使用珀耳帖模块作为聚合酶链反应的原动机的流动池的制作方法

本文的公开总体上涉及用于dna序列的扩增中的振荡流动池的领域，并且更具体而言，涉及用于在没有例如泵或阀之类的机械装置的情况下在流动池内移动模板dna和相关试剂的混合物以用于聚合酶链反应（pcr）、定量pcr（qpcr）和其他类似技术的系统和方法。

背景技术：

pcr和qpcr是用于扩增目标dna序列的公知技术。通常至少包括目标dna样品、引物、核苷酸和dna聚合酶的混合物经受多个温度循环，包括在大约94-98℃下执行的变性步骤、在大约50-65℃下执行的退火步骤以及延伸步骤。后者可在大约70℃下执行，但取决于所用的dna聚合酶，也可在与退火步骤相同的温度下执行。

在qpcr中，由于荧光报告基因，pcr产物可在扩增过程期间实时检测到。荧光核苷酸序列探针在一端处具有荧光报告基因，并且在相对端处具有荧光猝灭剂。如引物一样，这些探针在pcr的退火阶段期间退火成单链dna。它们随后在伸长阶段期间被dna聚合酶降解。释放的报告荧光团因此可检测。

微流体芯片或流动池是蚀刻或模制到诸如玻璃、硅或聚合物（例如，聚二甲基硅氧烷（pdms））之类的材料中的一组微通道。形成微流体芯片的微通道被连接在一起以实现期望的特征。外部致动装置用于引导介质在微通道内的传输。例如，外部驱动器可用于在无源芯片上施加离心力。

有源部件也可与微流体芯片或流动池集成或者集成在微流体芯片或流动池内以控制介质流。微型泵以连续方式供应流体，而微型阀控制泵送流体的流动方向和/或选择性移动。然而，外部驱动器需要控制器以用于选择性操作以及物理空间来物理操纵无源芯片。

微型泵和阀可被集成到微通道自身中。某些流动池已开发有用于选择性流体移动的珀耳帖泵和相关联的阀。然而，具有所需流率响应扬程的阀的设计和制造是非常困难的。具有诸如微型泵和微型阀之类的集成的有源部件的系统需要微型气动系统以用于控制流体在微通道内的选择性移动。微流体芯片内的流体移动的快速且可重复的精度对于诸如pcr和qpcr之类的应用至关重要。

目标流体流可通过使用可变温度元件而被选择性地加热到期望的温度，而不是使流体在微流体芯片或流动池内的不同温度区之间移动。然而，对流体温度的精确控制是复杂的，并且可导致目标流体中的较慢的温度响应。

可替代地，pcr样品可在连续流动或流通式pcr池中保持在期望pcr温度下的不同加热块之间快速转移。需要泵以使pcr混合物移动通过微流体通道，该微流体通道通常沿循温度区之间的蛇形路径。与该选择相关的缺点包括具有固定数量的温度循环以及需要外部泵。

在微流体环境中热循环的另一种方法是振荡流pcr。通过使得能够选择性地调整流动池内的流体流方向，可选择温度循环的数量，从而解决与连续流pcr相关的缺点。然而，必须提供用于流体流的选择性调整或路由的装置。解决该问题的一种方法利用quake阀以使pcr混合物在不同温度区之间循环。然而，因此需要精确可控的气泵来实现阀调动作。

现有技术中缺乏但高度需要的是用于诸如pcr或qpcr之类的dna扩增过程中的微流体芯片或流动池，该微流体芯片或流动池能够提供重复和准确的流体移动，而没有机械移动部件、泵或阀，同时防止污染。

技术实现要素：

为了克服现有技术无法在不使用泵或其他机械部件的情况下提供用于振荡流pcr的流动池的功能，本公开提供了一种用于振荡流pcr的低成本密封流动池，该流动池通过热诱导内部压力变化而具有泵送作用。

前述系统使得目标dna和相关试剂能够在流动池内的加热区之间快速移动，以用于振荡流pcr，而没有机械移动部件且无污染。

该流动池包括从装载端口延伸到第一和第二加热区并延伸到中央空气腔室的微通道，该中央空气腔室可通过设置在其下方的珀耳帖模块选择性地加热和冷却。第四周围温度区也与该通道连通并且表示该通道的气动系统的参考区。由目标dna和相关试剂组成的样品可从第二加热区移动到第一加热区，这是通过由下面的珀耳帖模块施加的热而导致的中央空气腔室压力的增加。该样品也可从第一加热区移动到第二加热区，这是通过下面的珀耳帖模块施加的热的减少或通过冷却而导致的中央空气腔室压力的降低。

该流动池可插入到流动池过程加热器中，该流动池过程加热器具有至少两个加热器，以用于将流动池的第一区和第二区加热到相应的期望温度。当用于诸如pcr或qpcr之类的过程中的dna扩增时，第一区被加热到期望的变性温度，而第二区被加热到期望的退火温度。

一旦插入到流动池过程加热器中，中央空气腔室就在具有下面的珀耳帖模块的流控制加热器上方对准。由下面的珀耳帖模块施加的加热或冷却导致的中央空气腔室内的空气或其他气体的热膨胀和收缩，在第一和第二加热区之间来回推动或拉动样品。

由于珀耳帖模块不需要高温循环来在加热区之间移动样品，因此可实现非常快的pcr结果，并且流动池可具有长使用寿命。通过在流动池内快速和准确地移动pcr样品的能力而不使用机械移动部件且无污染，实现了简单的制造和成本节约。

附图说明

下面参考附图来详细描述所公开技术的说明性实施例，附图通过引用结合于本文中，并且其中：

图1是根据本发明的用于与流动池过程加热器和流控制加热器一起使用的流动池的透视图；

图2是用于与图1的流动池一起使用的流动池过程加热器和流控制加热器的局部透视图；以及

图3是接收在图2的流动池过程加热器和流控制加热器内的图1的流动池的局部透视图。

具体实施方式

本文公开了一种流动池、流动池过程加热器和流控制加热器，它们共同使得dna模板和相关试剂能够在流动池内选择性地移动，以用于诸如dna扩增之类的过程，而不使用机械装置，例如泵和/或阀。该dna模板和相关试剂在本文中可替代地并且共同简称为“样品”。

虽然本公开的背景是属于通过诸如pcr和qpcr之类的技术的dna扩增的领域，但要理解的是，目前公开的部件和技术也在其他微流体应用中找到用武之地。

关于图1，流动池10被示出为具有远端30、近端32、第一侧34和第二侧36的矩形芯片。该流动池的上部面在图1中总体可见，而相对的下部面未示出。第一实施例中的下表面是无特征且平面的，并且可设置有诸如铝之类的高导热性的材料层。

该上部面包括四个主要区域。第一区域是退火区域14，也称为第一加热部分，其靠近远端和第一侧。第二区域是变性区域12，也称为第二加热部分，其靠近远端和第二侧。第三区域是中间传输区域16，也称为第三加热部分，其处于远端和近端中间以及第一侧和第二侧之间。第四区域是周围参考区域18，也称为第四未加热部分，其靠近近端。

流体流动路径或通道26连接在这四个区域中的每一个之间，从而在它们之间形成连续的流体流动通道。该通道可通过多种技术形成，包括提供下部基层并将具有蚀刻或以其他方式形成在其中的微通道的上层结合到该基层上，小心地将这两层完全结合以避免空气经由层界面泄漏到该通道中。一层或两层可由pdms、聚丙烯、聚碳酸酯或任何其他合适的材料形成，这取决于应用，例如pcr或qpcr。

该流体流动路径或通道26优选地被设置为第一和第二区域12、14中的环形或蛇形路径，以用于增强对流体的热传递，这随后论述。蛇形路径也延长了该路径，从而提供了附加或“溢流”区域来补偿样品体积和装载流体注入的变化性。第三部分16中的流体流动路径或通道26优选地在体积上较大，以还有助于对该流体流动路径或通道的局部区域内的气体的热传递，以及提供相对大体积的气体，该气体的压力由来自流控制加热器200的热来操纵，这也随后论述。第四区域18中的流体流动路径或通道26优选地设有大的表面积，而不需要蛇形路径，这是因为该区域用作流体流动路径或通道的其余部分的压力参考点。

一旦流动池10已相对于流动池过程加热器和流控制加热器安装，如下文更详细地描述的，相对少量的dna模板和相关试剂，例如大约5µl，就经由装载端口20被引入到流动路径中，该装载端口20可处于周围参考区域18内。dna模板和试剂的引入可通过手动或自动操纵的移液器（未示出）。

在图3中可见设置在第三部分16和第四部分18上方的盖50。装载端口20和通气端口24（下面论述）穿过该盖形成。在一个实施例中，流体流动通道26形成在该盖的底部中，并且该盖形成流动池10的顶部。

由于流体通道26的定向，dna模板和相关试剂一旦经由样品装载端口20引入，就会流向变性区域12和退火区域14。诸如空气和/或矿物油之类的一定体积的惰性流体通过样品装载端口引入，以将样品推至变性区域12和退火区域14中间的点。使用矿物油有益于防止dna模板和试剂受到污染。选择在dna模板和试剂之后引入的惰性流体的体积，以使dna模板和试剂前进到相对于变性区域12和退火区域14的期望位置。

通气端口24被连接到流体通道26的远端，以使得dna模板和试剂以及随后的惰性流体能够被注入到流体通道中，而没有与封闭通道相关联的增加压力的阻力。该通气端口可处于周围参考区域18内。一旦如此注入并相对于变性区域12和退火区域14位于期望位置处，样品装载端口20和通气端口就可从流体通道切断，以形成封闭的流动池系统，例如通过靠近流体通道中的每一个机械地形成的变形28。这样的变形可能是外部施加的力的结果，该力在每个点处的流体通道中塌陷出或以其他方式产生间断。将一定体积的矿物油注入到装载端口中，或将一定体积的矿物油沉积到靠近装载端口的流动池10的上部面上，可避免对物理封闭装载端口的需要。

在例如图1中所示的某些实施例中，可采用热障来避免热效应从一个区域迁移到另一个相邻区域。例如，封闭的通道或其他物理屏障40可被设置在第二区域12和第三区域16之间的流动池10的上部面上。类似地，屏障42可被设置在第一区域14和第三区域之间。虽然类似的结构也可设置在第一和第二区域中间，但使用例如凹口44的物理间断可能有几个益处，该凹口44如图1中所示。具体而言，在提供期望的热障的同时，如果流动池过程加热器设置有互补的对准特征，则这样的凹口还可有助于流动池的适当对准并安装到流动池过程加热器100中。

关于图2，示出了流动池过程加热器100和流控制加热器200，但没有流动池10。在第一实施例中，两个元件都相对于诸如散热器之类的基板80设置。

在图2中所示的实施例中，流动池过程加热器100包括两个部分102、104，其中每个部分可经由诸如螺钉（未示出）之类的可逆紧固件来附接到散热器80。第一部分102包括第一流动池过程加热器106，而第二部分包括第二流动池过程加热器108。第一和第二流动池过程加热器中的每一个可被选择为能够维持预限定或预定温度的简单的电阻型加热器，或者可被设置为诸如热电装置（ted）之类的可变温度加热器，例如珀耳帖装置。在目标dna和试剂的熔解曲线已经建立的环境中，非可变温度装置可能是有用的，而可变温度装置可有助于pcr熔解曲线研究。

流动池过程加热器100的一端具有横向凹口114，其构造成用于选择性地接收流动池10的远端30。一旦流动池被接收在流动池过程加热器内，如关于图3所论述的，检测窗口110、112使得光学检测装置（未示出）能够监测流动池内的活动，包括在qpcr的情况下测量荧光。光学检测可通过光电二极管或基于摄像机的检测器。

在流动池过程加热器100的每个部分102、104中的每个加热器106、108上方，相应的弹性构件120、122横向延伸越过加热器的顶部。每一者的远端124、126被固定地附接到相应加热器的顶表面，而向下突出的近端128、130自由向上偏转，如随后将论述的。在第一实施例中，该弹性构件不导热并且例如可由耐热塑料形成。

流控制加热器200包括加热器模块202，其在第一实施例中是可变温度珀耳帖模块。在示例性实施例中设置在加热器模块上方的是热分布板204，该热分布板204选择成用于实现良好的导热性。例如，该热分布板可由铝设置而成。可替代地，可采用其他导热材料，例如钢或黄铜。该加热器模块可通过一对夹具208相对于基板80保持就位，该夹具208可经由诸如螺钉（未示出）之类的可逆紧固件来附接到基板。

流控制加热器200还包括弹性流动池保持夹210，其例如通过使用诸如螺钉（未示出）之类的可逆紧固件来附接到基板80。该保持夹优选地在热分布板204和其下方的加热器模块202上方横向延伸。横向延伸的向下突出部212可被设置在保持夹上，以用于如下目的，即：一旦安装在流动池过程加热器100和流控制加热器内，就机械干涉流动池10，如随后论述的。在第一实施例中，该保持夹由导热材料形成，例如铝、黄铜或钢，从而确保流控制加热器和流动池10的第三部分16之间的高效热耦合。

最后，流控制加热器200可包括与热分布板204结合设置的温度传感器220，以用于监测加热器模块202的性能。该温度传感器的输出可被提供给也与加热器模块202相关联的控制电路（未示出），以用于向其提供反馈回路。

关于图3，流动池10已被插入到流动池过程加热器的端部中的凹口114（图2）中。因此，第二区域12中的流体流动通道26的一部分在一个检测窗口110中可见，而第一区域14中的流体流动通道的一部分在另一个检测窗口112中可见。弹性构件120、122的向下突出的近端128、130在插入时与流动池的上部面接触并向上偏转，从而对流动池施加向下的力，以便提供来自相应的流动池过程加热器106、108的高效热传递。

在插入时，流动池10的上部面也与保持夹210接触。特别地，该保持夹的向下突出部212（图2）搁置在流动池的处于第三部分16上方的盖50上并且在流动池上施加向下的力，从而使流动池的下部面与加热器模块202上方的热分布板204接触。

在使用中，流动池10相对于流动池过程加热器100和流控制加热器200插入。使流动池过程加热器106、108达到温度。然后，目标dna和相关试剂被引入到流体流动路径或通道26中，随后是一定体积的惰性流体，用于使样品前进到流体流动路径或通道中相对于第一和第二区域14、12以及相应的流动池过程加热器108、106的期望位置。在该实施例中，保持夹210和装载端口20被构造成在流动池插入时不物理干涉。

在替代实施例中，在流动池10插入到流动池过程加热器100和流控制加热器200中之前，目标dna和试剂被引入到流体流动路径或通道26中。在该实施例中，可能优选的是使流动池过程加热器108、106已经处于相应的期望温度。

一旦流动池10在流动池过程加热器100内并且相对于流控制加热器200安装，目标dna和相关试剂就已被装载到流动池中，并且足够量的惰性流体已被引入到流体流动路径或通道26中，以使样品前进到相对于第一和第二区域14、12的位置，流控制加热器的加热器模块202被选择性地加热或冷却，以相应地增加或降低第三或中间传输区域16内的压力。随着压力由于加热器模块的较低温度而降低，样品移入到第二或变性区域12中并保持在适当温度下预定时间段。然后，在适当的时间，加热器模块的温度升高，从而增加中间传输区域内的流动路径或通道压力，促使样品进入到第一或退火区域14中，在那里它被保持期望的时间段。然后，根据正在实践的技术的要求，该过程被重复预定数量的迭代或循环。

该过程要求在加热器模块的温度、流动池过程加热器106、108的温度、流体流动路径或通道26的容积和构造、样品的粘度和体积以及惰性流体的粘度和体积中的一些或全部之间存在预定关系，以便使样品通过中间传输区域压力的变化而适当地定位。至少与加热器模块202通信的控制器（未示出）根据该预定关系做出响应，以使加热器模块输出必要的加热。反馈可由温度传感器220提供。

在不脱离所公开技术的精神和范围的情况下，所描绘的各种部件以及未示出的部件的许多不同的布置结构是可能的。已经以说明性而非限制性的意图描述了所公开技术的实施例。替代实施例对于本领域技术人员将变得显而易见，这些替代实施例不脱离其范围。在不脱离所公开技术的范围的情况下，技术人员可开发实现上述改进的替代方式。

例如，虽然描述和图示了两个流动池过程加热器106、108和流动池上的两个互补的加热器部分12、14，但是取决于应用，可采用多于两个加热器和相似数量的加热器部分。通过经由流控制加热器200在流动池的第三加热器部分16处选择性地施加加热和冷却，样品可相对于这样的布置结构以相同的方式定位。

另外，已公开和描述了流动池10上的单个连续的流体流动路径或通道26。然而，在替代实施例中，复数个这样的流体流动路径或通道可交错且平行地布置，由此相应的样品在相同的流动池过程加热器的环境中处理，或者可各自设置在流动池的相应的离散部分上。后一实施例则将需要复数个连续布置的流动池过程加热器模块和相似数量的流动池加热器。

将会理解的是，某些特征和子组合具有效用并可在不参考其他特征和子组合的情况下采用，并且在权利要求的范围内被预期。并非各个图中列出的所有步骤都需要按照所描述的特定顺序执行。