一种新型冠状病毒核酸提取试剂盒及核酸提取方法与流程

本发明属于核酸提取
技术领域：
，具体涉及一种新型冠状病毒核酸提取试剂盒及提取方法。
背景技术：
：国家卫生健康委多次印发新型冠状病毒肺炎诊疗方案，始终将逆转录实时荧光定量聚合酶链式反应(reversetranscriptionquantitativereal-timepoly-merasechainreaction，rt-qpcr)检测新型冠状病毒的核酸作为确诊及治疗监测的重要指标。病毒核酸提取纯化经pcr扩增鉴定后，检测的结果可以作为临床参考的依据之一。但由于外源及内源性核酸酶的存在及其酶活性相当稳定等原因，使得提取和纯化高质量的病毒核酸相对比较困难。核酸提取试剂配方对核酸的质量和得率有很大的影响，因此研发高效快速、得率高的核酸提取试剂是本领域不断探索的课题。磁珠法作为可应用自动化的核酸提取方法，主要原理是基于磁珠在高盐溶液中对核酸进行特异性的吸附，经过磁性分离和漂洗蛋白质和多糖等杂质后，在低盐溶液中被洗脱下来，从而达到对核酸进行提取纯化的目的。目前常用核酸提取技术提取流程复杂、时间长且核酸提取效率较低，无法满足临床检测需求；常用的病毒核酸提取纯化技术有trizol法、离心柱法等方法。trizol法利用dna、rna、蛋白质在有机层和水相层分布位置的不同而分离蛋白质与核酸，提取核酸步骤繁琐，对不同的样本提取效果重复性不佳，从样本裂解到获得核酸至少需要1.5h，其操作繁琐、耗时长，不宜在临床检测使用。常规的离心吸附柱法提取核酸时操作相对复杂，耗时较长。技术实现要素：本发明的目的提供一种适合提取核酸的新型生物纳米磁珠，具有提高rna提取纯度和稳定性，保护rna不被降解的作用。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明公开了一种新型生物纳米磁珠的制备方法，包括以下步骤：将fec13·6h2o和fec12·4h2o的盐酸溶液在搅拌下加入氨水，搅拌反应后磁分离，将所得固体物质洗涤得到fe3o4；将fe3o4与蒸馏水混匀后再与异丙醇混合，边振荡搅拌边加入peg，继续搅拌后加入蒸馏水和teos，搅拌后磁分离，将所得固体物质洗涤即得fe3o4@sio2纳米磁珠；将尿素在热回流下与氯甲基三甲氧基硅烷反应，反应后进行减压蒸馏，收集目标馏分即得改性硅烷偶联剂；取fe3o4@sio2纳米磁珠分散于无水甲苯中，搅拌下缓慢加入改性硅烷偶联剂，搅拌反应后磁分离，将所得固体物质洗涤即得新型生物纳米磁珠。本发明制备方法采用尿素对氯甲基三甲氧基硅烷进行改性，然后获得的改性硅烷偶联剂对fe3o4@sio2进行改性获得新型生物纳米磁珠，接枝到纳米磁珠的表面，该新型生物纳米磁珠可以更好地抑制rna酶，保护已经吸附在纳米磁珠上的rna不被降解，即使没有及时将rna从纳米磁珠上洗脱，rna也可以保存较长的时间不被降解，提高rna的稳定性；本发明制备方法还可以提高纳米磁珠的核酸提取效果，提高rna提取纯度。优选地，盐酸溶液的浓度为1-3m。优选地，氨水的浓度为1-2m。更优选地，fec13·6h2o和fec12·4h2o质量比为1:0.3-0.5。优选地，fe3o4、peg和teos的质量比为0.01:1:0.8-1.2。优选地，peg为peg2000、peg4000或peg6000。优选地，尿素和氯甲基三甲氧基硅烷的质量比为1:0.8-1.2。优选地，fe3o4@sio2和改性硅烷偶联剂的质量比为0.05-0.06:1。优选地，一种新型生物纳米磁珠的制备方法，包括以下步骤：按重量份计，将1份fec13·6h2o、0.3-0.5份fec12·4h2o和4-6份1-3m盐酸溶液在搅拌下加入1.1-1.5份1-2m的氨水，搅拌反应30-40min后磁分离，将所得固体物质洗涤得到fe3o4；按重量份计，将0.01份fe3o4与0.4-0.6份蒸馏水混匀后再与30-50份异丙醇混合，边振荡搅拌边加入1份peg，继续搅拌10-15min后加入2-5份蒸馏水和0.8-1.2份teos，搅拌后磁分离，将所得固体物质洗涤即得fe3o4@sio2纳米磁珠；将1份尿素在热回流下与0.8-1.2份氯甲基三甲氧基硅烷反应3-5h，反应后进行减压蒸馏，收集目标馏分即得改性硅烷偶联剂；按重量份计，取0.05-0.06份fe3o4@sio2纳米磁珠分散于10-15份无水甲苯中，搅拌下缓慢加入1份改性硅烷偶联剂，搅拌反应12-36h后磁分离，将所得固体物质洗涤即得新型生物纳米磁珠。本发明还公开了一种上述方法制得的新型生物纳米磁珠。本发明还公开了新型生物纳米磁珠在提取核酸中的用途。磁珠法提取核酸除了手工提取外，还可以配合使用自动核酸提取仪，所以能有效节约时间和人工成本，非常适合对大批量样本的核酸提取。磁珠法与传统非磁性方法相比，步骤简单，无需离心，从而能够真正实现高通量自动化核酸提取。此方法还能够除去大多数干扰pcr反应的抑制因子，如蛋质、多糖、酚类物质，降低假阴性率。本发明的另一个目的提供一种提取高纯度、高浓度核酸且所提取的核酸不易被降解的新型冠状病毒核酸提取试剂盒。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种新型冠状病毒核酸提取试剂盒，包括新型生物纳米磁珠制成的悬液。本发明新型冠状病毒核酸提取试剂盒可以高效地提取高纯度和高浓度的核酸。优选地，新型生物纳米磁珠制成的悬液的浓度为50-55mg/ml。优选地，新型生物纳米磁珠悬液中加入甘氨酸盐酸盐。加入甘氨酸盐酸盐可以有效提高提取核酸的产量，获得高浓度的核酸，且有利于核酸纯度的提高，方便进行后续检测和实验。更优选地，加入甘氨酸盐酸盐的浓度为1-3mol/l。优选地，新型冠状病毒核酸提取试剂盒还包括裂解液、洗涤液1、洗涤液2和洗脱液。优选地，裂解液的成分包括tris-hcl和异硫氰酸胍。异硫氰酸胍是强蛋白质变性剂，可迅速破坏细胞结构，裂解细胞，使核酸从核蛋白中释放出来，同时其对rna酶有强烈的变性作用，是很好的rna酶抑制剂。因此在裂解液中加入了异硫氰酸胍。更优选地，裂解液中tris-hcl的浓度为10-12mmol/l、ph为7.0，异硫氰酸胍的浓度为3-5mol/l。优选地，裂解液成分为tris-hcl和新型生物纳米磁珠悬液。由于新型生物纳米磁珠接枝的改性尿素有裂解病毒、使蛋白质变性、抑制rna酶的作用，因此裂解液中可使用新型生物纳米磁珠悬液代替异硫氰酸胍。优选地，洗涤液1的成分包括氯仿异戊醇混合溶液；洗涤液2的成分包括乙醇。更优选地，洗涤液1中氯仿异戊醇溶液中氯仿和异戊醇的比例为24:1。更优选地，洗涤液2中乙醇的体积分数为70-75％。优选地，洗脱液的成分包括tris-hcl、edta和乙醇。更优选地，洗脱液中tris-hcl的浓度为10-12mmol/l、ph为6.5；edta的浓度为3-5mol/l；乙醇的体积分数为2-3％。优选地，新型冠状病毒核酸提取试剂盒包括五个容器：第一容器为新型生物纳米磁珠悬液，第二容器为裂解液，第三容器为洗涤液1，第四容器为洗涤液2，第五容器为洗脱液。本发明的另一个目的提供一种使用本发明新型冠状病毒核酸提取试剂盒高效提取高质量核酸的方法。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种使用本发明新型冠状病毒核酸提取试剂盒提取新型冠状病毒核酸的方法，包括如下步骤：在样本中加入裂解液于室温裂解后加入洗涤液1，振荡并离心后取上清液加入新型生物纳米磁珠悬液于室温吸附；吸附后去除上清液并加入洗涤液2混匀；静置后去除上清液并晾干；晾干后加入洗脱液于室温洗脱即得rna溶液。优选地，一种使用本发明新型冠状病毒核酸提取试剂盒提取新型冠状病毒核酸的方法，包括如下步骤：取样本2-4ml，加入裂解液混匀，室温裂解5-8min；加入200-220μl洗涤液1，振荡30s，13000r/min离心5-8min；离心后取180-200μl上清到一个新的ep管中，加入200-220μl新型生物纳米磁珠悬液并振荡混匀，室温吸附5-8min，静置20-30s，去除上清液；加入500-550μl洗涤液2，混匀，静置20-30s，去除上清液，室温晾干15-20min；加入70-75μl洗脱液并混匀，室温洗脱10-12min，静置20-30s，将rna溶液转移至新的ep管中，-80℃保存。优选地，上述提取方法获得的新型冠状病毒核酸在常温和4℃下保存。本发明还公开了上述改性硅烷偶联剂，其为尿素和氯甲基三甲氧基硅烷反应获得。本发明还公开了上述改性硅烷偶联剂在制备新型生物纳米磁珠中的用途。优选地，改性硅烷偶联剂在提高纳米磁珠抑制rna酶中的用途。优选地，改性硅烷偶联剂在提高纳米磁珠的核酸提取效果中的用途。本发明具有以下有益效果：新型生物纳米磁珠表面接枝有改性硅烷偶联剂，可以裂解细胞和抑制酶的活性。将改性硅烷偶联剂直接接枝到纳米磁珠的表面，可以更好地抑制rna酶，保护已经吸附在纳米磁珠上的rna不被降解。即使没有及时将rna从纳米磁珠上洗脱，rna也可以保存较长的时间不被降解。本发明新冠病毒核酸提取试剂盒可以提取高质量高浓度的核酸，同时，使用本发明新型冠状病毒核酸提取试剂盒提取核酸的方法还能够除去大多数干扰pcr反应的抑制因子，如蛋质、多糖、酚类物质，降低假阴性率。由于磁球微粒的合成采用的都是低价无机原料和有机原料，无须特殊的仪器设备，大大降低了合成和研发的成本。附图说明图1为改性硅烷偶联剂的红外光谱图；图2为新型生物纳米磁珠的红外光谱图；图3为使用本发明新型冠状病毒核酸提取试剂盒提取的样本进行实时荧光定量逆转录pcr扩增的结果。具体实施方式这里将详细地对示例性实施例进行说明，以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本公开相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本公开的一些方面相一致的方法的例子。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1一、新型生物纳米磁珠的制备按重量份计，将1份fec13·6h2o、0.38份fec12·4h2o和5份1.5m盐酸溶液在搅拌下加入1.12份1m的氨水，搅拌反应35min后磁分离，将所得固体物质洗涤得到fe3o4；按重量份计，将0.01份fe3o4与0.5份蒸馏水混匀后再与45份异丙醇混合，边振荡搅拌边加入1份peg，继续搅拌12min后加入2.5份蒸馏水和1份teos，搅拌后磁分离，将所得固体物质洗涤即得fe3o4@sio2纳米磁珠；将1份尿素在热回流下与1份氯甲基三甲氧基硅烷反应3.5h，反应后进行减压蒸馏，收集目标馏分即得改性硅烷偶联剂；按重量份计，取0.05份fe3o4@sio2纳米磁珠分散于15份无水甲苯中，搅拌下缓慢加入1份改性硅烷偶联剂，搅拌反应20h后磁分离，将所得固体物质洗涤即得新型生物纳米磁珠。二、新型冠状病毒核酸提取试剂盒的组成新型冠状病毒核酸提取试剂盒组成成分及浓度如表1和表2所示。表1新型冠状病毒核酸提取试剂盒组成成分容器组分名称容量(ml)成分第一容器新型生物纳米磁珠悬液5新型生物纳米磁珠、甘氨酸盐酸盐第二容器裂解液100tris-hcl、异硫氰酸胍第三容器洗涤液160氯仿、异戊醇第四容器洗涤液275乙醇第五容器洗脱液10tris-hcl、edta、乙醇表2新型冠状病毒核酸提取试剂盒各组成成分的浓度实施例2一、新型生物纳米磁珠的制备同实施例1。二、新型冠状病毒核酸提取试剂盒新型冠状病毒核酸提取试剂盒组成成分及浓度如表3和表4所示。表3新型冠状病毒核酸提取试剂盒组成成分容器组分名称容量(ml)成分第一容器新型生物纳米磁珠悬液5新型生物纳米磁珠、甘氨酸盐酸盐第二容器裂解液100tris-hcl、新型生物纳米磁珠悬液第三容器洗涤液160氯仿、异戊醇第四容器洗涤液275乙醇第五容器洗脱液10tris-hcl、edta、乙醇表4新型冠状病毒核酸提取试剂盒各组成成分的浓度实施例3一、新型生物纳米磁珠的制备同实施例1。二、新型冠状病毒核酸提取试剂盒新型冠状病毒核酸提取试剂盒组成成分及浓度如表5和表6所示。表5新型冠状病毒核酸提取试剂盒组成成分容器组分名称容量(ml)成分第一容器新型生物纳米磁珠悬液2新型生物纳米磁珠第二容器裂解液100tris-hcl、异硫氰酸胍第三容器洗涤液160氯仿、异戊醇第四容器洗涤液275乙醇第五容器洗脱液10tris-hcl、edta、乙醇表6新型冠状病毒核酸提取试剂盒各组成成分的浓度对比例1一、新型生物纳米磁珠的制备按重量份计，将1份fec13·6h2o、0.38份fec12·4h2o和5份1.5m盐酸溶液在搅拌下加入1.12份1m的氨水，搅拌反应35min后磁分离，将所得固体物质洗涤得到fe3o4；按重量份计，将0.01份fe3o4与0.5份蒸馏水混匀后再与45份异丙醇混合，边振荡搅拌边加入1份peg，继续搅拌12min后加入2.5份蒸馏水和1份teos，搅拌后磁分离，将所得固体物质洗涤即得fe3o4@sio2纳米磁珠；按重量份计，取0.05份fe3o4@sio2纳米磁珠分散于15份无水甲苯中，搅拌下缓慢加入1份氯甲基三甲氧基硅烷，搅拌反应20h后磁分离，将所得固体物质洗涤即得新型生物纳米磁珠。二、新型冠状病毒核酸提取试剂盒新型冠状病毒核酸提取试剂盒组成成分及浓度如表7和表8所示。表7新型冠状病毒核酸提取试剂盒组成成分容器组分名称容量(ml)成分第一容器新型生物纳米磁珠悬液5新型生物纳米磁珠、甘氨酸盐酸盐第二容器裂解液100tris-hcl、异硫氰酸胍第三容器洗涤液160氯仿、异戊醇第四容器洗涤液275乙醇第五容器洗脱液10tris-hcl、edta、乙醇表8新型冠状病毒核酸提取试剂盒各组成成分的浓度对比例2一、新型生物纳米磁珠的制备同对比例1。二、新型冠状病毒核酸提取试剂盒新型冠状病毒核酸提取试剂盒组成成分及浓度如表9和表10所示。表9新型冠状病毒核酸提取试剂盒组成成分容器组分名称容量(ml)成分第一容器新型生物纳米磁珠悬液5新型生物纳米磁珠、甘氨酸盐酸盐第二容器裂解液100tris-hcl、fe3o4@sio2纳米磁珠悬液第三容器洗涤液160氯仿、异戊醇第四容器洗涤液275乙醇第五容器洗脱液10tris-hcl、edta、乙醇表10新型冠状病毒核酸提取试剂盒各组成成分的浓度对比例3一、新型生物纳米磁珠的制备同对比例1。二、新型冠状病毒核酸提取试剂盒新型冠状病毒核酸提取试剂盒组成成分及浓度如表11和表12所示。表11新型冠状病毒核酸提取试剂盒组成成分表12新型冠状病毒核酸提取试剂盒各组成成分的浓度试验例1一、改性硅烷偶联剂的红外表征采用傅立叶红外吸收光谱仪分别对样品进行表征，以kbr进行压片制样，波数范围为500-4000cm-1。实施例1得改性硅烷偶联剂的红外表征如图1所示。图1中3300cm-1附近出现n-h的吸收特征峰；2930cm-1附近出现甲基亚甲基的吸收峰；1720cm-1附近出现c＝o的吸收特征峰；1610cm-1附近出现n-h的吸收振动峰；1130cm-1附近出现si-och3吸收峰。说明硅烷偶联剂改性成功。二、新型生物纳米磁珠的红外表征采用傅立叶红外吸收光谱仪分别对样品进行表征，以kbr进行压片制样，波数范围为500-4000cm-1。实施例1得新型生物纳米磁珠的红外表征如图2所示。由图2可以看出600cm-1附近为fe-o的特征吸收峰；1000cm-1附近为si-o-si的特征吸收峰；1620cm-1附近为n-h的吸收振动峰；1690cm-1附近为c＝o的吸收特征峰；3390cm-1附近为-oh的伸缩振动峰。说明改性硅烷偶联剂成功接枝到fe3o4@sio2纳米磁珠上，成功获得新型生物纳米磁珠。试验例2新型冠状病毒核酸提取使用本发明新型冠状病毒核酸提取试剂盒对含有新型冠状病毒的鼻拭子、咽拭子、唾液和尿液样本进行核酸提取。取2ml样本，加入裂解液50μl，混匀，室温裂解5min；加入200μl洗涤液1，振荡30s，13000r/min离心5min；取200μl上清到一新的ep管中，加入200μl新型生物纳米磁珠悬液，振荡混匀，室温吸附5min，静置20s，去除上清液；加入500μl洗涤液2，混匀，静置20s，去除上清液，室温晾干15min；加入70μl洗脱液，混匀，室温洗脱10min，静置20s，将rna溶液转移至新的ep管中，-80℃保存。试验例3新型冠状病毒核酸提取效果的检测使用实施例1、实施例2、对比例1、对比例2、对比例3中的新型冠状病毒核酸提取试剂盒，按照试验例2所述方法对样本中的新型冠状病毒核酸进行提取，提取后检测rna的浓度，并且分别在260nm和280nm处检测洗脱的rna的吸光度，判断提取的rna的纯度是否可以进行pcr扩增反应。然后将可以进行pcr扩增反应的样本，使用上海捷诺生物科技有限公司生产的新型冠状病毒核酸扩增(pcr)荧光定量检测试剂盒(批号：gztr2020005，国械注准20203400058)进行pcr扩增。样本为携带新型冠状病毒的咽拭子、鼻拭子、唾液以及尿液。实时荧光定量逆转录pcr扩增体系(25ml)：反应液12.5ml，无菌去离子水7.0ml，酶混合液1.0ml，荧光探针2.5ml，样本中提取的病毒rna2.0ml。扩增程序为：42℃5min；95℃10s；95℃5s，60℃35s(此阶段结束时采集荧光信号)，共40个循环。结果判定：ct值≤37判为阳性；37＜ct值＜40判为可疑，需重新提取核酸，如仍为可疑，则判为阳性；ct值≥40或无ct值判为阴性。rna浓度与260nm和280nm处检测洗脱的rna的吸光度的结果如表13所示。表13rna提取浓度和纯度由表13可以看出使用对比例2中新型冠状病毒核酸提取试剂盒无法提取出足够纯度的rna，因此无法进行pcr扩增检测。实施例1、实施例2、实施例3、对比例1和对比例3中的新型冠状病毒核酸提取试剂盒可以顺利提取纯度合格的rna，其中实施例1-3中提取的rna纯度分别明显高于对比例1-3，说明使用新型生物纳米磁珠有利于获得高纯度rna。分别对比实施例1和实施例3以及对比例1和对比例3中提取的rna浓度，实施例1和对比例1中提取出的rna浓度分别高于实施例3和对比例3，说明无论是否使用新型生物纳米磁珠，添加甘氨酸盐酸盐都可以有效提高rna提取的量。实时荧光定量逆转录pcr扩增结果如图3所示。从图3中可以看出，实施例1-3中新型冠状病毒核酸提取试剂盒对样本的提取效果好，可以顺利检测出样本呈阳性。而对比例1和对比例2中的新型冠状病毒核酸检测试剂盒虽然提取出了样本中病毒的核酸，但无法顺利检测出阳性样本。因此使用本发明新型冠状病毒核酸提取试剂盒可以顺利提取病毒核酸并能被正常检测。对比实施例1与实施例2发现，二者扩增曲线类似，仅ct值有所不同，说明实施例1与实施例2的仅有核酸提取的量有细微差别，说明本发明中新型生物纳米磁珠可以作为裂解液中的rna酶抑制剂使用，代替异硫氰酸胍。试验例4新型冠状病毒核酸提取后存放时间对核酸样本完整性的影响一、新型冠状病毒核酸提取使用实施例1-3、对比例-3中的新型冠状病毒核酸提取试剂盒对样本中的新型冠状病毒核酸进行提取，提取方法如下取2ml样本，加入裂解液50μl，混匀，室温裂解5min；加入200μl洗涤液1，振荡30s，13000r/min离心5min；取200μl上清到一新的ep管中，加入200μl新型生物纳米磁珠悬液，振荡混匀，室温吸附5min，静置20s，去除上清液；加入500μl洗涤液2，混匀，静置20s，去除上清液，室温晾干15min；不进行洗脱。分别放置于常温、4℃、-80℃保存，每间隔1、3、5、7、14、28天拿出一批样本测定rna是否被降解。测定结果如表14所示。表14不同储存温度下rna被降解的情况+：rna未被降解；-：rna被降解由表14实施例1和3可以看出，在使用本发明新型生物纳米磁珠悬液和异硫氰酸胍的情况下，在rna提取后不进行洗脱的情况下，rna可以在4℃下保存14天，在常温下保存3天，在-80℃下保存28天。由对比例2可以看出即使是裂解液中使用新型生物纳米磁珠悬液代替异硫氰酸胍，所提取的rna也能在4℃和常温中保存一天。而对比例1和3中不使用新型生物纳米磁珠悬液的情况下，无论裂解液中是否使用异硫氰酸胍，提取rna后只能在-80℃进行保存才能不被降解。而对比例2中同时不使用新型生物纳米磁珠和异硫氰酸胍无法顺利提取rna。说明本发明中新型生物纳米磁珠可以在常温和4℃的储存环境下有效保护rna不被降解；同时还可以代替裂解液中的异硫氰酸胍。以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12