将双链的sybr绿结合的扩增子暴露于逐渐升高的温度(曲线图1704)。当温度高于引物的熔解温度时，扩增子解离并且sybr绿荧光信号降低。然后将该曲线的斜率绘制为温度的函数以产生熔解曲线，这是本领域大多数研究人员所使用的分析(图17，曲线图1706)。

在本文所述的所有研究中，β-肌动蛋白扩增子为266个碱基对(bp)，并且具有88±1℃的熔解峰温度。从100ng/μl到0.78ng/μl范围内的阳性对照8点2倍稀释标准曲线分别显示扩增子cp/ct在从20至32的范围内。

本文所述的技术可以应用于多种样品类型和样品转移方案。例如，在许多研究和临床实验室中，基因组脱氧核糖核酸(gdna)从新鲜样品和已存档的样品两者中提取，样品包括但不限于细菌、病毒、植物、全血(wb)及其成分(血浆、血清)、组织、福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)组织、细胞、唾液(口腔)、尿液和脑脊液(csf)。

本文所述的技术可用于需要较高样品完整性(例如，来自生物存储装置或储存库的样品)的任何dna技术应用，其中完整的天然gdna需要由液体处理机处理以用于下游应用。由于dna是生命的基本构成单元，因此其应用范围很广，并且可以用于临床/诊断应用、医学研究、医学疗法、药物/生物技术研究应用、农业应用和法医学。

本发明的一些实施方式使得能够实现先前不能通过ade获得的聚合物溶液和粘弹性聚合物熔体的高度可再现、高度准确和高度精确的声学液滴喷射。过去，降低粘度和降低弹性的方法(例如，加热和用溶剂稀释聚合物熔体或聚合物溶液样品)表现出一定程度的成功，并且涉及改变天然样品并可能(经由热失活或溶剂驱动的降解)损害样品。本发明的一些实施方式具有解决半导体应用(诸如光致抗蚀剂的沉积)的潜力，或使聚合物样品和聚合物熔体的研究小型化的能力。此外，还可以启用药物递送应用，因为可以将较高剂量的“定时释放”药物掺入聚合物溶液中，然后将其转移至接收器中，从而以均匀分散球体形式形成超分散的“负载”药物递送剂，其具有最高表面积与体积比的以最有效地递送药物。

图18示出了表现出剪切稀化行为的非牛顿液体的液滴形成的时间演变。流体包括来自的gdna。需要注意，与具有类似粘度的牛顿流体相比，在释放液滴之前需要较长的长丝形成和较长的时间尺度。本公开使得长丝的头部能够以稳健的方式破碎成液滴，这意味着这些液滴的体积是一致的，并且长丝退回至储存器而不会进一步破碎(链上的珠可再现地缩回)。这是在我们的echo550和echo555仪器上使用换能器执行的，该仪器产生2.5nl的液滴(较高的频率，较短的波长)。此处的液滴尺寸估计为约2.5nl。这些方法可以与任何合适的非牛顿流体一起应用，尤其是标准核酸洗脱缓冲液，例如但不限于水或te。

如图18所示，将声能施加至流体表面1802通过产生堆1804来诱导液滴喷射，该堆进一步发展成前导瓣1806和长丝1808。在现有的ade方法中，声能提供了一部分动量，该动量迫使流体离开流体表面；但是对于非牛顿流体而言，这些方法往往会产生瞬态瓣，该瞬态瓣容易与流体表面1802分离或者被重新吸收。根据本文所述的用于喷射非牛顿流体的液滴的实施方式，初始单音脉冲产生伸长的长丝1808，长丝1808包含从流体表面1802升高的流体的大部分。一些非牛顿流体在被吸入到伸长的长丝1808中时，还沿着长丝产生一系列流体的积聚物或珠1810，积聚物或珠1810可以由1、2、5、10或更多个珠构成，其中，在伸长阶段期间，在所得到的液滴的50％、75％或90％的情况下，珠的尺寸可以在厚度大于长丝的直径10％、20％或50％之间变化。当传统的ade方法以较低或标准的牛顿流体喷射振幅应用于非牛顿流体时，长丝1808的有效弹性往往会阻止液滴喷射。相反，当以非常高的振幅应用传统的ade方法时，长丝1808将往往会在珠1810之间断裂，从而导致多个较小的液滴的不可预测的喷射。这种效果不仅对于失去液滴喷射体积的控制是不希望的，而且因为伸长的长丝1808的突然分离可能会剪切流体的dna或其他内容物。相比之下，本文所述的方法提供了液滴1812与伸长的长丝1810的其余部分1814之间的清晰分离。在一些实施方式中，当长丝1810与液滴直径相比非常长时，可能出现液滴1812的分离。在一些实施方式中，对于长丝长度为喷射的液滴直径的超过2倍、超过5倍、或超过10倍、或超过20倍、或超过50倍、超过100倍或甚至更大，可能出现分离。在一些实施方式中，在长丝缩回期间，珠可以彼此组合或聚结到退回的其余部分1814中，因此，当珠朝向弯月面退回时，珠的数量将减少并且合并的珠的尺寸将增大。在一些实施方式中，分离时液滴1812的体积可以显著小于长丝1810内所包含的体积，例如，其直径小于流体长丝1810的长度的10％。在一些实施方式中，包含在喷射液滴1812中的体积可以小于其余部分1814的体积的50％，小于10％或小于5％。

图19是示出对于不同的dna溶液和不同的尺寸标度的液滴形成的时间演变的示意图表1900。此处，流体来自并在echo525仪器(比echo550或echo555仪器更低的频率和更大的波长)上进行转移，使得标称液滴尺寸为25nl。如图19所示，对流体表面1902施加声能也通过产生堆1904而使液滴喷射，该堆进一步发展成前导瓣1906和长丝1908。初始单音脉冲生成伸长的长丝1908，长丝1908包括从流体表面1902升高的流体的大部分。响应于另外的单音脉冲，液滴1912和伸长的长丝1910的其余部分1914彼此分离而不发射任何小的液滴。在一些实施方式中，液滴1912可以显著小于长丝1910，例如，其直径小于流体长丝1910的长度的10％。在一些实施方式中，喷射液滴1912中包含的体积可以小于其余部分1914的体积的50％、小于10％或小于5％。

根据一些实施方式，如本文所述的单音脉冲包括3个段。在产生2.5nl非牛顿流体液滴的一个实施方式中，段1最长且强度高，随后是其中不产生声能的短暂段2，然后是中间持续时间的最终段(3)(此段为18微秒)。注意，通过调整功率强度和各个段的长度，可以实现液滴喷射。如图20和图21所示，单音脉冲a和单音脉冲b两者的功率水平都需要远远超过牛顿流体的功率水平，以实现稳健的体积转移，并使长丝可再现地缩回到储存器中(避免产生小附随液滴)。下面在表6中列出了单音脉冲特性。

表6：非牛顿流体的单音脉冲

图20示出了针对单音脉冲a(2002)和单音脉冲b(2004)在各种声功率水平(以db示出，从左向右增加)处利用这些单音脉冲转移的相同非牛顿流体的液滴。在较低水平下，液滴不会从长丝中释放出来。在较高水平下，只有液滴转移并具有良好的位移(分别为8db和10db)。在更高水平下，转移质量下降，并且长丝分解成不止单个期望液滴。任何附属液滴或附随液滴都是不希望的。如图18和图19的草图所示，单音脉冲和功率的优选实现是形成期望体积的单个液滴并使长丝缩回到储存器中的实现。

图21还在图表2100中示出了在比较喷射体积与喷射功率的情况下，转移的体积如何随着增加的声功率变化。在一些实施方式中，体积对功率曲线的较低斜率是期望的(例如，参见单音脉冲a2102与单音脉冲b2104的体积对功率曲线)，从而降低了对转移液滴体积上的功率的灵敏度。可以对每个段的单音脉冲相对振幅、持续时间、频率组成的调节进行修改，以改善液滴体积特性的灵敏度特性。图22示出了在变化的喷射功率下对于大液滴(2202)和小液滴(2204)的流体转移的测量体积的散点图2200，并且它们的相关联的体积与功率灵敏度相关。

图23-24示出了本发明的其他具体实施方式，这些实施方式应用于其非牛顿行为不是阴离子型的并且不是由于核苷酸聚合物如dna引起的流体。一个示例是用于被称为剪切稀化流体(图23，图像2300)的另一类非牛顿流体，并且另一个示例是用于剪切稠化流体(图24，图像2400)。图像2300(图23)示出了由氨基酸赖氨酸溶液、25％聚-l-赖氨酸水溶液(体积％)组成的阳离子均聚物的成功液滴，该均聚物是剪切稀化的。图像2400(图24)示出了5％玉米淀粉水溶液(体积％)的成功液滴转移，该溶液是剪切稠化的或者是由胶态悬浮液组成的膨胀性流体。2302和2402清楚地示出了适用于每种流体类型的功率窗的存在。然而，根据本文所述的方法，可以通过ade处理许多其他类型的流体，溶质类别和非牛顿类别。例如，可以使用所公开的方法转移的合适的非牛顿流体包括但不限于阳离子型、阴离子型、核苷酸型和肽溶液、悬浮液、胶体、膨胀体和其他流体。

图25-28示出了又一种含dna流体的数据，通过对从多个不同孔转移的并通过qpcr测量的dna进行定量来显示该方法的稳健性。测试板的布局图在图25中示出，并且使用较高和较低的声频率两者分别针对一定浓度范围的dna溶液产生小液滴和大液滴，并且在每个孔中收集到不同数量的液滴。图26和图27示出了：对于一些功率水平，响应的非常可重复性的和非常线性的，其中，图26示出了小液滴的ct数据2600，图27示出了大液滴的ct数据2700。喷射单音脉冲振幅在约6db(2601、2701)至约11db(2602、2702)的范围内变化，以半db为步长。注意，y轴为ct，即qpcr仪器中将dna扩增至特定阈值水平所需的循环数。因此，较低的ct对应于更多的初始起始dna浓度。在我们的起始浓度和液滴计数的预期斜率处实现线性的功率水平在图28的表上突出显示。对于小液滴尺寸2802和大液滴尺寸2804都是可重复的并且是线性的，并且即使对于较大的gdna(68kb)和较高的gdna浓度(105ng/μl)，也可以在一定功率水平范围内获得结果。

图29-31示出了用于设置液滴喷射参数和喷射非牛顿流体的液滴的示例过程。过程2900、3000、3100和3200以及本文所述的任何其他过程可以通过如本文所述的任何合适的声学液滴喷射系统来执行。

图29示出了根据至少一些实施方式的用于根据动态堆分析(dma)技术设置液滴喷射参数以及喷射非牛顿流体的液滴——从而逐渐增加单音脉冲功率的第一示例过程2900。首先，可以将包含未知非牛顿流体的储存器插入声学喷射装置(2902)。增大单音脉冲功率(2904)，然后施加至储存器中的流体(2906)。在每个单音脉冲功率处收集并分析至少一个并且经常是许多回波信号(动作2908)。在do循环中重复这些过程，直至达到最大可能的功率(2910)。当达到最大功率时，系统针对每个单音脉冲设置(例如，单音脉冲模式和每个单音脉冲的长度、单音脉冲振幅、单音脉冲频率和频率模式等)提取回波信号的信号特征(2912)。使用预先训练的人工智能或机器学习模型选择最佳信号标记(2914)。该模型将基于收集的回波信号提取的信号特征与已知的单音脉冲功率设置相关联。该模型寻找回波信号或光学信号随时间变化的趋势。在接连的时间延迟内，信号特征可能会增加、减少或保持恒定。至少需要一个回波信号来训练模型。然后，系统可以根据上述方法选择光学信号标记(2916)，然后选择信号特征和信号标记以用于喷射随后的液滴。

图30示出了第二示例过程3000，其也用于根据dma设置液滴喷射参数以及喷射非牛顿流体的液滴，从而逐渐增加单音脉冲功率。如上所述，可以将包含未知的非牛顿流体的储存器插入声学喷射装置(3002)。增加单音脉冲功率(3004)，然后施加至储存器中的流体(3006)。在连续的功率步骤(3008)处收集和分析回波信号，以确定接收到良好信号的时间(3010)，其中信号质量基于一个或更多个信号参数，例如足够的功率、返回信号的清晰度或其他参数。该比较可以包括将信号质量的特征与预定阈值进行比较。当已经接收到良好的回波信号时，系统可以如上所述提取信号特征(3012)，然后将信号特征反馈到模型(3014)以解决目标/溶剂浓度。该模型基于获得的信号特征，输出对目标/溶剂浓度是低还是高的判定(3016)。如上所述，对于低浓度情况，系统可以继续选择溶液的最佳信号标记(3024)，并且然后选择信号特征和信号标记以用于喷射随后的液滴(3022)。对于高浓度情况，系统可以采取另外的干预步骤来查找最佳段长度(3018)(即，单音脉冲模式的单音脉冲长度)，然后在选择信号特征和经调节的标记之前调节单音脉冲属性(3020)，以用于随后的液滴喷射。

图31示出了用于根据动态断裂分析(dba)设置液滴喷射参数和喷射非牛顿流体的液滴的第三示例过程3100。如上所述，可以将包含未知非牛顿流体的储存器插入声学喷射装置(3102)。通过ade系统(3104)将单音脉冲发射到流体中，监听回波(3106)，并且将频率滤波器应用于回波信号(3108)以检测液滴是否已分离(3110)。在每个单音脉冲迭代之间，监听至少出现一次，并且经常出现多次。如果液滴尚未分离，则系统增大喷射功率(3112)，并通过以经调节的喷射功率发射另一单音脉冲来重复该过程。在单音脉冲的每次调节之间，可以从光学上观察到失败或成功的液滴断裂。当已经检测到液滴分离时，系统可以基于最后成功的液滴喷射功率来设置后续液滴的喷射参数(3114)，并“锁定”所需的参数。

图32示出了用于也根据dba设置液滴喷射参数和喷射非牛顿流体的液滴的第四示例过程3200。如上所述，可以将包含未知非牛顿流体的储存器插入声学喷射装置(3202)。通过ade系统将单音脉冲发射到流体(3204)中，监听回波(3206)，并且将频率滤波器应用于(3208)回波信号以检测液滴是否已分离(3210)。在每个单音脉冲迭代之间，监听至少出现一次，并且经常出现多次。如果液滴尚未分离，则系统通过例如改变单音脉冲段长度中的一个或更多个来调节单音脉冲(3212)，并通过使用调节的单音脉冲发射另一单音脉冲来重复该过程。在单音脉冲的每次调节之间，可以从光学上观察到失败或成功的液滴断裂。当已经检测到液滴分离时，系统可以基于最后成功的液滴喷射单音脉冲特性来设置后续液滴的喷射参数(3214)，并“锁定”所需的参数。

过程2900、3000、3100、3200中的任何一个或全部可以彼此结合使用，或者与以上详细描述的任何技术结合使用。例如，系统可以采用dma和dba技术两者来确定和存储优化的液滴喷射特性(例如，单音脉冲段长度、单音脉冲喷射功率)，或者可以迭代地使用这些技术的任何合适的组合来进一步优化液滴喷射参数。

本文所述的系统和方法的实施方式还可以用于利用机器学习算法(mla)分类、表征并且因此确定正确的动态流体参数信息内容，以实现对非牛顿流体的声学液滴喷射(ade)。这允许使用ade以高度可再现、高度准度和高度精确的方式转移非牛顿流体样品(例如完整的天然基因组dna或粘弹性聚合物的溶液)，并使用标准实验室技术(例如qpcr、基于荧光的测定法、或用于不同样品输入的ngs)进行定量。如上所述，动态堆分析(dma)使得能够对样品浓度、片段尺寸进行表征和分类，以及利用声学液滴喷射(ade)技术制备非牛顿流体(例如完整的天然基因组dna或粘弹性聚合物的溶液)。同样如上所述，动态断裂分析(dba)使得能够表征用于利用ade技术进行非牛顿流体(例如完整的天然基因组dna(gdna)或粘弹性聚合物的溶液)的液滴断裂的单音脉冲的功率、振幅、频率或其他属性的量。另外的方法允许使用动态体积分析(dva)对使用ade的非牛顿流体的液滴体积进行可再现地、准确地和精确地预测，以用于下游应用，例如qpcr、荧光、ngs和其他基因组应用。

上述三种分析模式(dma、dba、dva)中的每一种都使用多次声反射与基于训练数据集的机器学习组合，以获得非牛顿流体的1)声学液滴喷射前和2)声学液滴喷射后的流体参数信息。

对于一类(表现出粘弹性的性质)非牛顿流体，使用基于阻抗的标记(以及相关联的功率阈值)不能成功地对声学液滴喷射进行表征或分类。即使利用众所周知的参数，例如样品浓度、片段尺寸或制备方法，阻抗变化仍然太宽泛而无法检测。向牛顿缓冲溶液中添加溶质(例如gdna)不会显著改变流体的阻抗，因此不会显著影响标记读数，但是，这种添加会产生被称为非牛顿流体行为的粘弹性现象，这需要显著不同的功率和另选的单音脉冲参数以实现ade。

可以使用一个或多个子喷射能量脉冲来扰动流体表面并收集从所得到的堆反射的一个或多个声信号来评估非牛顿性质。例如，动态堆分析(dma)使得能够实现对样品浓度、片段尺寸进行表征和分类，以及利用声学液滴喷射(ade)技术制备非牛顿流体(例如完整的天然基因组dna或粘弹性聚合物的溶液)。

根据各种实施方式，可以生成模型，该模型分析在流体表面受到单音脉冲扰动后来自流体表面的声反射，并使用将ade事件分类为成功或不成功的二元方案。可以将结果解释为迭代地调节单音脉冲，直至出现成功的液体断裂事件。这种方法被称为动态断裂分析(dba)，它不同于基于堆图像打印(mip)的结果，因为在询问容器、孔板或储存器中的非牛顿流体时，非明显信号处理算法优于零空间分析。重要的是，mip结果预测成功的液滴断裂事件的功率比正确测定的dba结果的功率低6db-11db。

可以生成替选的模型来分析由成功的ade事件所得到的液滴体积。在液滴喷射事件之前、之中和之后，对模型进行训练并处理来自流体表面的声反射。该动态体积分析(dva)对于使用任何单音脉冲产生的非牛顿流体(例如具有不同浓度、片段尺寸和制备的dna)的任何液滴实现准确的液滴体积预测。

利用人基因组dna(gdna)样品作为非牛顿流体的替代品。gdna样品的浓度、片段尺寸以及制备可以变化，并且这些因素难以参数化。这样，可以利用结合了机器学习算法(mla)的训练集实现高度可再现、高度准确和高度精确的ade。

图33-35示出了用于数据收集和处理以表征非牛顿流体、确定适于声学液滴喷射的单音脉冲参数以及表征非牛顿流体的喷射液滴的液滴体积的示例过程。过程3300、3400、3500以及本文所述的任何其他过程可以通过如本文所述的任何合适的声学液滴喷射系统来执行。

动态堆分析

图33示出了用于使用动态堆分析来表征非牛顿流体并锁定流体身份的示例过程3300。根据各种实施方式，具有未知特性的流体包含在流体储存器中(3302)。使用动态堆分析(dma)执行该流体的识别或表征。首先，生成一系列声信号并将其聚焦在流体的表面(动作3304)。这些信号扰动表面，但仍然保持足够低能量，以避免流体的任何液滴从主体(bulk)脱离。在每次扰动之后，一系列询问ping或询问单音脉冲被发出并且被聚焦在流体表面(动作3306)，然后从流体表面收集声反射(或回波信号)(3308)，直至达到最大等待时间(3310)。处理这些反射的集合以确定流体的非牛顿行为(3312)。

对多种未知流体的分析可以是相对的，并且可以提供非牛顿流体参数的程度排位的结果。这种定性排位很简单，并且通过检查信号集合来实现。然后，使用卷积神经网络(cnn)实现对这些流体的定量分类(3314)，该卷积神经网络使用已知浓度、片段尺寸和制备方法的样品进行了训练和验证。这是将通用技术应用于不明显的分类，以产生用于以可再现性、准确性和精确性执行ade的流体分类模型。数据集由从以各种子喷射功率水平创建的流体堆收集的反射声信号组成。反射的时域信号的集合可以未经滤波地用于训练模型。可替选地，可以在训练模型之前使用快速傅立叶变换(fft)处理反射的集合。

根据一个基于来自15个独特样品的fft信号训练的cnn模型，正确表征了99％的样品，从而允许通过ade成功地进行gdna转移。基于gdna浓度、片段尺寸和制备方法的结合，样品是独特的。这些独特的性质汇总于下表1中。

表7：用于训练和验证dma、dba和dva模型的gdna样品。

动态断裂分析(dba)

图34示出了以下示例过程3400：用于使用动态断裂分析(dba)来实现声学液滴喷射并锁定单音脉冲参数，即，针对诸如但不限于gdna的非牛顿流体的ade选择正确的能级。根据各种实施方式，特征化的非牛顿流体包含在流体储存器中(3402)。高能量声信号或单音脉冲被聚焦并且对准包含在储存器中的流体(3404)。可以将一系列询问单音脉冲施加至储存器中的流体(3406)，然后收集声反射或回波信号(3408)，直至达到最大等待时间(3410)。可以通过例如光学方法(例如扫描储存器上方区域以使液滴通过)，声学方法(例如基于对收集到的回波信号的分析)或其他合适的方法来确定喷射单音脉冲的成功或失败(3410)。

可以将每次液滴喷射尝试的结果分类为成功、不成功或不一致。将流体表面的扰动以及没有液滴断裂或分离定义为不成功的尝试。不一致的分类描述了间歇出现的液滴断裂事件或产生不一致的液滴体积，不一致的分类不是高可再现性、高准确度或高精确度的。最后，成功事件被定义为液滴断裂事件，该事件将非牛顿流体的液滴转移出源储存器，具有高可再现性、高准确性和高精确性。可以进行单音脉冲能量的迭代增加(3412)和dba分析，直至出现成功的ade事件(3414)。在那一点上，可以“锁定”参数(即，单音脉冲模式和能量)以执行随后的喷射(3416)。如果单音脉冲事件后的声反射记录为不成功事件，则可以增加能级，然后分析后续的声反射。为了获得最佳性能，可以逐渐增加喷射能量，直至“锁定”成功事件。

动态体积分析(dva)

图35示出了用于使用动态体积分析来表征由声学液滴喷射产生的液滴的体积并锁定液滴体积的示例过程。根据各种实施方式，非牛顿流体包含在流体储存器中(3502)。通过将聚焦的声学单音脉冲对准容器内的流体表面来触发声学液滴喷射(3504)。随后，使用一系列询问ping询问动态流体表面(3506)，直至达到最大等待时间(3510)。然后可以分析声反射或回波信号以预测液滴体积(3512)，并与测得的液滴体积数据进行比较以表征所形成的液滴体积(3512)。可以迭代地执行该过程以通过改变模型的参数来锁定液滴体积(3516)。

确定液滴体积的一种方法是针对每次声学液滴喷射获取一系列声反射。可以通过希尔伯特变换处理原始时域信号，并且通过对低于临界灰度值的像素进行阈值处理和消隐来可选地进一步处理，以简化特征提取和抑制噪声。可以从声反射图像提取的关键特征包括例如质心(从信号振幅的密度和幅度得出)、每个经滤波的反射的前缘以及峰特征。将这些提取的特征与用于产生液滴的单音脉冲的属性组合，并且使用特征的总集合训练模型以预测液滴体积。如图9所示，训练和验证神经网络模型导致以高准确性、高精确性和高可再现性表征液滴体积。每个点都有与其特性dva信号特征相关联的已知或预期的液滴体积。

评估样品完整性和无偏差转移的基因组确认

使用非dma校准和dma进行gdna的ade的对照实验以定量评估gdna转移，利用定量聚合酶链反应(qpcr)确认和检测持家基因β肌动蛋白(～actin)的表达。使用～-肌动蛋白正向引物agccatgtacgttgctatcc、～-肌动蛋白反向引物cgtagcacagcttctccttaat，(idt)进行qpcr测定。所有引物的最终浓度均为1μm。使用powerup^tmmastermix和thermofisher384孔透明光学板在thermofisherquantstudio6flex实时pcr系统上进行qpcr反应测定。

按如下步骤使用qpcr程序：步骤1，在50℃下2分钟；在95℃下2分钟；步骤2，在95℃下15秒，在60℃下1分钟，采集(40个循环)；步骤3，在95℃下15秒，在60℃下1分钟，在95℃下15秒。人类天然gdna是从bioline(45kb)、novagen(68kb)和promega(55kb)获得的。每个供应商代表不同的制备方法，所有样品均按原样使用或在tris-edta(te)缓冲液ph8.0中稀释至最终所需浓度。通过声学转移1、2、4、8、16和32滴gdna溶液，创建6点2倍标准曲线。对于每种浓度的gdna，均进行了八个(n＝8)技术复本。

为了进行比较，使用非dma校准获得了用于gdna溶液的转移的qpcr结果的对照组。非dma校准的cv表现出较高的偏差和许多大于5％cv的点。另外，对于150ng/μl和200ng/μl的bioline，80ng/μl和105ng/μl的novagen，以及100ng/μl、150ng/μl和200ng/μl的promega，r”2值<0.51。这是不可再现的，不准确的和不精确的。另外，非dma校准导致目标孔中许多失败的转移或者没有扩增。

相比之下，使用dma校准获得的转移稳健且可再现地转移了gdna溶液。对于每种制备方法，对于bioline和novagen，cv通常<4％，r/\2值>0.9。对于100ng/μl、150ng/μl和200ng/μl的promega，与使用非dma校准的<0.51相比，r/\2值远远>0.8。

使用荧光和qpcr测定对dva进行体积验证

还使用基于荧光的测定收集的液滴体积数据对dva模型进行了训练，以实现体积准确度和精确度确认。用0.0375mm荧光素钠制备具有各种浓度gdna的溶液。使用非牛顿ade将溶液转移至测定板。在测定板(1536ldv，labcyte)中预填充10mmnaoh溶液作为淬灭溶液。使用0.0375mm溶液的大量稀释液并将5μl移液到测定板中，制得6点2倍标准曲线。将这些板离心(3,000rpm)，在室温下孵育5分钟，并在荧光读取器(bmgpherastar)上读取。

在通过dva预测的液滴体积和使用基于荧光的测定法测量的液滴体积之间产生相关性。完全相关联的r/\2＝1.0。在这些情况下，使用各种单音脉冲频率，回归斜率指示了较高的相关性，其中r^2值超过0.98。使用qpcr测定也成功验证了dva性能，其中r/\2值超过0.95。

使用来自商业上可获得的来源的未经处理的、未片段化的、完整的天然gdna，并且利用非牛顿校准和用于ngs的机器学习算法获得实验数据。为了使用上述声学参数定量评估gdna转移，然后利用下一代文库制备(ngp)和下一代测序(ngs)确认无优先转移(例如，尺寸或单链与双链dna)或保持样品完整性的dna序列未出现损坏(例如意外的gdna剪切)。

nextera^tmdnaflex试剂盒(illumina)用于ngp，并且使用miseq仪器(illumina)进行ngs。使用illumina的basespacefastqc和bwaaligner测序工具进行数据分析。将从bioline和milliporesigma(前身为novagen)在商业上获得的高浓缩(>100ng/μl)、大片段(>20kb)gdna声学或移液(对照)转移到384-目的qpcr板中以用于文库制备。在三次技术重复中转移了总计140ng的每个gdna样品。将所有文库制备方案缩小3倍，以允许通过适合用作终点pcr仪器的thermofisherquantstudio^tm6flex实时pcr系统上进行的所有过程(例如，加标签，加标签后清除和扩增)声学转移至384孔板中。gdna样品信息在下表8中示出。

表8：用于nexteradnaflex文库制备的gdna样品

在mi试剂盒v3(150个循环)上对文库测序。在整个运行过程中甚至检测到每个核苷酸的强度，表明所有4个碱基的检测都是一致的。此外，获得了以下qscore热图：表明碱基识别准确度超过91.5％，出现错误碱基识别的概率为千分之一。声学转移和移液器转移的每个碱基序列数据质量相匹配并且是高质量的，这表明声学转移和移液器转移的每个碱基序列内容在序列运行的四个不同碱基之间没有差异。

下表9a-9d示出了跨多个技术复本的两种gdna样品的测序参数。对于所有样品，正确配对的读数>98％，表明读数配对处于正确方向，并且在与基因组比对时具有一定的插入尺寸。对于所有样品，>99％的插入序列与参考基因组比对，表明从声学转移或移液器转移生成的文库具有可比性，并且没有出现偏差ade或gdna损坏。

表9a：用于比较声学gdna转移和移液管gdna转移的测序参数

表9b：用于比较声学gdna转移和移液管gdna转移的测序参数

表9c：用于比较声学gdna转移和移液管gdna转移的测序参数

表9d：用于比较声学gdna转移和移液管gdna转移的测序参数

上文讨论的各种计算方法可以与具有硬件、软件和/或固件的计算机或其它处理器结合执行或使用所述计算机或其它处理器来执行。各种方法步骤可以由模块执行，并且模块可以包括被布置成执行本文所述方法步骤的各种数字和/或模拟数据处理硬件和/或软件中的任一者。该模块可选地包括数据处理硬件，该数据处理硬件适于通过具有与之关联的适当的机器编程代码来执行这些步骤中的一个或更多个，在广泛的各种集成和/或分布式处理架构中的任何一个中，用于两个或更多个步骤(或两个或更多个步骤的部分)的模块集成到单个处理器板中或分成不同处理器板。这些方法和系统将通常采用有形介质，该有形介质包括机器可读代码，该机器可读代码具有用于执行上述方法步骤的指令。合适的有形介质可以包括存储器(包括易失性存储器和/或非易失性存储器)、存储介质(例如，软盘、硬盘、磁带等上的磁记录；光存储器，如cd、cd-r/w、cd-rom、dvd等上的存储介质；或者任何其他数字或模拟存储介质)等等。

本文所示的细节仅以举例的方式示出，并且仅用于示例性地讨论本公开内容的优选实施方式，并且出于提供据信对本发明的各种实施方式的原理和概念方面最有用和最容易理解的描述的原因而提出。就这一点而言，不试图以比基本理解本发明所需的更详细地显示本发明的结构细节，与附图和/或示例一起进行的描述对本领域技术人员而言可以如何在实践中体现本发明的几种形式是明显的。

除非在以下示例中进行了明确且不含糊地修改，或在含义的应用使得任何构建无意义或基本无意义时，以下定义和解释意味着并旨在控制任何未来的构建。在术语的构建将使其无意义或基本上无意义的情况下，定义应从韦氏字典(webster'sdictionary)、第三版或本领域技术人员已知的字典，例如，生物化学与分子生物学牛津字典(编者安东尼史密斯，牛津大学出版社，牛津，2004)中获取。

除非上下文另外明确要求，否则在整个描述和权利要求书中，词语“包括(comprise/comprising)”等应理解为与排他性或穷举性意义相反的包含性意义；也就是说，含义是“包括但不限于”。使用单数或复数数字的词语也分别包括复数和单数数字。此外，当在本申请中使用时，词语“本文中”、“上文”和“下文”和类似导入的词语应指作为整体的本申请而非本申请的任何特定部分。

对本公开的实施方式的描述并不意为穷举的或将本公开内容限制于所公开的精确形式。虽然本文出于说明性目的描述了本公开内容的具体实施方式和示例，但是如相关领域的技术人员将认识到的，在本公开内容的范围内各种等效修改是可能的。

所有参考文献，包括专利申请(包括专利、专利申请和专利出版物)、科学期刊、书籍、论文、技术参考文献以及本申请中讨论的其他出版物和材料，均出于所有目的通过引用整体并入本文。

如果需要，可以修改本公开的各方面以采用上述参考文献和申请的系统、功能和构思以提供本公开内容的另外的其他实施方式。可以根据详细描述对本公开内容做出这些和其他改变。

任何前述实施方式的具体元素可以被组合或替代其他实施方式中的元素。此外，虽然在这些实施方式的上下文中已描述了与本公开内容的某些实施方式相关联的优点，但其他实施方式也可以展现这样的优点，并且并非所有实施方式都必须显示出此类优点以落入本公开内容的范围内。

虽然上文提供了对本发明的示例性实施方式的全面且完整的公开，但是可以根据需要采用各种修改、替选构造和等同物。因此，尽管已经通过示例的方式并且出于理解的清楚起见而稍微详细地描述了实施方式，但是对于本领域技术人员来说，各种修改、改变和适应性修改将是明显的。因此，以上描述和说明不应解释为限制本发明，本发明可由所附权利要求书限定。

其它变化在本公开内容的精神内。因此，虽然所公开的技术易受各种修改和替选构造的影响，但是其某些示出的实施方式在附图中被示出并且已经在上文详细描述过。然而，应理解，并不意图将本公开内容限于所公开的某种特定形式或某些特定形式，而是相反地，意图是涵盖落入如所附权利要求中限定的本公开内容的精神和范围内的所有修改、替选构造和等同物。

除非本文另外指明或与上下文明显抵触，否则在描述所公开的实施方式的上下文中(尤其在所附权利要求书的上下文中)，使用术语“一/一种(a/an)”和“所述(the)”以及类似的指代物应解释为涵盖单数和复数。除非另外指出，否则术语“包括”、“具有”、“包含”和“含有”应解释为开放式术语(即，意指“包括但不限于”)。术语“连接的”应被解释为部分地或完全地包含在内、附接到或联结在一起，即使存在中间物。除非在本文中另外指出，否则在本文中的值的范围的引用仅旨在用作单独指代落入该范围内的每个单独值的速记方法，并且每个单独值被并入本说明书中，如同在本文中被单独陈述一样。除非在本文中另外指明或以其他方式与上下文明显抵触，否则本文所述的所有方法均可以任何合适的顺序执行。除非另外要求保护，否则本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅旨在更好地说明本公开内容的实施方式，并且不对本公开内容的范围造成限制。在说明书中没有语言应解释为指示对本公开内容的实践必要的任何非要求保护的元素。

除非另外明确说明，否则诸如短语“x、y或z中的至少一个”的析取语言旨在在通常使用的上下文中理解，以介绍物品、术语等可以是x、y或z，或者其任何组合(例如，x、y和/或z)。因此，这种析取语言通常不旨在且不应暗示某些实施方式需要至少一个x、至少一个y或至少一个z存在。

本文中描述了本公开内容的优选实施方式，包括发明人已知用于执行本公开内容的最佳模式。在阅读前述描述后，这些优选实施方式的变型对于所属领域的普通技术人员而言可变得明显。本发明人希望技术人员酌情采用这些变型，并且本发明人希望以不同于本文具体描述的方式实践本公开内容。因此，本公开内容包括根据适用法律所允许的在随附权利要求书中叙述的主题的所有修改和等同物。此外，除非本文另外指明，或另外与上下文明显抵触，否则上述元素在其所有可能变型中的任何组合均被本公开内容涵盖。

本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利通过引用以与如下程度相同的程度并入本文：如同每个参考文献单独地并且具体地指示为通过引用并入本文中并且在本文中整体阐述。

在下文中，描述了进一步的实施方式以有利于对本发明的理解：

示例1.一种通过声学液滴喷射器从包含非牛顿流体的储存器喷射液滴的方法，该方法包括：

以包括第一单音脉冲段的第一模式将聚焦声能施加至非牛顿流体的流体表面，以从流体表面产生前导瓣和长丝，而不会使长丝与前导瓣或流体表面分离；以及

以包括第二单音脉冲段和第三单音脉冲段的第二模式将聚焦声能施加至前导瓣，以通过将前导瓣与长丝分离以形成液滴来喷射液滴。

示例2.根据示例1的方法，其中：

第一单音脉冲段具有足以使前导瓣和长丝从流体表面升起的振幅和持续时间；并且

第二模式包括被配置成将液滴与长丝分离的至少两个分离的单音脉冲段，所述至少两个分离的单音脉冲段包括第二单音脉冲段和第三单音脉冲段。

示例3.根据示例2的方法，其中，第一单音脉冲段的持续时间比第二单音脉冲段和第三单音脉冲段中的每一个的持续时间长，并且第三段的持续时间比第二段的持续时间长。

示例4.根据示例1至3中任一项的方法，其中，长丝包括至少一个流体珠，并且聚焦声能的第二模式防止所述至少一个流体珠破裂成一个或更多个另外的液滴。

示例5.根据示例1至3中任一项的方法，其中，液滴的直径小于流体长丝的长度的70％、小于流体长丝的长度的30％或小于流体长丝的长度的10％。

示例6.根据示例1至3中任一项的方法，其中，液滴的液滴体积小于流体长丝的其余部分的总体积的80％、优选地小于流体长丝的其余部分的总体积的10％、优选地小于流体长丝的其余部分的总体积的5％。

示例7.根据示例1至3中任一项的方法，其中，聚焦声能的振幅超过与从牛顿流体喷射替选的液滴相关联的替选的振幅。

示例8.根据示例1至3中任一项的方法，其中，单音脉冲的振幅在第一单音脉冲段与第二单音脉冲段之间或者在第二单音脉冲段与第三单音脉冲段之间变化。

示例9.根据示例1至3中任一项的方法，其中：

通过聚焦声能从储存器产生的非牛顿流体的长丝包括含有0个、1个、2个或大于2个非牛顿流体珠的链；并且

聚焦声能的第二模式导致液滴从链断裂。

示例10.根据示例9的方法，其中，长丝包括5个、10个或小于10个非牛顿流体珠。

示例11.根据示例9的方法，其中，非牛顿流体珠的厚度超过长丝的直径达长丝的直径的10％、20％、50％或小于50％。

示例12.根据示例9的方法，其中，非牛顿流体珠的厚度小于或等于所得到的液滴直径的50％、75％或90％。

示例13.根据示例9的方法，其中，聚焦声能的第二模式被配置成在不产生附随液滴的情况下实现液滴喷射。

示例14.根据示例9的方法，其中，在液滴断裂之前或之后，链上的珠彼此聚结或者与储存器中的流体聚结。

示例15.根据示例9的方法，还包括光学地或电子地监测长丝，以评估液滴断裂是成功还是失败。

示例16.根据示例1至3中任一项的方法，还包括基于来自在储存器中形成的流体堆的光信号或电信号来预测液滴断裂。

示例17.根据示例1至3中任一项的方法，其中，非牛顿流体包括含有遗传物质的溶液。

示例18.根据示例1至3中任一项的方法，还包括：

向流体表面施加一系列校准单音脉冲，所述一系列校准单音脉冲被配置成从流体表面升起一定量的流体；

检测从流体表面升起的所述一定量的流体中的长丝的形成，或者检测校准液滴从流体表面的喷射；以及

基于检测到长丝或校准液滴的喷射，设置聚焦声能的第一模式或聚焦声能的第二模式中的一个或更多个单音脉冲的功率、波长或持续时间之一。

示例19.根据示例1至3中任一项的方法，其中，聚焦声能的第二模式被配置成在不产生附随液滴的情况下实现液滴喷射。

示例20.根据示例1至3中任一项的方法，其中，聚焦声能的第二模式被配置成抑制附随液滴的形成。

示例21.一种液滴喷射系统，其被配置成从储存器中的非牛顿流体喷射液滴，该系统包括：

声学喷射器，所述声学喷射器被配置成：

以第一模式将聚焦声能施加至非牛顿流体的流体表面，以从流体表面产生前导瓣和长丝，而不会使长丝与前导瓣或流体表面分离；以及

以第二模式将聚焦声能施加至前导瓣，以在不喷射附随液滴的情况下使前导瓣与长丝分离，使得长丝退回到流体表面中；以及

处理器和存储可执行指令的存储器装置，所述可执行指令在由处理器执行时使声学喷射器以第一模式将聚焦声能施加至非牛顿流体的流体表面，并且以第二模式将聚焦声能施加至前导瓣。

示例22.一种设置用于从非牛顿流体的液滴喷射的单音脉冲模式的参数的方法，该方法包括：

向流体表面施加一系列校准单音脉冲，所述一系列校准单音脉冲被配置成从流体表面升起一定量的流体；

收集与所述一系列校准单音脉冲相对应的一系列回波信号；以及

基于所收集的一系列回波信号，设置聚焦声能的单音脉冲模式的一个或更多个单音脉冲段的功率、波长或持续时间之一，聚焦声能被配置用于从包含非牛顿流体的储存器喷射液滴，其中，单音脉冲模式至少包括：

第一分离单音脉冲段；

第二分离单音脉冲段；以及

第三分离单音脉冲段，第一单音脉冲段的持续时间比第二段和第三段的持续时间长，并且第三段的持续时间比第二段的持续时间长。

示例23.根据示例22的方法，还包括：

基于所收集的一系列回波信号，确定与液滴喷射相对应的最小单音脉冲功率；以及

至少部分地基于最小单音脉冲功率来设置功率、波长或持续时间之一。

示例24.根据示例22的方法，还包括：

通过根据单音脉冲模式向储存器施加聚焦声能来从储存器喷射液滴。

示例25.根据示例24的方法，还包括：

经由光学传感器感测液滴的喷射。

示例26.根据示例24或示例25的方法，还包括：

迭代地改变所述一个或更多个单音脉冲段的功率、波长或持续时间之一，直到检测到液滴喷射；以及

将功率、波长或持续时间设置为与所检测到的液滴喷射相对应的一个或更多个值。

示例27.根据示例24或示例25的方法，还包括：

通过由基于比较数据集训练的卷积神经网络处理所述一系列回波信号，预测与所喷射的液滴相关联的液滴体积，比较数据集包括与具有已知性质的相应的多种非牛顿流体相对应的多个反射声信号。

示例28.根据示例27的方法，还包括：

确定与所喷射的液滴相关联的实际液滴体积；

将实际液滴体积与所预测的液滴体积进行比较；以及

基于所述比较来修改卷积神经网络。

示例29.根据示例24或示例25的方法，还包括：

确定与所喷射的液滴相关联的液滴体积；

将所述液滴体积与预测的液滴体积进行比较；以及

基于所述比较来调节功率、波长或持续时间。

示例30.根据示例22至25中任一项的方法，还包括：

基于所收集的一系列回波信号来确定非牛顿流体的性质。

示例31.根据示例22至25中任一项的方法，还包括：

将所述一系列回波信号与存储的回波数据进行比较，存储的回波数据包括与已知的非牛顿流体的集合相关的先前接收到的回波的集合；以及

至少部分地基于所述比较来设置功率、波长或持续时间之一。

示例32.根据示例22至25中任一项的方法，还包括：

通过由基于比较数据集训练的卷积神经网络处理所述一个或更多个回波来确定非牛顿流体的性质，比较数据集包括与具有已知性质的相应的多种非牛顿流体相对应的多个反射声信号。

示例33.一种从流体储存器喷射包含非牛顿流体的液滴的方法，该方法包括：

将聚焦声能的单音脉冲模式施加至包含非牛顿流体的流体储存器，其中，将单音脉冲模式向流体储存器的施加使得从流体储存器喷射非牛顿流体的液滴，并且其中，单音脉冲模式包括：

第一分离单音脉冲段；

在第一分离单音脉冲段之后施加的第二分离单音脉冲段；以及

在第二分离单音脉冲段之后施加的第三分离单音脉冲段。

示例34.根据示例33的方法，其中，第一单音脉冲段的持续时间比第二段和第三段的持续时间长，并且第三段的持续时间比第二段的持续时间长。

示例35.根据示例33或示例34的方法，其中：

通过第一分离单音脉冲从非牛顿流体的流体表面升起前导瓣和长丝；并且

通过第二分离单音脉冲和第三分离单音脉冲将前导瓣与长丝分离来实现液滴喷射。

示例36.根据示例35的方法，其中，长丝包括至少一个流体珠，并且单音脉冲模式防止所述至少一个流体珠破裂成一个或更多个另外的液滴。

示例37.根据示例35的方法，其中：

通过聚焦声能从储存器产生的非牛顿流体的长丝包括含有一个或更多个非牛顿流体珠的链。

示例38.根据示例37的方法，其中，单音脉冲模式导致液滴从链断裂。

示例39.根据示例37的方法，其中，长丝包括1个、2个或大于2个非牛顿流体珠。

示例40.根据示例37的方法，其中，长丝包括5个、10个或大于10个非牛顿流体珠。

示例41.根据示例37的方法，其中，非牛顿流体珠的厚度超过长丝的直径达长丝的直径的10％、20％、50％或小于50％。

示例42.根据示例37的方法，其中，非牛顿流体珠的厚度小于或等于所得到的液滴直径的50％、75％或90％。

示例43.根据示例37的方法，其中，在液滴断裂之前或之后，链上的珠彼此聚结或者与储存器中的流体聚结。

示例44.根据示例37的方法，其中，所喷射的液滴的液滴体积小于液滴喷射期间长丝的剩余体积的80％、小于液滴喷射期间长丝的剩余体积的10％或小于液滴喷射期间长丝的剩余体积的5％。

示例45.根据示例37的方法，其中，当长丝具有至少5个液滴直径、10个液滴直径、20个液滴直径、50个液滴直径或100个液滴直径的长度时，出现液滴的喷射。

示例46.根据示例37的方法，还包括光学地或电子地监测长丝，以评估液滴断裂是成功还是失败。

示例47.根据示例33或示例34的方法，其中，液滴的直径小于长丝的长度的70％、小于长丝的长度的30％或小于长丝的长度的10％。

示例48.根据示例33或示例34的方法，其中，液滴的液滴体积小于流体长丝的其余部分的总体积的50％、优选地小于流体长丝的其余部分的总体积的10％、优选地小于流体长丝的其余部分的总体积的5％。

示例49.根据示例33或示例34的方法，其中，单音脉冲的振幅超过与从牛顿流体喷射替选的液滴相关联的替选的振幅。

示例50.根据示例33或示例34的方法，其中，单音脉冲的振幅在第一单音脉冲段与第二单音脉冲段之间或者在第二单音脉冲段与第三单音脉冲段之间变化。

示例51.根据示例33或示例34的方法，还包括基于来自在储存器中形成的流体堆的光信号或电信号来预测液滴断裂。

示例52.根据示例33或示例34的方法，其中，非牛顿流体包括含有遗传物质的溶液。

示例53.根据示例33或示例34的方法，还包括：

向流体表面施加一系列校准单音脉冲，所述一系列校准单音脉冲被配置成从流体表面升起一定量的流体；

检测从流体表面升起的所述一定量的流体中的长丝的形成；以及

基于检测到长丝，设置单音脉冲模式的一个或更多个单音脉冲段的功率、波长或持续时间之一。

示例54.一种液滴喷射系统，其被配置成从储存器中的非牛顿流体喷射液滴，该系统包括：

声学喷射器，所述喷射器被配置成将聚焦声能的单音脉冲模式施加至储存器，使得聚焦声能从储存器喷射非牛顿流体的液滴；以及

处理器和存储可执行指令的存储器装置，所述可执行指令在由处理器执行时使声学喷射器以包括以下在内的模式施加聚焦声能：

第一分离单音脉冲段；

在第一分离单音脉冲段之后施加的第二分离单音脉冲段；以及

在第二分离单音脉冲段之后施加的第三分离单音脉冲段。