一种乳状液模板及其衍生的聚合物多孔微球

1.本发明属于多孔微球技术领域，特别涉及一种乳状液模板及其衍生的聚合物多孔微球。


背景技术：

2.多孔微球是指内部和/或表面具有连通或不连通的孔隙的微米级球形颗粒，一般具有很高的比表面积，常用作载体。聚合物多孔微球具有广泛的应用，例如在医药领域用于载药和控释、在化工领域用于载催化剂或固定化酶以及在生物医学领域用于细胞和组织培养。然而，现有的多孔微球制备方法有一些不足之处，限制了其应用：传统的乳化-溶剂挥发法所制备的多孔微球粒径分布很宽、形貌很不均一，往往需要筛选，增加了生产成本；纳米沉淀法所制备的多孔微球同样有粒径和形貌不均一的问题；微流控法是较新的微球制备方法，通过让连续相和不连续相在微流控装置或微流控芯片中交汇形成均匀的液滴并进一步形成微球，该方法极大提高了实心微球的均一性，进而便于功能化实心微球的设计和大量制备。然而对于多孔微球，微流控法不能解决均一性差的问题，这是因为作为不连续相的传统乳液快速分层，导致微流控装置中所形成液滴的大小和组成也随之改变，最终产生粒径和形貌各异的多孔微球难以精确设计微球形貌和大量制备。上述方法中，微流控法是较复杂但最稳定的微球制备方法，但目前的方法制备的多孔微球的大小和形貌不均一。


技术实现要素：

3.本技术的目的在于提供一种乳状液模板及其衍生的聚合物多孔微球，以解决目前多孔微球的大小形貌不均一的问题。
4.本发明实施例提供了一种乳状液模板，所述模板包括油相体系和水相体系，所述水相体系和所述油相体系的密度关系符合设定关系，以使所述水相体系能在所述油相体系中稳定悬浮。
5.可选的，所述油相体系和水相体系的密度差的绝对值≤15g/l。
6.可选的，所述油相体系和水相体系的密度差的绝对值≤10g/l。
7.可选的，所述油相体系至少包括两种有机溶剂，两种所述有机溶剂中至少有一种有机溶剂的密度大于所述水相体系，两种所述有机溶剂中至少有一种有机溶剂的密度小于所述水相体系。
8.可选的，所述油相体系包括两种有机溶剂。
9.可选的，两种所述有机溶剂分别为乙酸乙酯和二氯甲烷。
10.可选的，所述水相体系还包括可溶性盐，用以调节所述水相体系的密度。
11.可选的，所述油相体系的溶质为可生物降解的高分子材料。
12.可选的，所述可生物降解的高分子材料包括聚己内酯、聚己内酯-聚乙二醇嵌段共聚物和聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的至少一种。
13.基于同一发明构思，本发明实施例还提供了一种聚合物多孔微球，所述微球采用
如上所述的乳状液模板制备。
14.本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
15.本发明实施例提供的乳状液模板，通过使水相体系和油相体系的密度非常接近，从而尽可能减小外力，使乳化后水油界面的表面张力能够维持乳状液的油包水结构，理论上在合适的环境下不会发生相分离，在实际使用中可长时间保持稳定，使产物均一性极好，可以仅获得特定的多孔微球，解决目前多孔微球的大小不均一的问题。
16.上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举本发明的具体实施方式。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
18.图1是本发明实施例提供的乳状液模板；
19.图2是本发明实施例1提供的多孔微球的光镜图；
20.图3是本发明实施例2提供的多孔微球的光镜图；
21.图4是本发明实施例3提供的多孔微球的光镜图；
22.图5是本发明实施例4提供的多孔微球的光镜图；
23.图6是本发明实施例5提供的多孔微球的光镜图；
24.图7是本发明实施例6提供的多孔微球的光镜图；
25.图8是本发明对比例1提供的多孔微球的光镜图；
26.图9是本发明实施例1-6和对比例1提供的多孔微球的粒径统计图；
27.图10是本发明实施例1提供的多孔微球的扫描电镜图；
28.图11是本发明实施例2提供的多孔微球的扫描电镜图；
29.图12是本发明实施例3提供的多孔微球的扫描电镜图；
30.图13是本发明实施例4提供的多孔微球的扫描电镜图；
31.图14是本发明实施例5提供的多孔微球的扫描电镜图；
32.图15是本发明实施例6提供的多孔微球的扫描电镜图；
33.图16是本发明对比例1提供的多孔微球的扫描电镜图；
34.图17是本发明实施例1提供的多孔微球的细胞毒性检测的结果图；
35.图18是在本发明实施例1提供的多孔微球上培养bmscs的结果图；
36.图19是在多巴胺修饰的本发明实施例1提供的多孔微球上培养bmscs的结果图；
37.图20是背景技术提供的油包水乳状液的分层示意图。
具体实施方式
38.下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明
本发明，而非限制本发明。
39.在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
40.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
41.缩略语和关键术语定义：
42.聚己内酯(polycaprolactone)：pcl
43.聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)：plga
44.聚己内酯-聚乙二醇嵌段聚合物：pecl
45.双重乳状液模板：双乳模板
46.等密度乳状液：等密乳液
47.聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)：pva
48.本技术实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
49.申请人在发明过程中发现：制备多孔微球常使用普通双乳作为模板，其中最简单和普遍的方法是将乳状液直接加入流动相中分散并挥发溶剂来制备多孔微球。具体步骤是：配制内水相和单一的油相，以一定比例混合并乳化，得到普通的油包水乳状液；将普通的油包水乳状液以一定比例加入外水相中并乳化，得到普通的水包油包水乳状液，即普通双乳模板；将普通双乳模板加入大量外水相中持续搅拌，让油相中的有机溶剂挥发，从而得到固化的微球；最后去除内水相，洗涤并冻干，得到多孔微球。
50.除了通过直接分散来获得乳化双乳模板，还可以将油包水乳状液引入微流控装置来获得双乳模板并制备多孔微球。该方法可以将不连续相分散成较均一的液滴，过程可控且较温和，一般所得多孔微球质量更好，但操作难度也较大。具体步骤是：配制内水相和单一的油相，以一定比例混合并乳化，得到普通的油包水乳状液；将油包水乳状液引入微流控装置，通过微流控的方法将油包水乳状液在外水相中分散成均一的液滴，从而获得较均一的水包油包水乳状液，即普通双乳模板；持续搅拌外水相，让油相中的有机溶剂挥发，从而得到固化的微球；最后去除内水相，洗涤并冻干，得到多孔微球。
51.因为普通乳状液很不稳定，在短短几分钟内就会因为相分离而分层，导致所得双乳模板很不均一，最终使微球形态不一且质量很差。对于直接乳化法制备普通双乳，尽管其所需时间短，可以最快地获得双乳模板并挥发有机溶剂来固化，但直接乳化法得到的微球大小不一，且其过程较粗暴，可能不利于双乳模板结构的保持。至于微流控法制备普通双乳，尽管其理论上可以产生大小一致的双乳模板液滴，但因为该方法耗时很长，而油包水乳状液会快速分层(如图18所示)，导致所得的双乳模板液滴成分差异巨大，有的因内水相过多而破裂成许多小液滴，有的则因内水相过少而无法形成多孔结构，最终同样会导致多孔微球大小不一且形貌各异。
52.若能克服传统乳状液不稳定的问题，不仅可用于规模化生产均一的多孔微球，还可通过调控各种制备参数来精确设计多孔微球的粒径和形貌。
53.本技术针对微流控-双乳模板法中乳状液模板稳定性差而导致产物不均一的问题，提出了等密度乳状液模板，着重改善了制备过程中乳状液模板产生的稳定性，使产物均
一性极好，可以仅获得特定的多孔微球；该方法同样适用于直接乳化-双乳模板法、膜乳化-双乳模板法和其他以乳状液模板为基础的方法，可以用于规模化生产；此外，该方法还可以通过两性聚合物来改善聚合物的成孔，使其对于难成孔的聚合物也可以适用，具有较好的泛用性。
54.根据本发明一种典型的实施方式，提供了一种乳状液模板，所述模板包括油相体系和水相体系，所述水相体系和所述油相体系的密度关系符合设定关系，以使所述水相体系能在所述油相体系中稳定悬浮。
55.通过使水相体系和油相体系的密度非常接近，从而尽可能减小外力，使乳化后水油界面的表面张力能够维持乳状液的油包水结构，理论上在合适的环境下不会发生相分离，在实际使用中可长时间保持稳定，使产物均一性极好，可以仅获得特定的多孔微球，解决目前多孔微球的大小不均一的问题。
56.在一些实施例中，油相体系和水相体系的密度差的绝对值≤15g/l，更优的，油相体系和水相体系的密度差的绝对值≤10g/l。
57.在一些实施例中，油相体系至少包括两种有机溶剂，两种所述有机溶剂中至少有一种有机溶剂的密度大于所述水相体系，两种所述有机溶剂中至少有一种有机溶剂的密度小于所述水相体系。
58.通过采用多种有机溶剂组成的多油相体系代替单一油相，通过改变不同有机溶剂的比例来调节油相的密度，使其和作为制孔剂的水相的密度非常接近，从而尽可能减小外力，使乳化后水油界面的表面张力能够维持乳状液的油包水结构，理论上在合适的环境下不会发生相分离，在实际使用中可长时间保持稳定
59.本实施例中，油相体系包括两种有机溶剂。具体而言，两种所述有机溶剂分别可以为乙酸乙酯和二氯甲烷。
60.在一些实施例中，水相体系还包括可溶性盐，用以调节所述水相体系的密度。
61.理论上也可以用可溶性盐调节水相的密度，来获得等密乳状液模板。
62.在一些实施例中，油相体系的溶质为可生物降解的高分子材料。具体的，可生物降解的高分子材料可以选自聚己内酯、聚己内酯-聚乙二醇嵌段共聚物和聚乳酸-羟基乙酸共聚物中的至少一种。
63.聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)是制备聚合物多孔微球最常用的材料之一，主要原因是plga微球较容易形成孔隙。plga由乳酸和羟基乙酸随机聚合而成，是一种具有良好生物相容性的可生物降解的聚合物，并且可以通过改变乳酸和羟基乙酸的比例来调节降解速率，常用于制备可控释的载药微球。然而，目前应用的plga微球大多为实心微球，多孔微球还未得到广泛应用，这是因为现有多孔微球制备方法难以满足生产的需要。
64.用聚己内酯(pcl)制备多孔微球是目前的一个研究重点，因为聚己内酯不仅具有良好生物相容性和可生物降解性，降解产物也更加安全，但聚己内酯因其材料特性较难形成多孔微球。
65.根据本发明另一种典型的实施方式，提供了一种聚合物多孔微球，所述微球采用如上所述的乳状液模板制备。
66.对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，可以使用不同的乳化设备(搅拌器、微流控装置、膜乳化器等)和对配方或制备参数做出若干改
进和变型，但只要在聚合物多孔微球制备的过程中使用了等密乳液模板，均应视为本发明的保护范围。
67.等密乳液模板的制备不限具体的乳化设备，为了展示最佳效果，此处选用微流控装置来制备等密乳液模板。下面结合具体实施案例和附图，对本发明作进一步的详细描述。以下实施案例用于描述本发明，但不限制本发明的范围。
68.实施例1
69.本实施例要制备直径约300μm的具有大量连通孔隙的聚己内酯多孔微球，具体方法如下：
70.(1)组装微流控装置
71.按目前的方法组装微流控装置，选择27g直角针头和0.5mm
×
2mm的玻璃毛细管。
72.两个50ml注射器分别安装在两个推进泵上；一个注射器连接硅胶管，末端连接玻璃毛细管，用作连续相通道；另一个注射器连接直角针头，针头穿入硅胶管并刚好插入玻璃毛细管口，用作不连续相通道。
73.(2)制备1％聚乙烯醇水溶液
74.在搅拌的同时向装有1l蒸馏水的烧杯中缓慢加入10g聚乙烯醇，然后于60℃水浴搅拌0.5h并于85℃水浴搅拌2h以彻底溶解聚乙烯醇，再用蒸馏水补足1l体积，最后用50μm筛网过滤杂质并冷却至室温；取下连接硅胶管的注射器，装满1％聚乙烯醇溶液并装回，剩余聚乙烯醇溶液倒入1l烧杯并置于玻璃毛细管下，调整位置使液面没过毛细管出口。
75.(3)制备等密度乳化体系
76.称取0.135g聚己内酯和0.027g聚己内酯-聚乙二醇嵌段共聚物，溶解于5.238g由乙酸乙酯和二氯甲烷组成的混合油相，其中乙酸乙酯和二氯甲烷的质量比为8/5，得到5.4g含有2.5wt％聚己内酯和0.5wt％聚己内酯-聚乙二醇嵌段共聚物的混合油相。
77.向混合油相中滴加10wt％明胶水溶液3g，水相与油相的质量比为1/1.8；小心滴加乙酸乙酯或二氯甲烷调节油相密度，直到水相在混合油相中稳定悬浮；用磁力搅拌器2200rpm初步乳化3min，然后用高速均质机均质24s，得到等密度乳化体系，装入注射器。
78.(4)制备聚己内酯多孔微球
79.收集相加入10ml乙酸乙酯并于冰浴中以200rpm搅拌，调节推进泵使连续相和不连续相的流速适中，在玻璃毛细管中形成均匀的间距适中的液滴；在本例中连续相和不连续相流速分别为25ml/h和2ml/h。
80.液滴在收集相中搅拌过夜，使有机溶剂挥发而形成微球；收集微球于45℃水浴中搅拌2h以溶解明胶，经洗涤和冻干后得到多孔微球。
81.实施例2
82.本实施例要制备直径约150μm的具有连通孔隙的聚己内酯多孔微球，本实施例与实施例1中的步骤相同，区别在于：组装微流控装置时选择32g针头和0.25mm
×
2mm的玻璃毛细管；连续相和收集相使用2％聚乙烯醇溶液；制备等密度乳化体系时，水相与油相的质量比为1/2.4；制备微球时，连续相和不连续相流速分别为1ml/h和6ml/h。
83.实施例3
84.本实施例要制备直径约180μm的具有闭孔的聚己内酯多孔微球，本实施例与实施案例1中的步骤相同，区别在于：组装微流控装置时选择30g针头和0.3mm内径的玻璃毛细
管；收集相使用蒸馏水代替聚乙烯醇溶液；制备等密度乳化体系时，油相中聚己内酯和聚己内酯-聚乙二醇嵌段共聚物的浓度分别为5wt％和1wt％，水相与油相的质量比为1/4；制备微球时，连续相和不连续相流速分别为1ml/h和6ml/h。
85.实施例4
86.本实施例要制备直径约280μm的具有小孔隙的聚己内酯多孔微球，本实施例与实施案例1中的步骤相同，区别在于：组装微流控装置时选择28g针头和0.4mm内径的玻璃毛细管；制备等密度乳化体系时，油相中聚己内酯和聚己内酯-聚乙二醇嵌段共聚物的浓度分别为5wt％和1wt％，水相与油相的质量比为1/4，且用均质机高速均质2min；制备微球时，连续相和不连续相流速分别为1.5ml/h和10ml/h。
87.实施例5
88.本实施例要制备直径约100μm的具有表面小孔隙的聚己内酯多孔微球，本实施例与实施案例1中的步骤相同，区别在于：组装微流控装置时选择32g针头和0.25mm
×
2mm的玻璃毛细管；不连续相不使用等密度乳化体系时，油相成分为含4wt％聚己内酯的二氯甲烷溶液；制备微球时，连续相和不连续相流速分别为4ml/h和6ml/h。
89.实施例6
90.本实施例要制备直径约300μm的具有连通孔隙的聚乳酸-羟基乙酸共聚物多孔微球，本实施例与实施案例1中的步骤相同，区别在于：制备等密度乳化体系时，把油相中的2.5wt％聚己内酯和0.5wt％聚己内酯-聚乙二醇嵌段共聚物替换为3wt％聚乳酸-羟基乙酸共聚物，且水相与油相的质量比为1/2.4。
91.对比例1
92.本对比例采用微流控-普通乳状液模板法制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物多孔微球，本对比例与实施案例6中的步骤相同，区别在于：不使用等密度乳化法，取而代之使用含3wt％聚乳酸-羟基乙酸共聚物的二氯甲烷溶液作为油相。
93.实验例
94.将实施例1-6和对比例1制得的多孔微球通过倒置荧光显微镜观察形状并拍照。得到图2至图8。
95.由图2至图8可得，采用本技术实施例提供的方法制备的多孔微球形状圆润规则，大小基本一致，而采用对比例1提供的普通乳状液模板制得的多孔微球的形貌不如实施案例6的均一。
96.用数学软件mathematica统计图2至图8中聚己内酯多孔微球的粒径分布，得到图9。
97.由图9可得，采用本技术实施例提供的方法制备的多孔微球的粒径分布相当集中，而采用对比例1提供的普通乳状液模板制得的多孔微球的粒径分布比实施案例6的明显更宽。
98.将实施例1-6和对比例1制得的多孔微球通过场发射扫描电镜观察形貌，得到图10至图16。
99.由图10至图16可得，采用本技术实施例提供的方法制备的多孔微球的表面和内部有大量直径为1-20μm的孔隙，且孔隙互相连通，而采用对比例1提供的普通乳状液模板制得的多孔微球的孔隙不均匀。
100.将实施例1制得的多孔微球与骨髓间充质干细胞(bmscs)直接接触共培养以检测其是否居于细胞毒性，在一系列时间点后用cck-8试剂盒检测细胞活性。结果见图17，其中纯聚己内酯实心微球用作对照。
101.由图17可得，本发明实施例提供的聚己内酯多孔微球具有很好的细胞相容性，与其共培养的bmscs的细胞活性和增殖速度与纯聚己内酯组和阴性对照组的接近。
102.将实施例1制得的多孔微球与骨髓间充质干细胞(bmscs)共培养以验证其细胞黏附性能，在一系列时间点后用细胞骨架染色试剂盒和dapi染色。得到共聚焦显微镜照片见图18。
103.由图18可得，本发明实施例提供的聚己内酯多孔微球具有抗细胞黏附的特性，这是因为聚己内酯-聚乙二醇嵌段共聚物可以形成抗污层，具有抗菌等应用的潜力。
104.将实施例1制得的多孔微球作为平台进行表面修饰，可以使其获得各种功能，从而满足更多应用的需求。可选的，用多巴胺修饰实施例1制得的多孔微球，与骨髓间充质干细胞(bmscs)共培养以验证其细胞黏附性能，在一系列时间点后用细胞骨架染色试剂盒和dapi染色。得到共聚焦显微镜照片见图19。
105.由图19可得，本发明实施例提供的聚己内酯多孔微球在简单的多巴胺修饰后表现出良好的细胞相容性和细胞黏附性能，具有细胞共培养等应用的潜力。
106.本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少还具有如下技术效果或优点：
107.(1)本发明实施例提供的乳状液模板通过调节多油相或多水相体系的密度使水相和油相的密度非常接近，让乳状液模板长时间保持稳定，从而获得均一的多孔微球；
108.(2)本发明实施例提供的方法通过改进的等密度乳化法以及已有的微流控技术，所产生的多孔微球粒径和形貌更均一，因此可以通过调节制备参数来生产特定的多孔微球；不需要使用乳化剂，产品不会有乳化剂残留；可用于各种微流控装置规模化生产单一产物而无需筛选，提高了生产质量、降低了生产成本，适合规模化生产；对于不易成孔的聚合物(如实施案例中所用的聚己内酯)，可通过添加两性聚合物来改善；
109.(3)本发明实施例提供的乳状液模板采用多种有机溶剂组成的多油相体系代替单一油相，通过改变不同有机溶剂的比例来调节油相的密度，使其和作为制孔剂的水相的密度非常接近，从而尽可能减小外力，使乳化后水油界面的表面张力能够维持乳状液的油包水结构，理论上在合适的环境下不会发生相分离，在实际使用中可长时间保持稳定；
110.(4)本发明实施例提供的乳状液模板采用可溶性盐调节水相的密度，来获得等密乳液模板。
111.最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
112.尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
113.显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围
之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。