纯化含有至少一种鞘脂的液体组合物的方法与流程

纯化含有至少一种鞘脂的液体组合物的方法
1.本发明涉及用于纯化含有至少一种鞘脂的液体组合物的方法以及特定粘土矿物用于纯化这类液体组合物的用途。
2.近年来，从可再生资源生产的化合物被认为对生物塑料、洗衣、化妆品、食品或饲料产品等多种消费品的可持续生产是非常重要的，并且预期需求将甚至进一步增加。
3.然而，这类化合物的生产已被证明具有挑战性。最有希望的方法涉及使用天然或遗传修饰的微生物进行发酵生产。这方面的关键挑战包括确保就如此生产的化合物的产率和纯度而言工业可行的方法。这特别适用于属于真菌领域的微生物，例如酵母和霉菌。尽管这些微生物可用作多种化合物的可靠生产者，但它们也产生大量副产物的趋势使得经济生产变得困难，因为许多后续应用需要预先除去这些物质。主要的障碍是形成了不希望的属于一组被称为鞘脂的化合物的副产物，这些副产物导致变色和形成絮状物，这通常形成牢固的沉积物和/或导致产品浑浊。当发酵培养基在发酵过程之前已经灭菌的情况下尤其如此，而这对于大多数商业相关的生产方法而言是必须的。在发酵产品用于生物塑料或食品生产的情况下，变色是主要问题，沉积物的形成将降低进一步加工的效率或需要额外的高成本加工步骤。
4.本发明的发明人为自己设定的任务是提供用于纯化含有至少一种鞘脂的液体组合物的方法，所述方法是经济上可行的而且是环境友好的。
5.该任务已通过包含至少一种鞘脂的液体组合物的纯化方法得到解决，所述方法包括以下步骤：
6.(a)将0.1至35重量％的粘土矿物添加至所述液体组合物中，所述粘土矿物的bet表面积为50至450m2/g、最大直径为80nm的孔的微孔体积为0.01至0.75ml/g、sio2含量为25至98重量％且阳离子交换容量为20至120mval/100g；
7.(b)在10秒至90分钟的反应时间后分离粘土矿物。
8.因此，令人惊讶地发现，本发明方法不仅适用于工业规模生产，因为其不显示上述缺点，而且还能够通过解吸附将如此除去的鞘脂用于其它应用。由于这两种化合物对于化妆品的生产等各种其它工业应用具有高价值，这将有助于本发明方法的经济效益。即使不希望进一步使用这些化合物，如此除去的化合物仍然可以在沼气生产工艺中进行环保处理。本发明方法的另一个优点是即使在较高温度下，纯化产品也具有长期稳定性。如果液体组合物是含有酶的发酵培养基，本发明的方法不仅在长时间储存期间(即使在高温下)保持低浊度值，而且同时可以保持酶的酶活性。
9.在本发明中，术语“液体组合物”应理解为是指含有至少一种鞘脂的任何液体形式的组合物，而合适的液体组合物含有至少0.1重量％的鞘脂。在本发明方法的合适实施方案中，液体组合物是发酵培养基，其中本发明方法特别适用于由属于真菌领域的微生物如丝状真菌或酵母发酵的培养基。在本发明中，术语“发酵培养基”既指仍含有微生物的组合物(也称为“全发酵液”)，也指已经除去微生物的组合物(也称为“上清液”)。特别合适的是具有高初始(即在发酵之前)葡萄糖含量的培养基，例如葡萄糖含量为20至85重量％(葡萄糖重量/水重量)、30至85重量％、40至85重量％或45至80重量％。其它特别合适的培养基还含
有一定量的二糖和/或寡糖，例如1至20重量％(二糖和/或寡糖重量/水重量)或3至15重量％。在本发明方法的另一个特别合适的实施方案中，液体组合物是在发酵之前已经被热处理的发酵培养基，例如所述培养基可以在发酵发生之前已经被高压灭菌。通过使培养基经受高温和不同于环境气压的压力来进行高压灭菌。高压灭菌可以在100至140℃的温度下进行5分钟至12小时、或30分钟至10小时、或1小时至10小时的时间段。高压灭菌的方法是本领域技术人员熟知的。
10.在本发明方法的特别合适的实施方案中，发酵培养基是由丝状真菌发酵的培养基。丝状真菌可选自支顶孢属(acremonium)、曲霉属(aspergillus)、镰孢属(fusarium)、腐质霉属(humicola)、毛霉属(mucor)、毁丝霉属(myceliophthora)、脉孢菌属(neurospora)、青霉属(penicillium)、柱顶孢霉属(scytalidium)、梭孢壳属(thielavia)、弯颈霉属(tolypocladium)和木霉属(trichoderma)。发酵培养基还可以含有一种或多种酶。在发酵培养基是由丝状真菌发酵的培养基的情况下，发酵培养基含有至少一种具有水解活性的酶，例如但不限于纤维素酶和半纤维素酶，例如葡聚糖酶、木聚糖酶、葡糖苷酶、阿拉伯呋喃糖酶或甘露聚糖酶。
11.在本发明方法的特别合适的实施方案中，液体培养基含有0.1至35重量％的鞘脂，其中0.5至25重量％、1至20重量％或5至15重量％的含量也适用于本发明方法。
12.在本发明中，术语“鞘脂”是指任何种类的脂肪族氨基醇。在本发明中，术语“鞘脂”包括鞘氨醇碱及其衍生物。示例是鞘氨醇、二氢鞘氨醇、植物鞘氨醇、神经酰胺、鞘磷脂、鞘糖脂和神经节苷脂。
13.在本发明中，术语“沉积物”是指包含至少一种鞘脂、至少一种蛋白质和至少一种无机化合物的任何物质。它在液体组合物的储存过程中形成并源自沉淀在容器的底部的絮状物，并压实成更坚实的形式(“沉积物”)。
14.根据本发明方法的步骤(a)的“添加”可以通过本领域技术人员已知的适合于本发明目的的任何方法或措施进行。
15.在本发明中，术语“粘土矿物”是指任何为含水铝层状硅酸盐的矿物。特别适用于本发明方法的粘土矿物属于绿石或伊利石类，例如膨润土、蒙脱石或皂石及其混合物。其它合适的粘土矿物属于高岭土组。
16.在本发明特别合适的实施方案中，术语“粘土矿物”是指天然漂白土。术语“天然漂白土”应理解为包括可分类为膨润土、凹凸棒石、坡缕石或海泡石及其混合物的任何粘土矿物。所有种类的矿物是本领域技术人员熟知的，并且可以通过化学组成的标准测量和xrd测量(即其x射线衍射图)来鉴定。
17.在本发明特别优选的实施方案中，用于本发明方法的粘土矿物是钙膨润土。
18.天然漂白土可以在没有任何类型的进一步活化如热活化、酸活化或碱活化的情况下使用，或者可以在将其添加到液体组合物之前已经被酸活化或碱活化。漂白土的酸活化或碱活化是本领域技术人员已知的，并且可以同时进行热处理。漂白土的活化例如描述于ep 1893329、ep 2099561或ep 3110543中。
19.在本发明的方法中，粘土矿物以0.1至35重量％(粘土矿物重量/液体组合物重量)的量添加到液体组合物中，其中0.5至30重量％，例如0.25至25重量％、或0.5至15重量％、或0.5至10重量％、或0.75至15重量％、或0.75至8重量％的量是特别有效的。其它有效的量
为0.5至7重量％、或0.5至5重量％。
20.根据本发明的方法，粘土矿物具有50至450m2/g的bet表面积。在其它合适的实施方案中，bet表面积选自75至400m2/g、75至375m2/g、75至350m2/g、50至250m2/g、50至230m2/g和50至225m2/g。在特别合适的实施方案中，bet表面积选自50至225m2/g、50至215m2/g、50至205m2/g和50至190m2/g。参数“bet表面积”是本领域技术人员熟知的。根据din iso 9277进行测定。
21.根据本发明的方法，粘土矿物的最大直径为80nm的孔的微孔体积为0.01至0.75ml/g，其中最大直径为80nm的孔的孔体积为0.01至0.55ml/g、或0.05至0.45ml/g、或0.1至0.25ml/g也适用于本发明的方法。在本发明特别合适的实施方案中，粘土矿物的最大直径为80nm的孔的微孔体积为0.01至0.45ml/g、0.01至0.35ml/g、0.01至0.30ml/g和0.01至0.25ml/g。
22.在另一个合适的实施方案中，粘土矿物的最大直径为25nm的孔的微孔体积为0.03至0.6ml/g，其中最大直径为25nm的孔的孔体积为0.04至0.5ml/g、或0.05至0.45ml/g、或0.055至0.40ml/g也适用于本发明方法。在本发明特别合适的实施方案中，粘土矿物的最大直径为25nm的孔的微孔体积为0.01至0.35ml/g、0.01至0.30ml/g、0.01至0.25ml/g和0.01至0.20ml/g。
23.在另一个合适的实施方案中，粘土矿物的最大直径为14nm的孔的微孔体积为0.03至0.6ml/g，其中最大直径为14nm的孔的孔体积为0.04至0.5ml/g、或0.05至0.45ml/g、或0.055至0.40ml/g也适用于本发明方法。在本发明特别合适的实施方案中，粘土矿物的最大直径为14nm的孔的微孔体积为0.01至0.25ml/g、0.01至0.20ml/g、0.01至0.15ml/g和0.01至0.12ml/g。
24.根据din 66134的bjh方法测定微孔体积。确定的孔径范围内的孔体积通过对增量孔体积进行求和来测量，所述增量孔体积根据bjh由吸附等温线确定。这两种测量方法都是本领域技术人员熟知的。
25.根据本发明的方法，粘土矿物的sio2含量为25至98重量％，其中sio2含量为30至95重量％、30至90重量％、或35至85重量％也是合适的。适用于本发明方法的粘土矿物的另外的sio2含量为45至98重量％、或45至95重量％、或55至90重量％。在本发明特别合适的实施方案中，sio2含量选自25至75重量％、25至65重量％、25至60重量％和30至60重量％。粘土矿物的sio2含量的测量是本领域技术人员熟知的，并且示例性地描述于ep 2099561中。
26.根据本发明的方法，粘土矿物的阳离子交换容量为20至120mval/100g。阳离子交换容量的其它合适范围为25至110mval/100g、35至100mval/100g、或45至90mval/100g。本发明方法的粘土矿物的其它阳离子交换容量选自20至75mval/100g、或75至120mval/100g。阳离子交换容量(cec)是衡量有多少阳离子可以保留在土壤颗粒表面上的量度。阳离子交换容量的测量是本领域技术人员熟知的，并且示例性地描述于ep 1893329中，其通过引用并入本文。
27.在本发明方法的另一个合适的实施方案中，粘土矿物具有小于0.1mg cl/g的氯化物含量，而小于0.75mg cl/g、小于0.6mgcl/g、小于0.4mgcl/g、小于0.3mgcl/g、小于0.2mg cl/g和小于0.1mg cl/g的氯化物含量是特别合适的。氯化物含量的测量是本领域技术人员熟知的，并且优选通过使用硝酸并用硝酸银滴定来进行。
28.在本发明方法的另一个合适的实施方案中，粘土矿物具有小于15％的孔的孔径大于150μm、5至25％的孔的孔径大于100μm、18至45％的孔的孔径大于63μm、30至50％的孔的直径大于45μm和45至75％的孔的直径大于25μm的孔径分布。其它特别合适的孔径分布为小于10％的孔的孔径大于150μm、5至20％的孔的孔径大于100μm、22至40％的孔的孔径大于63μm、35至45％的孔的直径大于45μm和55至70％的孔的直径大于25μm。
29.在另一个合适的实施方案中，粘土矿物的al2o3含量为12至35重量％。
30.在根据本发明方法的步骤(a)将粘土矿物添加到所述液体组合物中之后，在根据本发明方法的步骤(b)的10秒至90分钟的反应时间之后，将粘土矿物从所述液体组合物中分离。在本发明方法的特别合适的实施方案中，反应时间选自30秒至60分钟、1分钟至60分钟、5分钟至60分钟，或15分钟至60分钟。所述分离可以通过本领域技术人员已知的适合于本发明目的的任何方法进行，但可以通过使用例如压滤机的固液分离进行。
31.在本发明方法的特别合适的实施方案中，在进行步骤(b)之前将0.1至30重量％的助滤剂添加到液体组合物中，而0.2至25重量％、0.5至20重量％和1至15重量％也是合适的。在本发明方法的甚至更合适的实施方案中，粘土矿物的量与助滤剂的量的比率为1:1至2:3。
32.因此，特别合适的是助滤剂和粘土矿物的混合物中助滤剂的量选择在50重量％至60重量％的范围内，并且助滤剂和粘土矿物的混合物中粘土矿物的量选择在40重量％至50重量％的范围内。
33.在特别合适的实施方案中，本发明的方法进一步包括以下步骤：
34.(a0)使所述发酵培养基进行固液分离以获得上清液。
35.在本发明的方法中，步骤(a0)是在步骤(a)之前进行。固液分离可以通过本领域技术人员已知的适合于本发明目的的任何方法进行。一种可能的方法是使用压滤机。
36.在另一个甚至更合适的实施方案中，本发明方法进一步包括以下步骤：
37.(a1)对通过固液分离获得的上清液进行超滤，并且其中步骤(a1)在步骤(a0)之后但在步骤(a)之前进行。
38.超滤可以通过本领域技术人员已知的适合于本发明目的的任何方法进行。进行超滤的特别合适的方法是使用膜的过滤方法，其中压力等力或浓度梯度导致通过半透膜的分离。悬浮固体和高分子量的溶质保留在所谓的渗余物中，而水和低分子量溶质通过膜在渗透液(滤液)中。进行超滤的甚至更合适的方法是使用含有具有10kda孔径的聚合物pes(聚醚砜)或由具有10kda孔径的聚合物pes(聚醚砜)组成的膜的过滤方法。超滤是本领域技术人员熟知的任何常用于过滤蛋白质溶液如发酵培养基的方法。
39.在本发明方法包括根据步骤(a1)的超滤步骤的情况下，在根据步骤(a)的本发明方法中使用的“液体组合物”是通过根据步骤(a1)的超滤获得的渗余物。
40.在另一方面，本发明涉及粘土矿物用于纯化含有至少一种鞘脂的液体组合物的用途，所述粘土矿物的bet表面积为50至450m2/g、最大直径为80nm的孔的微孔体积为0.01至0.75ml/g、sio2含量为25至85重量％且阳离子交换容量为20至120mval/100g。
41.以上关于本发明方法给出的定义和解释也适用于(但不限于)粘土矿物用于纯化含有至少一种鞘脂的液体组合物的发明用途。
42.在下文描述的本发明方法的特别优选的实施方案中，不应理解为在任何方面限制
本发明。应当理解，无论以下特别优选的实施方案是怎样的，如上定义的特征的任何组合都在本发明的范围内。
43.特别优选的实施方案1
44.用于纯化含有至少一种鞘脂的液体组合物的方法，包括以下步骤
45.(a)将0.1至35重量％的粘土矿物添加至所述液体组合物中，所述粘土矿物的bet表面积为75至400m2/g、最大直径为80nm的孔的微孔体积为0.05至0.45ml/g、sio2含量为45至98重量％且阳离子交换容量为35至100mval/100g；
46.(b)在10秒至90分钟，优选1分钟至60分钟的反应时间后分离粘土矿物。
47.特别优选的实施方案2
48.根据特别优选的实施方案1所述的方法，其中粘土矿物是天然膨润土，优选钙膨润土。
49.特别优选的实施方案3
50.根据特别优选的实施方案1所述的方法，其中粘土矿物是酸活化的膨润土或碱活化的膨润土，优选钙膨润土。
51.特别优选的实施方案4
52.根据特别优选的实施方案1-3中任一项所述的方法，其中所述粘土矿物具有小于0.3mg cl/g的氯化物含量。
53.特别优选的实施方案5
54.根据特别优选的实施方案1-4中任一项所述的方法，其中所述粘土矿物的最大直径为25nm的孔的微孔体积为0.04至0.5ml/g，并且其中所述粘土矿物的最大直径为14nm的孔的微孔体积为0.04至0.5ml/g。
55.特别优选的实施方案6
56.根据特别优选的实施方案1至5中任一项所述的方法，其中液体组合物是发酵培养基，优选由丝状真菌或酵母发酵的培养基，优选具有35至85重量％或40至65重量％的初始(即发酵前)葡萄糖含量，其中具有额外的初始(即发酵前)二糖和/或寡糖含量的培养基是特别合适的。
57.特别优选的实施方案7
58.根据特别优选的实施方案6所述的方法，其中所述培养基在进行发酵之前已进行热处理，优选在选自100至220℃的温度下，其中特别优选100至140℃，并经历30分钟至12小时或1小时至10小时的时间段。
59.特别优选的实施方案8
60.根据特别优选的实施方案1至7中任一项所述的方法，其中粘土矿物以0.1至15重量％(粘土矿物重量/液体组合物重量)的量添加，其中粘土矿物的量与助滤剂的量的比率优选为1:1至2:3。
61.特别优选的实施方案9
62.根据特别优选的实施方案8所述的方法，其中助滤剂和粘土矿物的混合物中助滤剂的量选择在50至60重量％(助滤剂重量/液体组合物重量)的范围内，并且助滤剂和粘土矿物的混合物中粘土矿物的量在40重量％至50重量％的范围内。
63.特别优选的实施方案10
64.根据特别优选的实施方案1至9中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括以下步骤
65.(a0)使所述发酵培养基进行固液分离以获得上清液，
66.其中步骤(a0)在步骤(a)之前进行，并且其中通过使用压滤机进行固液分离以获得上清液。
67.以及
68.(a1)对根据步骤(a0)通过固液分离获得的上清液进行超滤，并且其中步骤(a1)在步骤(a0)之后但在步骤(a)之前进行。
69.特别优选的实施方案11
70.根据特别优选的实施方案1至10中任一项所述的方法，其中所述粘土矿物具有小于10％的孔的孔径大于150μm、5至15％的孔的孔径大于100μm、18至40％的孔的孔径大于63μm、30至40％的孔的直径大于45μm和45至65％的孔的直径大于25μm的孔径分布。
71.特别优选的实施方案12
72.粘土矿物用于纯化含有至少一种鞘脂的液体组合物的用途，所述粘土矿物的bet表面积为75至400m2/g、最大直径为80nm的孔的微孔体积为0.05至0.45ml/g、sio2含量为45至98重量％且阳离子交换容量为35至100mval/100g。
73.特别优选的实施方案13
74.根据特别优选的实施方案12所述的用途，其中所述粘土矿物是天然膨润土，优选钙膨润土。
75.特别优选的实施方案14
76.根据特别优选的实施方案12或13中任一项所述的用途，其中所述粘土矿物是酸活化的或碱活化的膨润土，优选钙膨润土。
77.特别优选的实施方案15
78.根据特别优选的实施方案12至14中任一项所述的用途，其中所述粘土矿物具有小于0.3mg cl/g的氯化物含量。
79.特别优选的实施方案16
80.根据特别优选的实施方案12至15中任一项所述的用途，其中液体组合物是发酵培养基，优选由丝状真菌或酵母发酵的培养基。
81.特别优选的实施方案17
82.根据特别优选的实施方案16所述的用途，其中所述培养基在进行发酵之前已进行热处理，优选在选自100至220℃的温度下进行，其中100-140℃是特别优选的。
83.特别优选的实施方案18
84.用于纯化含有至少一种鞘脂的液体组合物的方法，包括以下步骤
85.(a)将0.1至35重量％的粘土矿物添加至所述液体组合物中，所述粘土矿物的bet表面积为50至210m2/g、最大直径为80nm的孔的微孔体积为0.01至0.25ml/g、sio2含量为25至60重量％且阳离子交换容量为35至100mval/100g；
86.(b)在10秒至90分钟，优选1分钟至60分钟的反应时间后分离粘土矿物。
87.特别优选的实施方案19
88.用于纯化含有至少一种鞘脂的液体组合物的方法，包括以下步骤
89.(a)将0.1至35重量％的粘土矿物添加至所述液体组合物中，所述粘土矿物的bet表面积为50至180m2/g、阳离子交换容量为42至110mval/100g且粒径为至少63μm的颗粒的量小于15％；
90.(b)在10秒至90分钟，优选1分钟至60分钟的反应时间后分离粘土矿物。
91.特别优选的实施方案20
92.粘土矿物用于纯化含有至少一种鞘脂和至少一种酶的液体组合物的用途，所述粘土矿物的bet表面积为50m2/g至180m2/g、阳离子交换容量为42mval/100g至110mval/100g且粒径为至少63μm的颗粒的量小于15％。
实施例
93.现在通过以下实施例和附图描述本发明。实施例和附图仅用于说明目的，不应理解为限制本发明。
附图说明
94.图1：显示了实验中形成的沉积物的重量，比较了几种吸附剂在防止沉积物方面的性能。较少的颗粒料意味着较好的吸附性能。该图描述了实施例1。
95.图2：显示了用几种剂量的粘土矿物i处理后在处理后即刻直至90天后滤液的浊度。该图描述了实施例2。
96.图3：显示了用粘土矿物i处理后在处理后即刻直至处理后90天后的滤液的浊度。在该实验中，粘土矿物i处理的温育时间是不同的。该图描述了实施例3。
97.图4：显示了来自里氏霉菌rutc30发酵的上清液在不同处理后的浊度。第一个未经处理。下面五列显示了用不同组合的助滤剂和粘土矿物i处理后的浊度。该图描述了实施例4。
98.图5：示出了用植物鞘氨醇和9-甲基-鞘氨醇提取的离子色谱图。该图描述了实施例5，实验1。
99.图6：显示另一个提取的离子色谱图。它是在粘土矿物i的沉积物分析中发现的峰和在颗粒料分析中发现的峰的重叠。该图描述了实施例5，实验2。
100.图7：显示粘土矿物处理后的浊度，包括储存时间10天后的浊度
101.图8：显示用粘土矿物1处理后以及长时间储存条件下的浊度和酶活性。
102.实施例1-吸附剂的选择
103.用几种吸附剂处理来自里氏霉菌rutc30菌株发酵的上清液，以便从上清液中除去鞘脂。如果该物质留在溶液中，如果将上清液储存在21℃以上的温度下(这通常在储存过程中提供冷却)，将导致浊度升高并且最终导致沉积物层。
104.测试了以下吸附剂。
[0105][0106][0107]
将上清液分布在5个5ml的管中。每管填充4g的上清液。将0.4g的上述吸附剂添加到各个管中。空白样保持未处理。将混合物在室温下在高架振荡器中温育30分钟。温育后，离心所述管以从溶液中分离吸附剂。将上清液倒入5个新的5ml的管中。将上清液在25℃温
育10天，然后以12.700rpm离心5分钟。如预期的，管5，空白样中出现沉淀物，并且在离心后形成颗粒料。管1和2发生相同情况。储存在管3和4中的上清液保持澄清并且未显示颗粒料。湿颗粒料的重量示于图1中。该实施例表明，两种膨润土吸附剂(粘土矿物i和ii)都可以除去引起沉积物的物质。用膨润土粘土矿物i(管号3)进行所有以下实施例。
[0108]
实施例2-最小剂量的确定
[0109]
将来自里氏霉菌rutc30发酵的上清液用几种量的膨润土粘土矿物i处理以获得0.01重量％至2重量％的最小有效剂量。将上清液分布在7个50ml的管中。每管填充30g的上清液。添加以下量的粘土矿物i。
[0110][0111][0112]
将混合物在室温下在高架振荡器中温育60分钟。随后，通过过滤(0.2μm的截止值)除去粘土矿物i。将滤液放入新的50ml的管中并在25℃下温育。在过滤后即刻、在吸附后第6天、第9天、第13天、第23天、第48天和第90天时测量这些滤液的浊度。以fnu(formazine nephelometric unit)测量。结果如图2所示。可以看出，如果未用粘土矿物i(0.00重量％)处理上清液，则浊度在仅3个月的时间内增至三倍。浊度的形成可以用0.5重量％的处理减半并且通过添加2.00重量％几乎完全避免。作为结论，用0.5重量％的粘土矿物i处理被确定为最小剂量。
[0113]
实施例3-理想的温育时间的确定
[0114]
为了获得理想的温育时间，将来自里氏霉菌rutc30菌株发酵的上清液分布在4个50ml的管中，每个管填充30g的上清液。它们中的三个用0.5重量％的粘土矿物i处理并根据下表进行温育。另外，取一个空白样用于比较。空白样没有经历任何粘土矿物i处理。
[0115]
管号温育时间11233194空白样(未用粘土矿物i处理)
[0116]
将混合物在室温下在高架振荡器中温育。随后，通过过滤(0.2μm的截止值)除去粘土矿物i。将滤液放入新的50ml的管中并在25℃下温育。在过滤后即刻、在吸附后第6天、第9天、第13天、第23天、第48天和第90天时测量这些滤液的浊度。以fnu(formazine nephelometric unit)测量。结果如图3所示。该图显示，温育1小时具有与温育19小时相同的长期效应。浊度降低至相同水平。
[0117]
实施例4-并入工业上可应用的方法中
[0118]
为了将粘土矿物i处理并入工业上可应用的下游方法中，在本发明的方法中使用的任何粘土矿物都需要通过可以取出大量固体的过滤步骤除去。压滤机的预测试通过压力吸滤器(nutsch)进行。该装置模拟在工业规模的方法中广泛使用的压滤机上的条件。对于先进的颗粒去除，作为标准，将5重量％的助滤剂添加到上清液中，然后使其通过所述吸滤器。
[0119]
使用具有以下参数的助滤剂：
[0120]
参数规格类型珍珠岩，无定形硅酸盐物理形式干粉流速(pfrv)16-40滤饼密度(湿)最大值26.0lbs/ft3浮子最大值2(ml/20g)
[0121]
在该实验中，助滤剂的量逐渐被粘土矿物i替代。将上清液分布在六个200ml的烧杯中，每个烧杯填充100g的上清液。按照下表用助滤剂和粘土矿物i处理内容物，并在21℃温育1小时。
[0122]
管号助滤剂[重量％]粘土矿物i[重量％]10521432.52.5432541650
[0123]
对6个样品中的每一个进行压力吸滤器试验。用200毫巴的n2压力将样品挤压通过滤布。使用商品名为ppd3133(500l/dm2/min)的滤布。图4显示过滤后滤液的浊度。浊度越低，过滤越成功。用于评估过滤质量的一个重要参数是精细滤饼的产生。对于样品1，没有滤饼形成。这意味着粘土矿物i不能被滤布截留并在滤液中发现。这一事实解释了与未处理的材料相比，滤液1的浊度升高的原因。3重量％助滤剂和2重量％粘土矿物i的混合物产生胶状滤饼。这意味着在该组合中助滤剂能够将粘土矿物i截留。这也通过样品4的低滤液浊度来验证。用5重量％助滤剂处理的样品形成粉末状滤饼。该滤饼不能像样品4中的组合那样降低一样多的起始浊度。这意味着，粘土矿物i除了其优异的吸附剂质量之外，当与助滤剂混合时还具有过滤效果。
[0124]
实施例5-引起沉积物的物质的鉴定
[0125]
该实施例由2个实验组成。
[0126]
第一个是沉积物的分析。第二个是处理后被粘土矿物i粉末结合的颗粒的分析。
[0127]
对于实验1，将来自里氏霉菌rutc30菌株发酵的上清液分布在三个5ml的管中。每管填充4g的上清液，并在25℃下温育。10天后形成沉积物。
[0128]
对所述管进行离心。将颗粒料1与80％的甲醇溶液混合，颗粒料2与异丙醇混合，颗粒料3与己烷混合，以溶解沉淀的物质。再次离心所述管以将溶剂与颗粒料的不溶性部分分离。
[0129]
在lc-ms测量中分析所有含有溶解物质的溶剂。使用与配备有hesi-ii离子源的q-exactive plus质谱仪(thermo fisher scientific，德国)连接的ultimate 3000uplc系统(thermo fisher scientific，德国)进行lc-ms分析。
[0130]
用nucleodur c18重力柱(100x 2mm，i.d.1.8μm)，使用0.1％的甲酸/水(溶剂a)和0.1％甲酸/乙腈(溶剂b)作为流动相。流速为0.25ml/min，柱温箱保持在35℃。
[0131]
用于分离的梯度如下：0分钟，0％b；3分钟，0％b；15分钟，95％b；17分钟，95％b；18分钟，0％b；22分钟，0％b。
[0132]
q exactive plus以正离子模式运行。离子源温度设定为400℃且喷雾电压为3500v。使用全扫描/dd-ms
2 top 5ms方法进行样品分析。全扫描的分辨率设置为70 000，并且在100-1000m/z的扫描范围内检测离子。前5个离子被分离(分离窗口：1.6m/z)并通过具有20ev能量的hcd碎裂。
[0133]
异丙醇和己烷样品在lc-ms图中都没有显示峰。
[0134]
相比之下，80％甲醇样品显示颜色变化，并且在lc-ms分析中显示出两个主峰。图5描述了显示这些峰的提取离子色谱图。检测质量为m/z[m+h]
+
＝318.2991(δm＝3.6ppm；总分子式：c18h39no3)，保留时间为13.87分钟，m/z[m+h]
+
＝312.2892(δm＝1.6；总分子式：c19h37no2)，保留时间为14.08分钟。它们的总和分子式及其ms/ms碎片模式与植物鞘氨醇和9-甲基-鞘氨醇相匹配。其它峰可测定为脂肪酸和鞘脂衍生物的混合物。
[0135]
这证明沉积物在上清液中含有相当量的植物鞘氨醇和9-甲基-鞘氨醇，这导致观察到的浊度。
[0136]
第二个实验处理以下问题：在本发明的方法中是否从上清液中取出这些物质？
[0137]
为了回答该问题，将5ml的新鲜上清液用2重量％的粘土矿物i处理并温育1小时。通过以12.700rpm离心5分钟除去粘土矿物i。将粘土矿物i颗粒料与4ml的纯甲醇混合。温育1小时后，再次以12.700rpm离心该混合物5分钟。然后在与实验1相同的条件下在lc-ms测量中分析上清液甲醇。
[0138]
分析显示，在保留时间13.87分钟和14.08分钟处的两个峰也是占优势的。图6显示了另一个提取的离子色谱图，其具有在粘土矿物i的沉淀分析中发现的峰和在颗粒料分析中发现的峰的重叠。因此，可以说，植物鞘氨醇和9-甲基-鞘氨醇在处理过程中吸附到粘土矿物i粉末上，因此可以通过本发明的方法从产品中取出。随着这些鞘脂从产品中取出，稳定性提高并且可以防止在25℃下沉淀。
[0139]
实施例6-稳定性的测定
[0140]
用几种粘土矿物处理来自里氏霉菌rutc30菌株发酵的上清液(以下称为“上清液”)，以从上清液中除去鞘脂。
[0141]
测试了以下粘土矿物。
[0142]
[0143]
[0144][0145]
将上清液分布在8个50ml的管中。每管填充20g的上清液。将2g每种粘土矿物样品(粘土矿物i、iii、iv、v、vi、vii和viii)添加到相应的管中。空白样保持未处理。将混合物在室温下在高架振荡器中温育30分钟。温育后，离心所述管，以从溶液中分离粘土矿物样品。将上清液倒入8个新的50ml的管中。立即测量浊度。将上清液在25℃下温育10天，然后再次测量浊度。如预期的，在管8(空白样)中发生沉积物形成。可以看出，bet表面积为60至180m2/g、阳离子交换容量为42至110mval/100g且少量粒径为至少63μm的颗粒的粘土矿物不仅在处理后即刻显示出降低的浊度，而且甚至在10天的储存时间后也显示出低浊度。实施例6的结果示于图7中。
[0146]
实施例7-用粘土矿物i处理后上清液的酶活性和长期稳定性
[0147]
来自里氏霉菌rutc30发酵的120ml的上清液(以下称为“上清液”)用作本实施例的材料。用0.5重量％的粘土矿物i处理60ml。处理后，将该上清液分配到三个50ml的管中以进行稳定性测试，每个管中20ml。将三个管储存在3个温度(5℃、25℃和40℃)下，以进行长期稳定性试验。作为空白样，将剩余的60ml的上清液也分配到三个50ml的管中并在5℃、25℃和40℃下储存。由于上清液含有活性酶，酶活性用作测量上清液稳定性的参数。在开始时、5周后、26周后和61周后测量酶活性。测量如下进行：
[0148]
在各温度下从储存位置取出一个50ml的管。从所述管中取出1ml。立即将管放回其储存位置。使用1ml进行活性分析。
[0149]
通过孔径为0.45μm的过滤器过滤所述样品体积。用以下缓冲液以1:100稀释样品：
50mm乙酸钠(ph 5)+0.1％吐温20。然后将20μl稀释的样品加热至37℃的温度。添加同样预热至37℃的100μl的2mm 4-硝基苯基β-d-吡喃乳糖苷。在300秒的温育时间后，添加同样预热至37℃的120μl的1m碳酸钠(na2co3)以将ph提升至碱性范围。溶液中的酶将4-硝基苯酚从底物4-硝基苯基-β-d-吡喃乳糖苷中去除。在碱性ph下，4-硝基苯酚具有黄色。在另一个30秒的温育时间后，在405nm处光度测量溶液的黄色。酶活性越高，黄色越强。除样品外，在该分析中还测量了对照样品。它具有确定的酶活性，以u/ml给出。通过将对照样品的黄色强度与样品的黄色相关联，也可以将以u/ml计的活性相关联。分析结果是以u/ml给出的样品中酶的酶活性。
[0150]
图8显示酶活性测量的结果。可以看出，在40℃下温育61周后，未经粘土矿物i处理的上清液(空白样)具有40％的剩余活性。用粘土矿物i处理的上清液显示80％的剩余活性(相等的储存时间和温度)。因此，用粘土矿物i处理导致在高温下较高的长期稳定性。