一种新的抗原乳化方法与流程

1.本发明属于乳化方法技术领域，具体涉及一种新的抗原乳化方法。


背景技术：

2.抗体在生物医学领域的应用极为普遍，无论是抗体药发现，还是靶点蛋白的科研探索都离不开抗体。杂交瘤技术在生产抗体中应用十分广泛。而为了让小鼠的b细胞具有较强的免疫应答反应，产生更高效价的抗体，常常需要使用佐剂。最常见的佐剂是弗氏佐剂，它与抗原混合乳化过程中，含有抗原的小水滴被油所捕获，形成稳定的颗粒，注射到宿主组织后能发挥抗原仓库的作用，增强免疫的效果。过程中要充分发挥佐剂的作用，良好的乳化效果十分重要。
3.乳化是液体与液体之间的一种界面现象，两种不相溶的液体，如油与水，在容器中分成两层，密度小的油在上层，密度大的水在下层，如果加入适当的表面活化剂在强烈的搅拌下，油被分散在水中，形成乳状液，该过程就叫乳化。乳化好的标志是取一滴乳化剂滴入水中呈现球形而不分散。如出现平展扩散即为未乳化好。乳化过的物质放置一段时间(在保存期内)出现油水分层也是未乳化好的表现。常用的乳化方法有研钵法、注射器互推法、振荡法、搅拌法、超声波法。
4.研钵法，顾名思义是用研钵磨的。具体做法是在研钵内先加入佐剂，然后一滴一滴加抗原，边加边按同一方向研磨，滴加抗原的速度要慢。待抗原全部加入后，继续研磨一段时间，使之成为乳白色粘稠的油包水乳剂。本法适用于制备大量的佐剂抗原，缺点是研钵壁上粘附大量乳剂，抗原损失较大。对于小剂量的抗原乳化一般不被采用。注射器互推法也称三通管乳化法，是将等量的弗氏佐剂和抗原溶液分别吸入两个注射器内，两注射器之间以一三通管相连，注意排净空气，然后交替推动针管，直至形成粘稠的乳剂为止。本法优点是容易做到无菌操作，抗原损失少，适用于制备少量的抗原乳剂。但缺点是常常出现注射器乳头与三通管连接不紧密导致注射器互推时出现爆管渗漏，造成抗原的损失，同时乳化一个抗原耗时较长，时间大约在半小时左右。
5.市面上也存在着自制的抗原乳化器，应用电动马达带动小搅拌器进行搅拌从而达到乳化的目的。这样的方法制作比较繁琐、乳化过程中要求操作细心，乳化过程较长且搅拌时暴露于空气中，无法严格控制无菌。也有文献报道采用涡旋振荡器的ep管方法将抗原佐剂乳化，这种乳化方法优点是可以严格控制无菌，但不足是涡旋振荡器的乳化时间较长，且经过测试，仅适用于少量抗原和佐剂的乳化，且乳化效果并不理想。
6.现在国内一些条件比较好的实验室使用的乳化方法是超声波乳化法。它的原理是利用强超声波作用使液体中的其它液体粉碎成微粒并与周围液体充分混合形成乳化液的技术。粉碎液体的物理机制一般认为是超声空化效应。这种乳化方法比较省事，但缺点是需要控制超声频率和时间，且超声过程中容易激发一些自由基，对抗原有未知损害。考虑高温对抗原的影响，常常需要在冰上操作。且超声乳化仪费用昂贵，不易控制无菌，因而和涡旋振荡器一样，并不被广泛采用。而且上述五种方法乳化抗原均费时费力，抗原损失大的局
限。


技术实现要素：

7.本技术的主要目的在于提供一种省时、省力，抗原损失小，乳化完全且稳定性好，易于无菌操作可进行广泛推广的简易有效的新的抗原乳化方法。
8.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
9.一种新的抗原乳化方法，包括以下步骤：
10.(1)将抗原和佐剂加入无菌的1.5ml ep管中，用银汞调合仪金属震荡臂的两个夹片夹紧ep管；
11.(2)打开银汞调合仪，设置振荡频率4500-5000次/分钟，高速震荡30s，然后停置30s，再高速震荡30s，如此反复至少4次；
12.(3)将结束震荡的ep管进行冷却，再高速震荡30s，离心沉淀，得所述乳化抗原。
13.银汞调合仪，又名银汞调合器、银汞调合机、银汞调拌机等。适用于口腔科混合银合金粉及汞的一种专用设备。混合后的银汞合金(amalgam)是一种特殊类型的合金，由汞与一种或多种金属形成。银汞调合仪的结构包含一个金属振荡臂，用于夹紧胶囊振荡混合，其两个夹片之间刚好可以夹紧1.5ml ep管。将适量的抗原与弗氏完全佐剂或弗氏不完全佐剂混合，将其夹在振荡臂上进行振荡调合乳化。
14.与涡旋振荡的方法不同，涡旋振荡在于管内水相与油相在向心力的作用下混合乳化，而银汞调合仪是利用混合液体的高频振动达到水相与油相的充分调合。现在的银汞调合仪的摇臂可以作出特殊的运动轨迹(8字形运动轨迹)，使混合更为充分。因银汞合金调合的应用限制，现在市面上出现的银汞调合仪的振荡频率普遍在2800-5000次/分钟。
15.申请人通过试验摸索了仪器不同振荡频率与时间对抗原佐剂乳化效果的影响。发现银汞调合仪可以轻松的达到完全乳化的效果。
16.上述一种新的抗原乳化方法，作为一种优选的实施方案，步骤(1)中，所述佐剂为弗氏佐剂，所述抗原与所述佐剂的体积比为1:1-3:2。
17.弗氏佐剂一般指弗氏体。是动物实验中最常用的佐剂。分为不完全弗氏佐剂和完全弗氏佐剂。不完全弗氏佐剂是液体石蜡与羊毛脂混合而成，组分比为1～5：1，可根据需要而定，通常为2：1。不完全佐剂中加卡介苗(最终浓度为2～20mg/ml)或死的结核分枝杆菌，即为完全弗氏佐剂(fca)。两种佐剂在小鼠的免疫操作中不同，首次免疫用弗氏完全佐剂进行抗原乳化，之后的免疫操作用弗氏不完全佐剂进行抗原乳化。
18.上述一种新的抗原乳化方法，作为一种优选的实施方案，步骤(1)中，ep管中，抗原和佐剂的总含量为400-800μl。
19.上述一种新的抗原乳化方法，作为一种优选的实施方案，步骤(2)和步骤(3)中，所述再高速震荡的震荡频率为4500-5000次/分钟，震荡时间为30s。
20.上述一种新的抗原乳化方法，作为一种优选的实施方案，步骤(3)中，所述冷却的温度为-20℃，冷却时间为2-3min。
21.上述一种新的抗原乳化方法，作为一种优选的实施方案，步骤(3)中，所述离心沉淀为采用微型离心机离心沉淀，离心的转速为3000rpm，离心的时间为1-2min。
22.上述一种新的抗原乳化方法，作为一种优选的实施方案，步骤(3)中，待离心沉淀
后，采用注射器吸取沉于ep管底部的白色抗原乳剂。离心沉淀抗原乳液，将其转移至注射器中用于免疫小鼠制备单克隆抗体。
23.用1ml注射器吸取沉于ep管底部的白色抗原乳剂，先将注射器的针头取下，用注射器乳头插入乳剂中，边吸边慢慢向乳液下插入，可以再将ep管离心后，底部无法吸入的改用套上针头去吸，回抽真空让针头慢慢吸进乳剂，保证抗原的不损失。以上操作在无菌控制的生物安全柜中进行无菌操作。
24.本发明的有益效果为：本发明所述新的抗原乳化方法借助银汞调合仪进行抗原乳化，通过大量实验摸索出不同震荡频率和时间对抗原佐剂乳化效果的影响，从而选择合适的震荡频率和震荡时间以达到完全乳化的效果。
25.本发明所述新的抗原乳化方法大大缩短了乳化时间，在10min内即可轻松完成抗原乳化，且乳化效果显著。因本技术所述乳化方法的乳化过程在ep管中进行，容易控制无菌且几乎无抗原损失，本技术所述方法所得乳化抗原乳化完全，稳定性好、血清效价高。
附图说明
26.图1为本发明所述抗原乳化方法所得抗原乳剂在滴水实验中48小时的稳定性研究图；
27.图2为本发明所述抗原乳化方法所得抗原乳剂在4℃的冰箱中保存一周后进行滴水实验48小时的稳定性研究图；
28.图3为本发明所述抗原乳化方法所得抗原乳剂免疫小鼠的血清效价研究结果。
具体实施方式
29.为了使本技术领域的人员更好地理解本技术方案，下面将结合案例对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本技术保护的范围。
30.实施例1
31.实施例1所述新的抗原乳化方法，包括以下步骤：
32.(1)将体积比为1：1的抗原和弗氏佐剂加入无菌的1.5ml ep管中，抗原和弗氏佐剂的总加入量为600μl，用银汞调合仪金属震荡臂的两个夹片夹紧ep管；
33.(2)打开银汞调合仪，设置振荡频率为5000次/分钟，高速震荡30s，然后停置30s，再在振荡频率为5000次/分钟的条件下高速震荡30s，如此反复4次；
34.(3)将结束震荡的ep管在温度为-20℃的条件下冷却2min，再在振荡频率为5000次/分钟的条件下高速震荡30s，采用微型离心机离心沉淀，离心的转速为3000rpm，离心的时间为1min；
35.待离心沉淀后用1ml注射器吸取沉于ep管底部的白色抗原乳剂，先将注射器的针头取下，用注射器乳头插入乳剂中，边吸边慢慢向乳液下插入，可以再将ep管离心然后再吸取抗原，底部无法吸入的改用套上针头去吸，回抽真空让针头慢慢吸进乳剂，保证抗原的不损失。以上操作在无菌控制的生物安全柜中进行无菌操作。
36.实施例2
37.实施例2所述新的抗原乳化方法，包括以下步骤：
38.(1)将体积比为3：2的抗原和弗氏佐剂加入无菌的1.5ml ep管中，抗原和弗氏佐剂的总加入量为700μl，用银汞调合仪金属震荡臂的两个夹片夹紧ep管；
39.(2)打开银汞调合仪，设置振荡频率为5000次/分钟，高速震荡30s，然后停置30s，再在振荡频率为5000次/分钟的条件下高速震荡30s，如此反复5次；
40.(3)将结束震荡的ep管在温度为-20℃的条件下冷却2.5min，再在振荡频率为5000次/分钟的条件下高速震荡30s，采用微型离心机离心沉淀，离心的转速为3000rpm，离心的时间为1.5min；
41.待离心沉淀后用1ml注射器吸取沉于ep管底部的白色抗原乳剂，先将注射器的针头取下，用注射器乳头插入乳剂中，边吸边慢慢向乳液下插入，可以再将ep管离心后，底部无法吸入的改用套上针头去吸，回抽真空让针头慢慢吸进乳剂，保证抗原的不损失。以上操作在无菌控制的生物安全柜中进行无菌操作。
42.实施例3
43.实施例3所述新的抗原乳化方法，包括以下步骤：
44.(1)将体积比为3：2的抗原和弗氏佐剂加入无菌的1.5ml ep管中，抗原和弗氏佐剂的总加入量为700μl，用银汞调合仪金属震荡臂的两个夹片夹紧ep管；
45.(2)打开银汞调合仪，设置振荡频率为5000次/分钟，高速震荡30s，然后停置30s，再在振荡频率为5000次/分钟的条件下高速震荡30s，如此反复4次；
46.(3)将结束震荡的ep管在温度为-20℃的条件下冷却3min，再在振荡频率为5000次/分钟的条件下高速震荡30s，采用微型离心机离心沉淀，离心的转速为3000rpm，离心的时间为2min；
47.待离心沉淀后用1ml注射器吸取沉于ep管底部的白色抗原乳剂，先将注射器的针头取下，用注射器乳头插入乳剂中，边吸边慢慢向乳液下插入，可以再将ep管离心后，底部无法吸入的改用套上针头去吸，回抽真空让针头慢慢吸进乳剂，保证抗原的不损失。以上操作在无菌控制的生物安全柜中进行无菌操作。
48.1、本技术所述新的抗原乳化方法所得抗原佐剂的稳定性研究
49.稳定性研究结果如表1所示:
50.备注：表1中所描述抗原佐剂的制备方法除振荡时间与实施例1的振荡时间不同之外，其余操作步骤均与实施例1相同。
[0051]-：抗原乳液滴入水中1min内消散开；
[0052]
+：抗原乳液滴入水中不立马消散，先外围散开，后在5min内消散；
[0053]
++：抗原乳液滴入水中不立马消散，先外围散开，后在5min-10min内消散；
[0054]
+++：抗原乳液滴入水中不消散，过5min内外围散开后，抗原维持20min不散开。
[0055]
secondary antibody hrp(in 1％bsa/pbs)100μl per well，37℃恒温箱孵育1h。洗板，重复步骤2。
[0074]
7.显色：加入tmb底物显色液100μl per well，室温显色10min。
[0075]
8.终止：加入2mol/l的hcl溶液50μl per well，终止反应。反应终止后尽快酶标仪上机读数。
[0076]
9.检测：酶标仪检测450nm处吸光值，并保存原始数据和导出excel数据。
[0077]
检测结果如图3所示。
[0078]
从图3可以看出：本技术实施例3所述乳化的抗原进行小鼠免疫制备单克隆抗体，小鼠的免疫效果好，2轮免疫的血清效价可达105～106(血清稀释100000-1000000倍检测od450值大于1.0)。小鼠的血清效价可达106。
[0079]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。