一种核酸印迹磁珠的制备方法及其应用与流程

1.本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种核酸印迹磁珠的制备方法及其应用。


背景技术：

2.核酸提取和纯化是下游pcr、测序(ngs)、分子杂交的重要步骤，核酸的提取量和提取纯度直接影响下游检测灵敏度和特异性，传统的核酸提取方法有溶剂萃取和硅胶柱法提取，这两种方法中均含有离心和沉淀的过程，样本需求量大，耗费样品较多，对于某些微量样品的检测受到很大的局限，同时离心柱法的特点，使其无法实现高通量、自动化的操作，在样品量大的血液筛查、突发疫情等领域受到极大的限制，另外，由于上述过程操作过程复杂、耗时耗力，提取过程中核酸损失较多，导致核酸的回收率较低，而且用到的硅胶柱法提取特异性差，导致核酸提取率低，影响下游的扩增和测序，导致假阳性的出现。
3.磁珠法进行dna提取是近几年发展起来的一种核酸提取技术，是纳米科技与生物技术的完美结合，与上述提取方法相比，最大的优势就是可以实现高通量的提取，尤其在血液筛查、临床乙肝、突发疫情等领域，同时，磁珠法自然沉降和离心过程，简化了传统dna提取操作流程，不需要用大量有毒试剂等，操作简单方便。
4.专利号：201510241587.x发明了一种磁性微球的制备方法。该方法使用铁离子和亚铁离子，制备得到磁流体，再加入甲基丙烯酸甲酯等制备微球。使用的引发剂为过硫酸钠或偶氮二异丁酸二甲酯。该发明制备的微球生物相容性好，能够在基因测序的过程中用于酶的固定，但是该法制备的磁流体属于共沉淀法，制备的磁流体磁性弱，磁流体团聚，在后续利用甲基丙烯酸甲酯修饰的时候制备的磁珠粒径均一性较差。
5.专利号：201510610883.2发明了一种用于动物组织核酸提取的磁性微球，该磁性微球先通过聚碳硅烷包覆纳米级磁性粉体，再通过热处理和磁选手段制得。该磁性微球粒径均一可控，比表面积大，具有超顺磁性，可快速高效分离提纯动物组织核酸，但是该磁性微球对核酸的选择性差。
6.传统的核酸提取磁珠主要是利用羟基或羧基通过盐桥或氢键形式对核酸进行提取，因提取过程中对蛋白和盐存在非特异性吸附，降低了磁珠对核酸的提取量，同时为了降低蛋白和盐对下游扩增的抑制，核酸提取过程中需要将磁珠进行两步洗涤，洗涤过程中容易造成核酸的损失，使得核酸的回收率下降。


技术实现要素：

7.本发明目的在于提供一种核酸印迹磁珠的制备方法及其应用，以解决现有技术中的磁性微球磁性弱、磁流体团聚对核酸的选择性差的技术问题。
8.为实现上述目的，本发明的一种核酸印迹磁珠的制备方法及其应用的具体技术方案如下：
9.本发明提供一种用于提取核酸的印迹磁珠的制备方法，模拟分子印迹技术通过聚
合反应制备了对核酸(dna/rna)具有特异性吸附的靶向磁珠，所述的印迹磁珠的制备方案主要以核酸的基本组成单元：核苷酸(monophosphate,mp)作为模板分子，以含有双键的小分子为功能单体和偶联剂，通过乳液聚合的方式进行制备。
10.所述核酸印迹提取磁珠的制备工艺包括，四氧化三铁表面双键修饰、印迹聚合和模板洗脱三个部分，详细制备方法如下：
11.一、双键改性：
12.为了引入分子印迹层，将其表面进行双键改性。以四氧化三铁为载体，利用γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(mps)或者油酸对四氧化三铁表面进行改性，过程如下：80-120ml的无水乙醇溶液中加入0.1g四氧化三铁、1.5-2.5ml的nh3·
h2o和1ml的γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷或油酸，超声混匀后，加热回流3-5h，待其反应完全后，用乙醇进行洗涤，定至50ml。
13.二、分子印迹聚合：
14.在双键改性的磁性微球表面，以脱氧核苷三磷酸为模板分子，加入交联剂、引发剂，使模板分子在形状、尺寸、及化学基团互补的印迹孔穴中，得到磁性分子印迹聚合物。在三口烧瓶中分别加入50ml双键改性的四氧化三铁、0.01～0.1g脱氧核苷三磷酸(datp，dctp，dgtp，dttp)中的一种作为模板分子，80-100ml甲苯、50～200μl甲基丙烯酸甲酯(maa)作为功能单体，超声震荡15min，避光12h，形成模板-单体预聚物，然后依次再加入10-50μl交联剂乙二醇二甲基丙烯酸脂(egdma)作为偶联剂、0.05～0.2g 2,2偶氮二异丁腈(aibn)作为引发剂，室温下超声震荡15min，在65℃水浴中机械搅拌反应5～12h后，磁分离，用乙醇、水交替清洗没有反应的单体和模板分子。
15.三、模板分子去除：
16.用物理或化学的方法除去模板分子，此时识别位点保留在了高度交联的聚合物网络中，能够选择性的识别模板分子及其类似物，得到了为模板分子量衣定做的分子印迹磁珠。通过索氏提取法(甲醇：醋酸＝9：1的混合溶液)除去聚合物中的脱氧核苷三磷酸模板，紫外分光光度计检测萃取液中260nm处吸光情况，检测核苷酸是否去除完全，乙醇，水交替清洗三次，加水定容至10ml，获得核酸磁性分子印迹聚合物(mmip)。
17.所述印迹磁珠是以核酸的基本组成单元脱氧核苷三磷酸(datp，dctp，dgtp，dttp)中的一种作为模板制备，在核酸提取过程中能够特异性的吸附核酸，降低对盐和蛋白的非特异性吸附，极大提高下游检测的灵敏度和特异性。
18.本发明还提供了一种核酸印迹磁珠的的应用，在科研、临床、法医、食品安全领域，用于扩增、测序、杂交前的各种核酸提取检测。
19.本发明的一种核酸印迹磁珠的制备方法及其应用具有以下优点：所述印迹磁珠在核酸提取过程中能够特异性的吸附核酸，降低对盐和蛋白的非特异性吸附，极大提高下游检测的灵敏度；且该核酸印迹磁珠适用于扩增、测序、杂交前的各种核酸提取，在科研、临床、法医、食品安全等领域有着重要的应用。
附图说明
20.图1为实施例1中核酸印迹磁珠制备工艺路线图。
21.图2为实施例1中核酸印迹磁珠扫描电镜图。
22.图3为实施例1中核酸印迹磁珠红外光谱图。
23.图4为实施例1中选择性测试图。
24.图5为实施例1中扩增测试曲线。
25.图6为实施例2中选择性测试图。
26.图7为实施例2中扩增测试曲线。
具体实施方式
27.为了更好地了解本发明的目的、结构及功能，下面结合附图，对本发明一种核酸印迹磁珠的制备方法及其应用做进一步详细的描述。
28.如图1-图7所示，本发明模拟分子印迹技术通过聚合反应制备了对核酸(dna/rna)具有特异性吸附的靶向磁珠，所述印迹磁珠在核酸提取过程中能够特异性的吸附核酸，降低对盐和蛋白的非特异性吸附，极大提高下游检测的灵敏度和特异性。
29.实施例1：
30.一、双键改性：
31.四氧化三铁为载体，利用γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷对四氧化三铁表面进行改性，过程如下：100ml的无水乙醇溶液中加入0.1g四氧化三铁、2ml的nh3·
h2o和1ml的γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(mps)，超声混匀后，加热回流1-5h，待其反应完全后，用乙醇进行洗涤，定至50ml。
32.二、分子印迹聚合：
33.三口烧瓶中分别加入50ml双键改性的四氧化三铁、0.01g脱氧核苷三磷酸(datp)作为模板分子，90ml甲苯、100μl甲基丙烯酸甲酯(maa)作为功能单体，超声震荡15min，避光12h，形成模板-单体预聚物，然后依次再加入10μl交联剂乙二醇二甲基丙烯酸脂(egdma)作为偶联剂、0.05g 2,2偶氮二异丁腈(aibn)作为引发剂，室温下超声震荡15min，在65℃水浴中机械搅拌反应10h后，磁分离，用乙醇、水交替清洗没有反应的单体和模板分子。
34.三、模板分子去除：
35.通过索氏提取法(甲醇：醋酸＝9：1的混合溶液)除去聚合物中的脱氧核苷三磷酸模板，紫外分光光度计检测萃取液中260nm处吸光情况监测核苷酸是否去除完全，乙醇，水交替清洗三次，定容至10ml水，获得核酸磁性分子印迹聚合物(mmip)。
36.四、表征和性能测试
37.表征：将上述制备的mmip分别利用扫描电镜和红外光谱表征，分别见附图2和附图3。
38.图2可以看出，该印迹磁珠为粒径均一、表面粗糙的球形结构，粗糙的外表层，表明分子印迹聚合物成功包覆在四氧化三铁上。因此，以磁性四氧化三铁为核，以脱氧核苷三磷酸为模板分子的分子印迹磁珠制备成功。表面粗糙印迹层为去除模板分子之后形成的印迹孔穴，此时识别位点能够选择性的识别模板分子及其类似物。
39.从图3可以看出，580cm-1
波数处为fe-o振动吸收峰，1087cm-1
吸收峰为si-o-si伸缩振动峰，1640和1381cm-1
两处吸收峰为c＝c伸缩振动峰。另外，在1720cm-1
和1150cm-1
处分别归属于c＝o伸缩和c-o-c伸缩特征吸收峰，红外谱图分析表明mip成功包覆在四氧化三铁表面。
40.性能测定：性能测定包括核酸提取和扩增两个步骤，分别采用普通羟基磁珠和印迹磁珠对商品化的血浆核酸提取试剂盒和乙肝(hbv)扩增试剂盒进行提取效果和扩增效果评价。核酸提取后分别用微量核酸提取仪和扩增仪进行提取量和扩增效果进行验证，结果见图4和图5。
41.如图4所示，在同等用量的情况下，普通羟基磁珠的磁珠提取浓度为54.1ng/ul，260/230和260/280分别为1.78、1.88，印迹磁珠核酸的提取浓度为78.0ng/ul，260/230和260/280分别为1.86、2.22，可以看出，印迹磁珠的提取量是普通羟基磁珠的1.4倍，从260/280和260/230也可看出，核酸印迹磁珠对核酸选择性也高于普通羟基提取磁珠。
42.图5可以看出，印迹磁珠扩增曲线比普通羟基磁珠靠前2-3个ct值。
43.实施例2：
44.一、双键改性：
45.四氧化三铁为载体，利用油酸对四氧化三铁表面进行改性，过程如下：100ml的无水乙醇溶液中加入0.1g四氧化三铁、2ml的nh3·
h2o和1ml的油酸，超声混匀后，加热回流5h，待其反应完全后，用乙醇进行洗涤，定至50ml。
46.二、分子印迹聚合：
47.向三口烧瓶中分别加入50ml双键改性的四氧化三铁、0.05g脱氧核苷三磷酸(dgtp：dttp＝1：1)作为模板分子，90ml甲苯、100μl甲基丙烯酸甲酯(maa)作为功能单体，超声震荡15min，避光12h，形成模板-单体预聚物，然后依次再加入20μl交联剂乙二醇二甲基丙烯酸脂(egdma)作为偶联剂、0.1g 2,2偶氮二异丁腈(aibn)作为引发剂，室温下超声震荡15min，在65℃水浴中机械搅拌反应12h后，磁分离，用乙醇、水交替清洗没有反应的单体和模板分子。
48.三、模板分子去除：
49.通过索氏提取法(甲醇：醋酸＝9：1的混合溶液)除去聚合物中的脱氧核苷三磷酸模板，紫外分光光度计检测萃取液中260nm处吸光情况监测核苷酸是否去除完全，乙醇，水交替清洗三次，加水定容至10ml，获得核酸磁性分子印迹聚合物(mmip)。
50.四、性能测定：
51.性能测定包括核酸提取和扩增两个步骤，分别采用普通羟基磁珠和印迹磁珠对商品化的血浆核酸提取试剂盒和口腔拭子扩增试剂盒进行提取效果和扩增效果评价。核酸提取后分别用微量核酸提取仪和扩增仪进行提取量和扩增效果进行验证，结果见附图6和附图7。
52.如图6所示，在同等用量的情况下，普通羟基磁珠的磁珠提取浓度为50.0ng/ul，260/230和260/280分别为1.82、1.80，印迹磁珠核酸的提取浓度为84.8ng/ul，260/230和260/280分别为1.87、2.24，可以看出，印迹磁珠的提取量是普通羟基磁珠的1.70倍，从260/280和260/230也可看出，核酸印迹磁珠对核酸选择性也高于普通羟基提取磁珠。
53.图7可以看出，印迹磁珠扩增曲线比普通羟基磁珠靠前2-3个ct值。
54.上所述仅是本发明的优化实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，在此基础上做出的配方比例改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
55.可以理解，本发明是通过一些实施例进行描述的，本领域技术人员知悉的，在不脱
离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本申请的权利要求范围内的实施例都属于本发明所保护的范围内。