一种同时提取紫球藻中多种活性物质的方法

1.本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种提取紫球藻中活性物质的方法及其应用。


背景技术：

2.紫球藻(porphyridiumpurpureum)是一种单细胞微型红藻，广泛存在于海洋、淡水湖泊、潮湿土壤表面等自然环境中。紫球藻可以积累藻红蛋白、多不饱和脂肪酸和胞内多糖等活性物质，具有潜在的开发利用潜力。目前针对紫球藻中某一活性物质的提取技术已有大量报道，但如何将这些活性物质从同一批次紫球藻生物质中全部提取出来，例如提取藻红蛋白的残渣中还含有大量多不饱和脂肪酸和活性多糖，如何在不破坏活性物质结构和活性的情况下，从藻渣中提取多不饱和脂肪酸和胞内多糖，并未见相关报道。
3.紫球藻细胞中最特别且最具开发价值的一类物质是藻红蛋白，它是紫球藻主要的光合色素，存在于叶绿体的类囊体膜上，分子量约为240kda，约占干重的3
‑
10％，具有抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力等生物学活性，可以用做保健品、着色剂、化妆品等，纯度达到5.0(a
545
/a
280
)以上藻红蛋白可以作为荧光试剂。针对紫球藻中藻红蛋白提取的报道较多，常用的方法有反复冻融法、微波辅助提取、高压静水提取等，藻红蛋白的稳定性较差，提取过程需要温和条件，特别是温度大于45℃、ph大于10或小于4、有机溶剂存在的情况下极易变性，因此，对于紫球藻中活性物质的提取应该首先考虑藻红蛋白。
4.紫球藻总脂含量通常占干重10％左右，其中60％以上由多不饱和脂肪酸组成(花生四烯酸和二十碳五烯酸)，具有非常好的抗氧化、提高免疫力、消炎等生物学活性，是一种具有极高开发价值的油脂原料。常用的油脂提取方法为有机溶剂浸提法(氯仿、甲醇、乙醇、正己烷等)，乙醇用于膜脂含量较高的微藻材料油脂的提取具有较好的效果，紫球藻油脂主要以膜脂为主，考虑到大多数有机溶剂具有一定的毒性，乙醇作为紫球藻油脂的提取溶剂更加合适，但目前并未发现利用乙醇提取紫球藻油脂的相关报道。
5.胞内多糖是紫球藻生物质的主要组成部分，约占干重的40％左右，具有抗氧化、提高免疫力和抗病毒等生物学活性，通常利用酸、碱和水可以直接提取胞内多糖，不同提取方法所获得的胞内多糖在组成和活性上可能存在差异。但大多数胞内多糖提取共同点是均需要加热，常温条件下几乎不能提取，而加热过程会对藻红蛋白、不饱和脂肪酸产生不利影响，因此紫球藻胞内多糖的提取应在藻红蛋白、多不饱和脂肪酸之后。
6.目前已公开的紫球藻相关专利中，涉及活性物质提取的专利主要包括：
7.一种协同提取湿藻体藻红蛋白和油脂的方法(申请号：202010914299.71)，该发明公开了一种协同提取湿藻体藻红蛋白和油脂的方法，包括如下步骤：(1)微藻培养；(2)湿藻体收集；(3)三相分离协同提取藻红蛋白和油脂；(4)油脂的收集与提纯；(5)藻红蛋白的收集与提纯；(6)藻红蛋白干燥。该发明以湿藻体为原料，无需对藻细胞进行破壁，采用三相分离技术，可一步协同提取藻红蛋白和含花生四烯酸与二十碳五烯酸藻油。经分析该技术在提取过程中，同时加入水和醇类试剂，藻红蛋白对醇类试剂存在的情况下极易变性，因此该
技术虽然解决了多种活性物质同时提取的问题，缩减了提取时间、节省了成本，但可能会引起藻红蛋白的变性，降低产品的价值。
8.藻红蛋白提取液的提取方法及其应用(申请号：201910734323.6)，该发明公开一种藻红蛋白提取液的提取方法，提取步骤包括：红藻分4次搅切，每次搅切15秒,每次间隔30秒，料液质量/体积比为1:30，浸泡于去离子水中，2小时后，12000转/分，500w超声破碎60分钟，浸泡2天后，8000转/分钟、20℃下离心5分钟，取上层液，分离纯化获得藻红蛋白提取液。该专利并没有提及提取藻红蛋白后，藻渣的后续利用的问题。
9.一种藻红蛋白的提取方法(申请号：201910292467.0)，该发明公开了一种藻红蛋白的提取方法，该发明提供的方法能够将藻体中的醇溶性脂质、叶绿素和杂蛋白质等杂质有效去除，最终所得藻红蛋白粗提液中藻红蛋白的纯度a
560
/a
280
能够达到1.3以上，并且粗提液在575nm处有藻红蛋白特征荧光发射峰。该专利并没有提及提取藻红蛋白后，藻渣的后续利用的问题。
10.一种藻红蛋白的提取方法(申请号：201410409502.x)，该发明公开了一种藻红蛋白的提取方法。该方法包括将含有藻红蛋白的鲜藻或经过预浸泡的藻粉加入冰粉中，将搅拌速度控制在1000
‑
3000转/分的条件下进行破壁处理，得到含有藻红蛋白的破壁液，再将得到的含有藻红蛋白的破壁液进行分离、纯化和干燥，得到成品藻红蛋白。该专利并没有提及提取藻红蛋白后，藻渣的后续利用的问题。


技术实现要素：

11.本发明目的是提供一种提取效率高、能保持藻红蛋白、多不饱和脂肪酸和胞内多糖活性、安全、操作简单、无毒的同时提取紫球藻中多种活性物质的方法。
12.本发明人研究发现：紫球藻的藻红蛋白、多不饱和脂肪酸和胞内多糖三种活性物质中，稳定性最差的物质为藻红蛋白，因此应该首先应该设置温和条件提取藻红蛋白，多不饱和脂肪酸对热较为敏感，而胞内多糖的提取必须在加热的条件下，因此第二种被提取的物质最好为多不饱和脂肪酸，最后提取的物质为胞内多糖。抗氧化活性是天然产物活性的基础，通过评估抗氧化活性，可以快速了解产物的活性。提取过程对产物活性存在影响，利用抗氧化活性来评估藻红蛋白、多不饱和脂肪酸和胞内多糖的活性，从而验证分级提取过程的可行性，从而实现了本发明的目的。
13.本发明的同时提取紫球藻中多种活性物质的方法，其是先用冷水浸提紫球藻，分离冷水浸提液和藻渣i，藻渣i用乙醇或乙醇水溶液浸提，分离乙醇或乙醇水溶液浸提液和藻渣ii，藻渣ii用热水浸提，分离热水浸提液和藻渣iii，所述的冷水浸提液为藻红蛋白提取物，所述的乙醇或乙醇水溶液浸提液为多不饱和脂肪酸提取物，所述的热水浸提液为胞内多糖提取物。
14.最后的藻渣iii可以烘干。上述步骤的顺序不能改变，改变将破坏提取物的结构和活性。
15.优选，所述的紫球藻为干藻粉或者湿藻泥。
16.优选，所述的冷水为4℃冷水。进一步优选是用4℃冷水搅拌下提取6小时。
17.优选，所述的乙醇水溶液是体积分数95％的乙醇水溶液。进一步优选是用体积分数95％的乙醇水溶液搅拌下提取6小时。
18.优选，所述的热水是80℃热水。进一步优选是用80℃热水搅拌下提取2小时。
19.优选，所述的分离冷水浸提液和藻渣i、分离热水浸提液和藻渣iii是采用离心分离；所述的分离乙醇或乙醇水溶液浸提液和藻渣ii是采用膜过滤分离。
20.目前已公开的紫球藻相关专利和论文中，虽然存在针对某一活性物质单独提取的工艺(如藻红蛋白)，但并未发现同时提取紫球藻中的三大类活性物质的工艺(藻红蛋白、多不饱和脂肪酸和胞内多糖)。为了更好的将紫球藻生物质全部利用，本发明充分考虑了藻红蛋白、多不饱和脂肪酸、胞内多糖的理化特性和稳定性，提出一种紫球藻活性物质的分级提取工艺，常压条件下，利用冷水、95％乙醇、热水依次提取的紫球藻中藻红蛋白、多不饱和脂肪酸、胞内多糖三种活性物质，该工艺对三种活性物质的理化特性和生物学活性无破坏作用，因此提取物可以作为保健品、化妆品、荧光试剂、色素的开发原料。
21.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
22.(1)本发明可以实现紫球藻中三种高价值成分藻红蛋白、多不饱和脂肪酸和胞内多糖的同步提取，获得的藻红蛋白、多不饱和脂肪酸、胞内多糖保持较好的理化特性，并具有较高的抗氧化活性。
23.(2)本发明采用冷水、95％乙醇、热水依次进行紫球藻活性物质的提取，三种提取方式提取效率高、安全、操作简单、无毒，有利于大规模推广和后续产品的开发。
附图说明
24.图1是紫球藻活性物质的提取工艺流程。
25.图2是三步提取生物质的减少情况分析。
26.图3是藻红蛋白提取物吸收光谱。
27.图4是藻红蛋白提取物二维荧光光谱。
28.图5是多不饱和脂肪酸提取物的液质联用分析。
具体实施方式
29.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
30.实施例1从紫球藻粉(1.000g)中提取藻红蛋白、多不饱和脂肪酸和胞内多糖
31.提取过程(如图1所示)：4℃条件下，称取1.000g干紫球藻粉(初始藻粉)，加入50ml4℃去离子水，搅拌6小时，6000转/分钟离心5分钟，分离藻红蛋白提取物(冷水浸提液)和藻渣i。藻渣i中加入50ml体积分数95％乙醇水溶液，搅拌6小时，利用孔径1微米膜过滤分离多不饱和脂肪酸提取物(乙醇浸提液)和藻渣ii，藻渣ii中再次加入50ml 80℃去离子水，80℃条件下，搅拌2小时，6000转/分钟离心5分钟，离心分离胞内多糖提取物(热水浸提液)和藻渣iii，藻渣iii于80℃条件下烘干。
32.产率分析：4℃冷水提取后，得藻渣i为0.547g，生物质损失量为0.453g；95％乙醇提取后，得藻渣ii为0.487g，生物质损失量为0.060g；80℃热水提取后，得藻渣iii为0.215g，生物质减少量为0.272g，经过冷水、95％乙醇和热水三步提取后，紫球藻生物质总的减少量为78.5％dw。三步提取生物质的减少情况分析见图2。
33.藻红蛋白提取物经干燥后得干物质0.031g，多不饱和脂肪酸提取物经去除乙醇并干燥后得干物质0.052g，胞内多糖提取物经醇沉干燥后得干物质0.134g，通过计算得到藻
红蛋白得率63.3％，多不饱和脂肪酸得率74.3％，胞内多糖得率75.2％，具体请见表1：
34.表1
[0035][0036]
*胞内多糖的理论重量＝胞内多糖含量
×
藻粉重量；多不饱和脂肪酸的理论重量＝多不饱和脂肪酸含量
×
藻粉重量；藻红蛋白的理论重量＝藻红蛋白含量
×
藻粉重量。
[0037]
实施例2从紫球藻粉(10.00g)中提取藻红蛋白、多不饱和脂肪酸和胞内多糖
[0038]
提取过程(如图1所示)：4℃条件下，称取10.00g干紫球藻粉(初始藻粉)，加入500ml4℃去离子水，搅拌6小时，6000转/分钟离心5分钟，分离藻红蛋白提取物(冷水浸提液)和藻渣i。藻渣i中加入500ml体积分数95％乙醇水溶液，搅拌6小时，利用孔径1微米膜过滤分离多不饱和脂肪酸提取物(乙醇浸提液)和藻渣ii，藻渣ii中再次加入500ml 80℃去离子水，80℃条件下，搅拌2小时，6000转/分钟离心5分钟，离心分离胞内多糖提取物(热水浸提液)和藻渣iii，藻渣iii于80℃条件下烘干。
[0039]
产率分析：4℃冷水提取后，得藻渣i为5.68g，生物质损失量为4.32g；95％乙醇提取后，得藻渣ii为5.00g，生物质损失量为0.68g；80℃热水提取后，得藻渣iii为2.43g，生物质减少量为2.57g，经过冷水、95％乙醇和热水三步提取后，紫球藻生物质总的减少率为75.7％dw。
[0040]
藻红蛋白提取物经干燥后得干物质0.34g，多不饱和脂肪酸提取物经去除乙醇并干燥后得干物质0.56g，胞内多糖提取物经醇沉干燥后得干物质1.36g，通过计算得到藻红蛋白得率69.0％，多不饱和脂肪酸得率80.0％，胞内多糖得率76.4％，具体请见表2：
[0041]
表2
[0042][0043]
*胞内多糖的理论重量＝胞内多糖含量
×
藻粉重量；多不饱和脂肪酸的理论重量＝多不饱和脂肪酸含量
×
藻粉重量；藻红蛋白的理论重量＝藻红蛋白含量
×
藻粉重量。
[0044]
实施例3从紫球藻湿藻泥(100.0g)中提取藻红蛋白、多不饱和脂肪酸和胞内多糖
[0045]
提取过程(如图1所示)：4℃条件下，称取100.0g紫球藻湿藻泥(初始藻泥，含水量90.1％)，加入400ml4℃去离子水，搅拌6小时，6000转/分钟离心5分钟，分离藻红蛋白提取
物(冷水浸提液)和藻渣i。藻渣i中加入400ml体积分数95％乙醇水溶液，搅拌6小时，利用孔径1微米膜过滤分离多不饱和脂肪酸提取物(乙醇浸提液)和藻渣ii，藻渣ii中再次加入400ml 80℃去离子水，80℃条件下，搅拌2小时，6000转/分钟离心5分钟，离心分离胞内多糖提取物(热水浸提液)和藻渣iii，藻渣iii于80℃条件下烘干。
[0046]
产率分析：4℃冷水提取后，得干藻渣i为5.52g，生物质损失量为4.48g；95％乙醇提取后，得藻渣ii为4.89g，生物质损失量为0.63g；80℃热水提取后，得藻渣iii为2.45g，生物质减少量为2.44g，经过冷水、95％乙醇和热水三步提取后，紫球藻生物质总的减少率为75.5％dw。
[0047]
藻红蛋白提取物经干燥后得干物质0.39g，多不饱和脂肪酸提取物经去除乙醇并干燥后得干物质0.48g，胞内多糖提取物经醇沉干燥后得干物质1.35g，通过计算得到藻红蛋白得率79.6％，多不饱和脂肪酸得率68.6％，胞内多糖得率75.8％，具体请见表3：
[0048]
表3
[0049][0050]
*胞内多糖的理论重量＝胞内多糖含量
×
藻泥重量
×
(1
‑
含水率)；多不饱和脂肪酸的理论重量＝多不饱和脂肪酸含量
×
藻泥重量
×
(1
‑
含水率)；藻红蛋白的理论重量＝藻红蛋白含量
×
藻泥重量
×
(1
‑
含水率)。
[0051]
实施例4藻红蛋白、多不饱和脂肪酸和胞内多糖提取物的特性分析
[0052]
以实施例1提取得到的藻红蛋白提取物、多不饱和脂肪酸提取物、胞内多糖提取物进行特性分析。
[0053]
1.藻红蛋白：藻红蛋白提取物为橙红色液体，对其进行紫外可见吸收光谱扫描，如图3所示，存在两个明显的主峰(545nm和565nm)和1个肩峰(495nm)，这3个吸收峰来源于藻红蛋白，620nm处存在较小的吸收，该峰为藻蓝蛋白的吸收峰。对提取物进行二维荧光光谱扫描，发射波长为200
‑
800nm，激发波长为300
‑
700nm，由图4可见，藻红蛋白提取物具有较强的荧光强度，最大荧光发射波长为576nm，最大荧光激发波长为545nm。
[0054]
2.多不饱和脂肪酸：多不饱和脂肪酸提取物为绿色液体，去除乙醇后变为黑褐色膏状物，利用液相色谱
‑
质谱联用仪对提取物的脂类分子进行测定，如图5所示，其中，dgdg为双半乳糖甘油二酯的简称，sqdg为硫代异鼠李糖甘油二酯的简称，发现含量较高的脂类分子为双半乳糖甘油二酯(c16:0/c20:5)、半乳糖甘油二酯(c16:0/c20:4)、硫代异鼠李糖甘油二酯(c16:0/c20:4)、硫代异鼠李糖甘油二酯(c16:0/c20:5)。
[0055]
3.胞内多糖提取物：胞内多糖提取物为半透明状液体，具有一定的粘性，胞内多糖由半乳糖、木糖和葡萄糖，比例分别为39.58％、38.83％和21.59％，该胞内多糖中糖类组分
含量为55.57％dw，蛋白质含量为8.01％dw，糖醛酸含量为4.13％dw，硫酸根为8.31％。
[0056]
实施例5藻红蛋白、多不饱和脂肪酸和胞内多糖干物质的抗氧化活性分析
[0057]
利用abts、dpph和超氧阴离子等三种抗氧化活性评价体系对藻红蛋白冻干粉、多不饱和脂肪酸黑褐色膏状物和胞内多糖冻干粉进行了抗氧活性评价，ic
50
的值越低，说明活性物质的抗氧化活性越高。
[0058]
abts清除活性测定：取等体积的7.4mmabts二铵盐储备液和2.6mm过硫酸钾储备液混合，避光静置16小时，用ph7.4的磷酸盐缓冲液稀释混合液，使其在734nm处的吸光度为0.70
±
0.02，即得abts自由基工作液。将样品溶于蒸馏水或乙醇，配制成1.0
‑
5.0mg ml
‑1的溶液。以维生素c作为阳性对照，配制成相同浓度的水溶液。取样品0.2ml加入到0.8ml的abts自由基工作液中，摇匀后于黑暗中37℃水浴15分钟，在734nm处测定吸光度。根据下式计算清除活性：
[0059]
abts清除活性(％)＝(a0–
a1)/a0×
100％
[0060]
其中，a0是对照组(蒸馏水代替样品溶液)的吸光度，a1是实验组(样品溶液)的吸光度。
[0061]
dpph清除活性测定：将样品溶于蒸馏水或乙醇，配制成1.0
‑
5.0mg ml
‑1的溶液。以抗坏血酸作为阳性对照，配制成相同浓度的水溶液。之后分别取不同浓度的样品和抗坏血酸水溶液0.2ml加入到等体积的0.1μm dpph
‑
乙醇溶液中，室温下避光反应30分钟，在517nm下测定吸光度。根据下式计算清除活性：
[0062]
dpph清除活性(％)＝(1
–
(a1–
a2)/a0)
[0063]
其中，a0是对照组(以蒸馏水代替样品溶液)的吸光度，a1是实验组(样品溶液)的吸光度，a2是空白组(乙醇代替dpph)的吸光度。
[0064]
超氧阴离子清除活性测定：使用南京建成生物工程研究所生产的抗超氧阴离子自由基及产生超氧阴离子自由基测试盒，将样品溶于蒸馏水或乙醇，配制成1.0
‑
5.0mg ml
‑1的溶液。该试剂盒的反应机理是模拟体内黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶的反应系统以产生超氧化物阴离子自由基。加入电子传递物和显示剂后，反应体系出现紫红色。当样品中含有超氧阴离子抑制剂时，样品的吸光度低于对照管的吸光度。根据下式计算清除活性：
[0065]
超氧阴离子清除活性(％)＝(1
–
(a1/a0))
×
100％
[0066]
其中，a0是对照组(蒸馏水代替样品溶液)的吸光度，a1是实验组(样品溶液)的吸光度。测定结果如表4所示。
[0067]
表4
[0068][0069]
从表4可知，藻红蛋白、多不饱和脂肪酸、胞内多糖均具有抗氧化活性，其中藻红蛋白的抗氧化活性最高。
[0070]
实施例6提取顺序对提取物特性的影响
[0071]
本实施例进一步研究提取顺序，以下设计三组不同的提取顺序进行实验：
[0072]
(1)提取顺序为“多不饱和脂肪酸
→
藻红蛋白
→
胞内多糖”。1.000g紫球藻粉中加入50ml 95％酒精，常温搅拌提取6小时，利用孔径为1微米的膜进行过滤分离，获得多不饱和脂肪酸提取液和藻渣，随后，在藻渣中加入50ml4℃去离子水，在4℃条件下，搅拌6小时，6000转/分钟离心5分钟，上清液即为藻红蛋白提取物，经观察此方法获得的藻红蛋白提取物不再是橙红色，而变为粉紫色，最大吸收波长也由545nm和565nm两个吸收峰，变为仅有一个吸收峰550nm，说明藻红蛋白在此过程中发生变性，该提取过程不可能同时获得多不饱和脂肪酸、藻红蛋白和胞内多糖。
[0073]
(2)提取顺序为“胞内多糖
→
藻红蛋白
→
多不饱和脂肪酸”，1.000g紫球藻粉中加入50ml 80℃去离子水，80℃条件下，搅拌2小时，6000转/分钟离心5分钟，上清液即为胞内多糖提取物，藻渣置于50ml4℃去离子水，在4℃条件下，搅拌6小时，6000转/分钟离心5分钟，上清液即为藻红蛋白提取物，此时提取物的橙红色明显变浅，最大吸收波长也由545nm变为554nm，荧光消失，说明藻红蛋白在加热过程中变性，藻渣中加入50ml 95％酒精，搅拌提取6小时，孔径为1微米膜过滤分离获得多不饱和脂肪酸提取液，经测定多不饱和脂肪酸由5.2％dw降低为2.1％dw，得率降低50％，该提取过程不可能同时获得多不饱和脂肪酸、藻红蛋白和胞内多糖。
[0074]
(3)提取顺序为“藻红蛋白
→
胞内多糖
→
多不饱和脂肪酸”，4℃条件下，1.000g紫球藻粉中加入50ml4℃去离子水，搅拌6小时，6000转/分钟离心5分钟，上清液即为藻红蛋白提取物，对提取物进行吸收光谱扫描，最大吸收峰为545nm和565nm，提取物具有较强的荧光强度，最大荧光发射波长为576nm，最大荧光激发波长为545nm。藻渣中加入50m l80℃去离子水，80℃条件下，搅拌2小时，6000转/分钟离心5min，上清液即为胞内多糖提取物，测定其单糖组成、糖醛酸含量、蛋白质含量、硫酸根含量均与实施例4相同。藻渣中加入50ml 95％酒精，常温搅拌提取6小时，孔径为1微米的膜进行过滤分离，获得多不饱和脂肪酸提取液，经测定多不饱和脂肪酸由5.2％dw降低为1.8％dw，得率大幅降低65％，该提取过程虽然可以获得藻红蛋白和胞内多糖，但大幅降低了多不饱和脂肪酸的得率，无法达到实施例1
‑
3的效果。
[0075]
由此可见，提取顺序为“藻红蛋白
→
多不饱和脂肪酸
→
胞内多糖”取得的效果最优。
[0076]
对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。