一种高磁性纳米磁珠的制备及应用的制作方法

1.本发明属于纳米材料领域，具体涉及一种高磁性纳米磁珠的制备及应用。


背景技术：

2.磁性纳米粒子(magnetic nanoparticles，mnps)作为新型纳米材料，具备一般纳米材料所不具备的超顺磁性，因此在磁场作用下可实现快速的固液分离，简化离心和过滤的操作，在生物和化学提取以及水治理中有广阔的应用前景。目前磁性纳米粒子的制备方法主要包括物理粉碎法、生物培养法和化学合成法。物理粉碎法由于制备过程中影响内部结构或耗时长需要使用昂贵设备消耗大量能源，在工业化中使用很少。碱性共沉淀是化学合成法中最广泛的用来制备纳米磁性粒子的方法。主要为水解反应，将稀碱溶液滴加到摩尔比为1：2的fe
2+
和fe
3+
溶液中，当ph到达6-7时，铁盐溶液开始水解形成fe3o4。该方法需要在一定保护气体和温度条件下进行反应，反应结束后通过磁性分离或离心将mnps分离提纯。金属盐的种类、ph值、fe
2+
fe
3+
的摩尔比和搅拌速度是影响纳米粒子形貌和粒径的重要因素。
3.需要提到的是，生物培养法是指趋磁细菌经过实验室培养、修饰磁小体可获得生物活性的磁性纳米粒子。磁小体(bacterial magnetosomes，bms)是趋磁细菌在胞内合成的由fe3o4或者fe3s4组成的具有生物膜包被的纳米磁性晶体，从不同环境分离的趋磁细菌其磁小体大小形态也不同，bms通常以单链或多链的方式排列在趋磁细菌细胞中靠近细胞质膜的位置，因为bms在合成过程中会受到趋磁细菌细胞在基因及蛋白水平的高度调控，所以bms有着形态、大小、磁性高度均一的特点，因而被医学治疗和生化环保等领域广泛应用，除此之外，bms还表现生物膜包被和低毒性的特点。bms被生物膜包被，在水中可保持自身稳定，膜表面含有磷脂和蛋白质，且具有氨基、羧基、糖类等，生物膜整体带负电，因此保证了bms在水溶液中具有良好的分散性；bms在分离提取时所携带的如蛋白质、核酸等杂质可能造成其一定的免疫原性，但在bms浓度较低时，其毒性微小，不会对周围环境或系统造成影响。传统认为生物培养法只能根据现存趋磁细菌进行提取，只能得到特定种类和粒度的mnps，限制了该方法的应用。
4.目前国内外利用bms作为磁性载体来吸附分离的研究较少，大多选择化学合成的磁珠作为磁性载体。但从成本上计算，目前市售的磁珠价格是bms成本的好几倍，从载体优势上看，人工化学合成的磁珠的大小形态以及磁性稳定性也很难做到如bms般的高度一致。


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对现有技术的不足，提供通过趋磁细菌的磁小体二次生长制备得到的高磁性纳米磁珠，该磁珠的大小均一，磁性稳定性好。具体的技术方案如下：
6.一方面，本发明提供一种高磁性纳米磁珠，其晶种为磁小体去膜后的矿物晶体，粒径在4～10nm之间。
7.所述磁小体从趋磁细菌中提取得到。
8.所述磁小体的制备方法包括：将趋磁细菌进行细胞破碎，经磁铁吸附后收集磁小体粗提物，利用缓冲液重悬所述磁小体粗提物，先采用缓冲液清洗，再采用水反复清洗。
9.该高磁性纳米磁珠的晶种的制备方法包括：将磁小体悬浮于去膜处理溶液中，煮沸10～20min，用水反复清洗后采用磁铁吸附；所述去膜处理溶液包括sds和naoh。
10.第二方面，本发明提供一种高磁性纳米磁珠的制备方法，磁小体的矿物晶体作为晶种，二次生长得到高磁性纳米磁珠。
11.具体的，所述二次生长的过程为：将含二价铁fe
2+
离子的盐溶液和含三价铁fe
3+
离子的盐溶液混合，加热搅拌，得到铁离子混合液；向铁离子混合液中加入矿物晶体，再加入氨水，搅拌，得到fe3o4二次生长包覆表面的高磁性纳米粒子，即高磁性纳米磁珠。
12.具体的，铁离子混合液通过配置摩尔比为fe
3+
：fe
2+
＝3：2～4：1的fe
3+
盐溶液和fe
2+
盐溶液混合得到，其中fe
3+
溶液为fecl3·
6h2o或fecl3，fe
2+
溶液为fecl2·
4h2o或feso4溶液；搅拌下加热至90℃，90℃恒温备用。
13.第三方面，本发明还提供上述高磁性纳米磁珠在新鲜动物组织、动物组织石蜡切片、植物叶片、种子、全血、血清游离、毛发、指甲、烟蒂、唾液、细菌或病毒等生物检材中的核酸提取及纯化。
14.第四方面，本发明还提供一种核酸提取试剂或试剂盒，该核酸提取试剂或试剂盒包括上述的高磁性纳米磁珠。
15.第五方面，本发明还提供一种核酸提取方法，包括以下步骤：取上述的核酸提取试剂或试剂盒与与待提取样本混合，得到核酸吸附物。
16.与现有技术相比，本发明具有如下突出效果：
17.1)本发明利用bms制备高磁性纳米磁珠填补了生物培养法在吸附分离领域的应用空白，将bms的矿物晶体作为晶种二次生长制备得到高磁性纳米磁珠，一方面，bms中的矿物晶体大小均一，比表面积大，单磁畴，利用该矿物晶体作为晶种制备得到的纳米磁珠具有超顺磁性，方便磁性分离，另一方面，且由于矿物晶体的生物来源特性，毒性低，生物相容性好，相比人工合成的磁性纳米粒子，制备得到的纳米磁珠应用更为广泛。
18.2)利用矿物晶体做晶种加入到二价铁和三价铁的铁离子混合溶液中二次生长形成纳米磁珠，反应要求更低，制备过程简单，磁性稳定性强，且由于晶种的尺寸均一，分散性好，制备得到的磁珠尺寸可控，均一性。
19.3)采用上述制备得到的磁珠进行核酸的提取，将磁珠洗脱后再进行核酸的扩增。利用该磁珠提取核酸进行检测的方法与商业化磁珠法试剂盒对比，在无需增加蛋白酶的条件下，依然能保证检测的灵敏度，缩短了检测的时间，性能优异。
附图说明
20.图1为实施例1中从趋磁细菌中分离的磁小体(4-10nm)显微镜图；
21.图2为实施例3中基于磁小体二次生长后得到的高磁性纳米粒子(300-400nm)显微镜图。
具体实施方式
22.下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术
人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
23.实施例1磁小体的纯化
24.将发酵培养完成的趋磁细菌的菌体，离心处理，8000rpm，25℃，5min后弃去上清液，收集完成后将菌泥按1:10(m/v)的比例悬浮于0.1mol/lpbs缓冲液中，在冰水浴的条件下在超声细胞破碎仪中进行细胞破碎，初始功率200w，超声3s，间隔5s，运行30min，将破碎后的菌体置于磁铁上吸附过夜，使磁小体沉降。待磁小体全部沉降于瓶底后，弃去上清液，沉淀再以1:10(m/v)的比例加入0.01mol/lpbs缓冲液，在冰水浴的条件下在超声细胞破碎仪中进行细胞破碎，初始功率100w，超声3s，间隔5s，运行20min，将破碎后的菌体置于磁铁上吸附过夜后弃去上清，重复该过程若干次，直至上清液完全澄清。
25.在电泳槽中放入侧面打有孔洞的无盖培养皿，在电泳槽底部放置磁铁，将纯化后的磁小体倒入无盖培养皿中，置于磁铁正上方，向电泳槽中倒入1
×
tae缓冲液，直至缓冲液完全没过无盖培养皿，设置洗脱电流为150ma，洗脱时间30min，洗脱bms表面的核酸，待洗脱完成后，收集磁小体，收集到的磁小体大小在4～10mm之间，如图1所示。
26.实施例2晶种的制备
27.将磁小体悬浮于去膜处理溶液中，煮沸10～20min，用水反复清洗后采用磁铁吸附。其中去膜处理溶液包括于10％～15％sds与1～2m naoh的混合液。
28.实施例3磁珠的制备
29.制备铁离子混合液，将fe
3+
：fe
2+
＝3：2的fecl3·
6h2o盐溶液和feso4溶液混合，搅拌下加热至90℃，90℃恒温备用。
30.由实施例2磁小体去膜后得到的矿物晶种，加入到上述铁离子混合液中，再加入氨水，搅拌，得到fe3o4二次生长包覆表面的高磁性纳米粒子，即高磁性纳米磁珠，通过二次生长的控制，该纳米粒子的大小在300～400nm之间，如图2所示。
31.实施例4磁珠的制备
32.制备铁离子混合液，将fe
3+
：fe
2+
＝3：1的fecl3溶液和feso4溶液混合，搅拌下加热至90℃，90℃恒温备用。
33.其余fe3o4二次生长的步骤和实施例3相同。
34.实施例5
35.制备铁离子混合液，将fe
3+
：fe
2+
＝4：1的fecl3溶液和fecl2·
4h2o溶液混合，搅拌下加热至90℃，90℃恒温备用。
36.其余fe3o4二次生长的步骤和实施例3相同。
37.实施例6
38.利用实施例3获得的高磁性纳米磁珠，按照商业的ag-hpv提取试剂盒对临床阳性样本进行核酸提取，步骤如下：
39.在96孔板第1/7列a-h孔依次加入500μl溶液lysis和300μl拭子样本；
40.在96孔板第2/8列a-h孔分别加入400μl溶液w1；
41.在96孔板第3/9列a-h孔分别加入400μl溶液w2；
42.在96孔板第5/11列a-h孔分别加入200μl磁珠水溶液保存液mb；
43.在96孔板第6/12列a-h孔加入80μl洗脱液eb；
44.将加好溶液的96孔板放入全自动核酸提取仪中进行实验。
45.具体提取程序如下：
46.表1高磁性纳米磁珠提取hpv阳性样本核酸的程序
[0047][0048]
对比商业磁珠法试剂盒中的磁珠进行提取的核酸，本发明高磁性纳米磁珠提取的核酸pcr扩增过程和结果如下：
[0049]
高危型人乳头瘤病毒核酸检测试剂盒：总体积20μl，上样2μl。使用slan-96p rt-pcr仪器，pcr反应耗时105min。
[0050]
表2：核酸pcr扩增过程和结果
[0051][0052]
由此可以看出，基于磁小体二次生长后得到的高磁性纳米粒子(本发明)，在hpv病毒核酸提取反应中，提取性能达到了进口商业化提取试剂盒相同水平。但在提取过程中，本
发明制备的高磁性纳米粒子不依赖蛋白酶k，且提取时间显著短于进口产品，展示出其优异的性能。