器官芯片的冷冻保存方法与流程

本发明涉及具有三维组织结构以及功能的器官芯片(organ-on-a-chip)的冷冻保存以及解冻方法。具体为，涉及将具有包括细胞以及水凝胶的微通道结构的器官芯片进行冷冻保存以及解冻的方法，在冷冻保存以及解冻前后，能够维持三维组织的结构以及功能，从而购买冷冻的器官芯片的实际使用者(end user)在解冻之后能够容易使用。

背景技术：

1、器官芯片(organ-on-a-chip)是通过在小的芯片培养构成特定器官的细胞组织，从而模拟该器官的形态以及生理特性来实现所希望的功能的技术。可以利用器官芯片详细研究特定器官的细胞组织的活动以及在微环境下的物理化学反应的机制，而且可以用作用于评价新药开发的药物毒性以及功效的模型。

2、单纯的细胞或者二维结构的器官芯片的冷冻保存以及解冻可以利用目前公知的方法。一般，以往的细胞冷冻是将细胞进行酶处理，从而将细胞分散至冷冻保存液内，制成浮游状态之后来进行，作为浮游细胞组织体的类器官或者球状体等的冷冻也是通过相同的方法进行。当以浮游状态分散至冷冻保存液内时，含有相比细胞的量充分多的量的冷冻保存液而能够在热传递方面完成均匀的传递，从而技术上的考虑事项相对少，因此可以使用以往的细胞冷冻方法(han,sung-hoon,et al.world journal of gastroenterology 23.6(2017):964；he,andy,et al.biopreservation and biobanking 18.3(2020):222-227；以及clinton,james,and penney mcwilliams-koeppen.current protocols in cellbiology 82.1(2019):e66)。

3、然而，与所述浮游细胞组织体不同的是，实现三维器官组织的结构和功能的器官芯片(以下，“三维器官芯片”)是通过基于微流体设计的细胞组织体来模拟器官内存在的细胞组织的结构和功能，因此技术上的考虑事项多，而难以应用以往的一般的冷冻保存方法。

4、即，在热传递以及冷冻保护剂的扩散传递方面，所述浮游细胞组织体的热以及保护剂传递出现放射状的一维现象，与此相反地，在三维器官芯片中，随着复杂的通道形状而出现三维。另外，当为完成与体内类似形态的三维细胞培养的三维器官芯片时，利用细胞外基质(ecm)，因此，由于所述ecm经历冷冻以及解冻时产生的膨胀和收缩而形成在组织内部的细胞的网络连接被断开，导致不能原样维持细胞组织体的功能以及结构。因此，与以往的细胞以及浮游细胞组织体的冷冻不同，在三维器官芯片的冷冻保存方法中，需要考虑各种技术上的问题。

5、在所述浮游细胞组织体中，利用组织体的大小、构成细胞的存活率、构成细胞的蛋白质表达等来评价组织的功能保存，与此相反地，在形成在三维器官芯片的组织中，利用细胞-细胞间接触以及结合力、组织的物质渗透率、特定细胞的极化(polarization)等进一步评价组织的功能。这种仅是三维器官芯片的组织功能在人体内药物渗透率、药物功效以及毒性评价以及预测中属于非常重要的指标，在三维器官芯片的冷冻以及解冻过程中，维持所述组织的结构以及功能是极其重要的。然而，目前为止尚未出现能够维持所述结构以及功能的器官芯片的冷冻保存以及解冻方法。

6、因此，本发明人开发出在三维器官组织的冷冻保存以及解冻之后也能维持冷冻前所具有的器官组织的结构以及功能的方法，由此完成了本发明。

7、【现有技术文献】

8、【专利文献】

9、(专利文献0001)韩国公开专利公报第10-2017-0139048号

10、【非专利文献】

11、(非专利文献0001)han,sung-hoon,et al."long-termculture-inducedphenotypic difference and efficient cryopreservation of small intestinalorganoids by treatment timing of rho kinase inhibitor."world journal ofgastroenterology 23.6(2017):964

12、(非专利文献0002)he,andy,et al."cryopreservation of viable humantissues:renewable resource for viable tissue,cell lines,and organoiddevelopment."biopreservation and biobanking 18.3(2020):222-227

13、(非专利文献0003)clinton,james,and penney mcwilliams-koeppen."initiation,expansion,and cryopreservation of human primary tissue-derivednormal and diseased organoids in embedded three-dimensional culture."currentprotocols in cell biology 82.1(2019):e66

技术实现思路

1、技术课题

2、本发明的目的在于，在经过将实现特定器官或者组织的结构和功能的器官芯片进行冷冻保存的过程之后，对其进行冷冻以及解冻之后也依旧保全冷冻之前所具有的特定器官或者组织的结构的功能，从而使实际使用者(end user)在实验室、研究所、制药公司等进行解冻之后，能够容易使用器官芯片(organ-on-a-chip)。

3、另外，本发明的目的在于，即便在冷冻以及解冻之后也能保全在三维器官芯片的组织功能中作为评价细胞-细胞间结合力、组织的物质渗透率等的代表性的指标的teer(跨上皮电阻；transepithelial electrical resistance)值。

4、技术方案

5、本发明提供一种器官芯片的冷冻保存方法，其包括：制造器官芯片的步骤，所述器官芯片包括器官芯片组织部以及器官芯片屏障部，所述器官芯片组织部包括包括细胞以及水凝胶的微通道结构的第二通道，所述器官芯片屏障部包括包括细胞的微通道结构的第一通道；向所述器官芯片屏障部中包括的微通道灌流含有冷冻保护剂(cryoprotectant)的保存液的步骤；冷藏保存所述器官芯片的步骤；以及冷却所述器官芯片进行冷冻的步骤。

6、灌流所述保存液的步骤包括：为了向微通道内均匀分布保存液，利用静水压差向所述第一通道流通保存液一定时间的步骤；以及利用移液管向侧面通道替换保存液的步骤。

7、冷藏保存所述器官芯片的步骤包括：为了使向微通道内注入的保存液均匀扩散至作为三维水凝胶通道的第二通道，以冷藏状态保存一定时间的步骤。

8、本发明还提供一种器官芯片的解冻方法，其包括解冻按照所述方法冷冻的器官芯片的步骤。

9、发明效果

10、本发明的冷冻保存以及解冻方法使冷冻保存的三维组织或者器官在解冻之后也维持冷冻前的结构和功能，从而能够在实验室、研究所、制药公司等容易使用器官芯片。

11、尤其是，通过本发明的冷冻保存以及解冻方法，维持二维-三维组织结合而成的组织屏障或者三维组织屏障的结构以及功能，而且将细胞以及组织屏障细胞的细胞存活率以及细胞功能维持90％以上，维持组织的功能以及结构中所需的受体蛋白质等的蛋白质维持表达。

12、另外，本发明的冷冻保存以及解冻方法维持冷冻保存前的组织屏障的结构以及功能，保护teer值以及渗透性等，从而能够有效使用在评价新药的功效以及毒性等中。