离子交换填料的表面修饰方法与流程

1.本发明涉及离子交换填料领域，特别涉及一种离子交换填料的表面修饰方法。


背景技术：

2.现在液相色谱填料材料广泛应用在药物开发、物质分析分离等技术领域，其中高效液相色谱技术(hplc)是一种最常用的分析分离手段。而液相色谱填料(即液相色谱层析介质)则是高效液相色谱技术赖以建立和发展的关键性基础。其中，离子交换填料即为一种常见的液相色谱填料。随着细胞技术和生物工程的发展，存在着大量的蛋白质、酶等生物分子的纯化、分析工作，离子交换填料需要具有更高的动态载量(dynamic binding capacity，dbc)，使其在相同甚至更少的用量下分离纯化更多的目标蛋白。
3.现有的离子交换填料的动态载量一般不超过60mg/ml，而随着蛋白分离纯化要求的提高以现有的离子交换填料已逐渐无法满足产业的需求，迫切需要快速、高载量的离子交换填料以满足蛋白纯化的需求。


技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本发明提供了一种离子交换填料的表面修饰方法，可增大离子交换材料的动态载量。
5.本发明通过以下技术方案实现：
6.一种离子交换填料的表面修饰方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.基球修饰：在修饰釜中加入纯化水以及氢氧化钠固体，搅拌均匀；向修饰釜内加入聚丙烯酸酯基球，搅拌均匀；向修饰釜内滴加入丙三醇缩水甘油醚，进行搅拌反应至少3小时；反应结束后，将物料转移入离心机进行甩滤得到修饰物料；
8.键合反应：在键合釜中加入纯化水以及硝酸，搅拌均匀；向键合釜内加入基球修饰后的得到的修饰物料、甲基丙烯酸缩水甘油酯以及1,4-二氧六环，进行第一次搅拌反应；反应结束后，向键合釜内加入三甲胺水溶液，进行第二次搅拌反应；反应结束后，将物料转移入离心机进行甩滤。
9.进一步的，所述基球修饰步骤中聚丙烯酸酯基球、氢氧化钠固体以及丙三醇缩水甘油醚的重量比为1：2.8～3.1:9.3～9.5。
10.进一步的，所述聚丙烯酸酯基球与丙三醇缩水甘油醚的重量比为1:9.4。
11.进一步的，所述键合反应步骤中修饰物料、硝酸、甲基丙烯酸缩水甘油酯、1,4-二氧六环以及三甲胺的重量比为1：0.09～0.11：0.23～0.25:1.4～1.6:1.8～2.2。
12.进一步的，所述丙三醇缩水甘油醚的滴加方式为在温度30～35℃下匀速滴加丙三醇缩水甘油醚，滴加时间为2.5～3.0小时。
13.进一步的，所述键合反应中第一次搅拌反应的搅拌反应的时间至少1小时，搅拌反应的温度为20～30℃。
14.进一步的，所述键合反应中第二次搅拌反应的搅拌反应的时间至少18小时，搅拌
反应的温度为20～30℃。
15.进一步的，所述基球修饰还包括如下步骤：
16.漂洗：使用纯化水对离心过滤后的得到的物料进行洗涤，洗涤完毕后滤干；使用无水乙醇对滤干后的物料进行洗涤，洗涤完毕后滤干；使用纯化水对滤干后的物料进行洗涤，洗涤结束后滤干；
17.洗涤：使用0.5m硫酸水溶液对漂洗后的物料进行洗涤；使用纯化水进行再次洗涤，洗涤完毕后滤干；将滤干后的物料装入物料桶备用。
18.进一步的，所述键合反应还包括如下步骤：
19.纯化水漂洗：将离心滤干后的物料使用纯化水进行洗涤，洗涤结束后滤干；
20.硫酸洗涤：将漂洗后的物料使用0.5m硫酸水溶液进行洗涤，之后使用纯化水进行洗涤，洗涤完毕后滤干；
21.沉降：将滤干后的物料转移至沉积桶，加入20％乙醇水溶液，搅拌均匀，沉降，填料分层后，抽去上层清液；重复沉降多次；
22.离心过滤：将沉降后的物料转移至离心机进行离心过滤。
23.进一步的，所述键合反应中沉降次数为2次。
24.相比于现有技术，本发明的优点在于：
25.1、本发明提供了一种离子交换填料的表面修饰方法，通过对聚丙烯酸酯基球进行修饰后进行表面活化以及键合反应，实现了增大离子交换的材料的动态载量，进而具有离子交换容量高、蛋白结合载量高、操作流速快等特点。
26.2、通过控制聚丙烯酸酯基球与丙三醇缩水甘油醚的重量比为1:9.3～9.5并选用匀速滴加甲基丙烯酸缩水甘油酯的方式，使得丙三醇缩水甘油醚在添加过程中不会因用量过多或分散不均匀而将聚丙烯酸酯基球表面的孔覆盖，进而避免内部孔隙的官能团不能与丙三醇缩水甘油醚接触、被修饰的官能团变少进而影响产品载量；并且也不会因丙三醇缩水甘油醚过少而导致聚丙烯酸酯基球内部的官能团无法完全被修饰；进一步增大离子交换的材料的动态载量。
附图说明
27.图1为本发明一种离子交换填料的表面修饰方法中基球修饰步骤的流程图；
28.图2为本发明一种离子交换填料的表面修饰方法中键合反应步骤的流程图。
具体实施方式
29.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明作进一步的详细说明，以使本领域技术人员能够充分理解本发明的技术内容。应理解，以下实施例用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适的范围内选择，而并非要限定于下文示例的具体数值。
30.参照图1至图2，本发明提供一种离子交换填料的表面修饰方法，包括以下主要步骤：
31.s1基球修饰：
32.修饰：在修饰釜中加入纯化水以及氢氧化钠固体，搅拌均匀；向修饰釜内加入聚丙烯酸酯基球，搅拌均匀；向修饰釜内加入丙三醇缩水甘油醚，进行搅拌反应至少3小时。其中，氢氧化钠固体、聚丙烯酸酯基球以及丙三醇缩水甘油醚的重量比为2.8～3.1:1:8.4～10.4，优选为2.8～3.1:1:9.3～9.5。进一步的，聚丙烯酸酯基球与丙三醇缩水甘油醚的重量比为优选为1:9.4。优选的，丙三醇缩水甘油醚的滴加方式为在温度30～35℃下匀速滴加丙三醇缩水甘油醚，滴加时间为2.5～3.0小时。
33.离心过滤：将反应结束得到的修饰物料移入离心机进行甩滤。
34.纯化水漂洗：使用纯化水对离心过滤后的得到的物料进行洗涤，其中，纯化水与聚丙烯酸酯基球的重量比为6～7:1，洗涤完毕后将物料滤干。
35.乙醇漂洗：使用无水乙醇对滤干后的物料进行洗涤，其中，无水乙醇与聚丙烯酸酯基球的重量比为5～6:1，洗涤完毕后将物料滤干。
36.纯化水漂洗：使用纯化水对离心过滤后的得到的物料进行洗涤，其中，纯化水与聚丙烯酸酯基球的重量比为6～7:1，洗涤完毕后将物料滤干。
37.硫酸洗涤：使用0.5m硫酸水溶液对漂洗后的物料进行洗涤，其中，0.5m硫酸水溶液与聚丙烯酸酯基球的重量比为10～11:1。
38.纯化水洗涤：使用纯化水进行再次洗涤，其中，纯化水与聚丙烯酸酯基球的重量比为6～7:1，洗涤完毕后将物料滤干。
39.装入物料桶：将滤干后的物料装入物料桶备用。
40.s2键合反应：
41.表面活化：在键合釜中加入纯化水以及硝酸，搅拌均匀；向键合釜内加入基球修饰后的得到的修饰物料、甲基丙烯酸缩水甘油酯以及1,4-二氧六环，进行第一次搅拌反应。其中，硝酸、修饰物料、甲基丙烯酸缩水甘油酯、1,4-二氧六环的重量比为0.09～0.11：1：0.23～0.25:1.4～1.6。第一次搅拌反应的搅拌反应的时间至少1小时，搅拌反应的温度为20～30℃。
42.键合：表面活化反应结束后，向键合釜内加入三甲胺水溶液，进行第二次搅拌并进行键合反应。其中，修饰物料与三甲胺的重量比为1：1.8～2.2。第二次搅拌反应的搅拌反应的时间至少18小时，搅拌反应的温度为20～30℃。
43.离心过滤：将键合反应后得到的物料转移入离心机进行甩滤。
44.纯化水漂洗：将离心滤干后的物料使用纯化水进行洗涤，其中，纯化水与修饰物料的重量比为5～7:1，洗涤结束后将物料滤干。
45.硫酸洗涤：将漂洗后的物料使用0.5m硫酸水溶液进行洗涤，其中，0.5m硫酸水溶液与修饰物料的重量比为10～11:1。
46.纯化水漂洗：使用纯化水继续进行洗涤，其中，纯化水与修饰物料的重量比为5～7:1，洗涤完毕后将物料滤干。
47.沉降：将滤干后的物料转移至沉积桶，加入20％乙醇水溶液，其中，20％乙醇水溶液与修饰物料的重量比为12～14:1，搅拌均匀，沉降，填料分层后，抽去上层清液；重复沉降2次；
48.离心过滤：将沉降后的物料转移至离心机进行离心过滤。
49.包装：离心后的物料用20％乙醇水溶液分散均匀，其中，20％乙醇水溶液与修饰物料的重量比为15～17:1，装入物料桶，取样送检，将物料桶封口并贴成品标签置待检区，待检验合格后入库。
50.实施例1
51.修饰反应：在100l修饰釜中泵入纯化水16.62kg，投入氢氧化钠固体1.00kg，搅拌溶解；向釜内加入6.00kg的聚丙烯酸酯基球，搅拌均匀；向修饰釜内均匀滴加56.42kg丙三醇缩水甘油醚，维持温度30～35℃，2.5～3.0小时滴加完毕，保温30～35℃搅拌反应3小时。反应结束后，将物料转移入离心机进行甩滤。
52.将离心过滤后的得到的物料用纯化水洗涤三次，每次使用40.00kg纯化水，洗涤结束后滤干；
53.继续用无水乙醇对滤干后的物料进行洗涤三次，，每次使用32.00kg无水乙醇，洗涤结束后滤干；
54.继续将滤干后的物料用纯化水洗涤三次，每次使用40.00kg纯化水，洗涤结束后滤干；
55.滤干后的物料使用63.00kg的0.5m硫酸水溶液洗涤，之后用纯化水洗涤10次，每次使用40.00kg纯化水，洗涤完毕后滤干备用。
56.键合反应：向100l键合釜中泵入纯化水36.00kg，加入硝酸0.60kg，搅拌均匀；加入基球修饰后的得到的修饰物料、甲基丙烯酸缩水甘油酯1.44kg、1，4-二氧六环9.00kg，在20～30℃的温度下搅拌反应1小时。反应结束后，继续向键合釜中加入30％三甲胺水溶液18.48l，在20～30℃的温度下搅拌反应18小时。反应结束后，将物料转移入离心机进行甩滤。
57.将离心滤干后的物料使用纯化水洗涤10次，每次使用40.00kg纯化水，洗涤结束后滤干；
58.之后用63.00kg的0.5m硫酸水溶液对滤干后的物料进行洗涤，再用纯化水洗涤10次，每次使用40.00kg纯化水，洗涤结束后滤干备用。
59.将滤干物料转移至沉降罐，加入76.00kg的20％乙醇水溶液，搅拌均匀，沉降，填料分层后，抽去上层清液。重复沉降操作2次。
60.将物料转移至d级清洁区中，并将物料转移至离心机，进行离心过滤并保持。滤干的物料用96.00kg的20％乙醇水溶液分散均匀，装入物料桶，取样送检，之后将物料桶封口并贴成品标签置待检区，待检验合格后入库。
61.经过上述离子交换填料的表面修饰方法制备得到的离子交换填料的动态载量可达87.1mg/ml。
62.实施例2
63.与实施例1的区别仅在于：丙三醇缩水甘油醚的添加量为62.06kg，添加方式为将丙三醇缩水甘油醚分为六等份，每半小时添加一份丙三醇缩水甘油醚。其余步骤以及用量均与实施例1相同，在此不作赘述。
64.经过上述离子交换填料的表面修饰方法制备得到的离子交换填料的动态载量可达63mg/ml。
65.实施例3
66.与实施例1的区别仅在于：丙三醇缩水甘油醚的添加量为50.78kg，添加方式为将丙三醇缩水甘油醚分为六等份，每半小时添加一份丙三醇缩水甘油醚。其余步骤以及用量均与实施例1相同，在此不作赘述。
67.经过上述离子交换填料的表面修饰方法制备得到的离子交换填料的动态载量可达59.6mg/ml。
68.实施例4
69.与实施例1的区别仅在于：丙三醇缩水甘油醚添加方式为将丙三醇缩水甘油醚分为六等份，每半小时添加一份丙三醇缩水甘油醚。其余步骤以及用量均与实施例1相同，在此不作赘述。
70.经过上述离子交换填料的表面修饰方法制备得到的离子交换填料的动态载量可达76mg/ml。
71.实施例5
72.与实施例1的区别仅在于：丙三醇缩水甘油醚添加方式一次性加入。其余步骤以及用量均与实施例1相同，在此不作赘述。
73.经过上述离子交换填料的表面修饰方法制备得到的离子交换填料的动态载量可达75.5mg/ml
74.实施例1～5制备的离子交换填料动态载量见下表1：
[0075][0076]
由表1数据可以看出，采用本发明的表面修饰方法制备得到的离子交换填料的动态载量可达到59～88mg/ml，相比于现有的离子交换填料的载量更为优异，且具有离子交换容量高、蛋白结合载量高、操作流速快等特点。并且，通过控制聚丙烯酸酯基球与丙三醇缩水甘油醚的重量比为1:9.3～9.5，可将离子交换填料的动态载量控制为75～88mg/ml。进一步采用匀速滴加丙三醇缩水甘油醚的加料方式，可使离子交换填料的动态载量达到87.1mg/ml。可见，控制聚丙烯酸酯基球与丙三醇缩水甘油醚的重量比为1:9.3～9.5以及匀速滴加丙三醇缩水甘油醚的加料方式均可进一步提高离子交换填料的动态载量，从而进一步提升离子交换填料的性能。
[0077]
需要指出的是，上述较佳实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。