样品制备的制作方法

本发明涉及收集临床样品并制备它们用于分析，例如通过分子生物学处理技术如核酸扩增和/或检测；更具体地，涉及用于该目的的采样装置，特别适用于临床护理点(poc)或需求点(pon)环境，而且还用于送至远程实验室进行测试。本发明的某些方面涉及可用于制备用于核酸扩增和/或检测的样品的方法和组合物。

背景技术：

1、聚合酶链式反应(pcr)是简便的核酸扩增方法，用于测试生物样品中是否存在特定核酸(dna或rna)。除其他用途外，其还用作鉴定病原体或疾病标志物的诊断方法。扩增核酸样品的其他方法包括等温扩增方法，如重组酶聚合酶扩增(rpa)和环介导等温扩增(lamp)。

2、在任何此类诊断测试之前，需要一定量的样品制备，以便将核酸与所使用的扩增过程兼容的状态呈现。基于实验室的提取方法通常旨在提供高浓度的高纯度核酸，目的在于获得尽可能多的核酸。这是以简单性为代价的，并且基于实验室的提取技术通常需要使用与临床环境不兼容的试剂和设备如离心机。

3、临床样品的制备只需要足够的核酸来进行测试。这是一个重要的区别，因为其提供了提取过程的显著简化。例如，众所周知，使用简单的滤纸可以从生物样品中的靶标(甚至可以从复杂的样品基质如全血)捕获足够的核酸，以便经由pcr进行后续诊断(fuehreret al.j clin microbiol.2011,49(4),1628-1630；bu et al.analytical biochemistry375(2),370-372；zou et al(2017)nucleic acid purification from plants,animalsand microbes in under 30seconds,plos biol 15(11),e2003916)。然而，一个问题可能在于某些可用于样品制备的试剂可能会干扰下游技术如pcr扩增。

4、可以获取生物样品的一种方式涉及使用可以保留在采样装置内的多孔笔尖，该采样装置可以类似于例如笔。美国专利申请公开us2016/0349153中描述了一种此类装置，其描述了一种具有含有多孔笔尖形式的烧结多孔基质的外壳的装置，该多孔笔尖可以通过毛细管作用吸收液体样品。我们的国际专利申请pct/ep2021/057315中描述了不同的装置，该装置包括用于容纳缓冲液的储液器，用于冲洗笔尖上吸附的样品以进行后续处理和分析。

技术实现思路

0、发明概述

1、此处描述的是用于收集和处理生物样品，特别是但不限于用于dna和rna分析程序的目的的一次性装置。该装置为分子诊断测试提供足够的核酸。尽管本文主要结合核酸的分子诊断测试中的用途来描述该装置，但是应当理解，可以利用本发明来收集和/或处理其他生物分子，例如蛋白质、脂质、代谢物、维生素、药物、有机物、农药、小分子等；也可以是细胞碎片，如细胞膜或细胞外壳碎片、或亚细胞细胞器。我们已经确定，特定的笔尖配置允许样品从笔尖有效释放，而不需要通过施加压力来主动冲洗缓冲液体通过笔尖。

2、根据本发明的第一方面，提供了用于获得和任选地处理生物样品以供分析的装置，所述装置包括：

3、(a)中空吸头，包括第一和第二总体圆柱形部分，并在吸头的第一和第二端处具有第一和第二开口，其中第二部分和第二开口具有比第一部分和第一开口更小的直径，并且其中第一部分和第一开口配置为可拆卸地附接至采样仪器；和

4、(b)多孔笔尖，其第一端处具有暴露或可暴露的工作表面，用于获取生物样品，适合于吸收由此获取的生物样品物质的多孔结构，并且用于液体经过笔尖的流通；以及第二端处具有清洗表面，用于将清洗流体施加到笔尖；并且

5、其中第二部分和第二开口配置为可拆卸地容纳笔尖，并且其中多孔笔尖具有大于宽度的长度。

6、令人惊讶的是，我们发现，这种吸头和笔尖的配置不仅允许样品通过工作表面被吸收到多孔结构中，而且还允许清洗液施加到清洗表面，从而仅通过毛细管作用和重力从笔尖洗脱样品(例如用于后续处理或分析)。无需施加压力来主动推动清洗液通过笔尖来洗脱样品。此外，该装置的运行方式意味着样品生成气溶胶的风险降低了——其可能含有病原体。由于样品首先被吸收到笔尖中，然后通过毛细管作用和重力冲洗掉，因此不需要用力移液样品(该过程会生成气溶胶)。

7、注意，笔尖的长度和宽度可以由笔尖和吸头的结构来限定。一般而言，笔尖具有限定工作表面的第一端和限定清洗表面的第二端。在这些第一端和第二端之间延伸的轴线限定了笔尖的长度，而宽度垂直于该轴线。当笔尖总体是圆柱形时，宽度可以是圆柱形的直径；尽管在一些实施方案中，笔尖不需要具有恒定的宽度；这里最大宽度的部分小于长度。

8、当笔尖被容纳在第二部分和第二开口内时，笔尖的工作表面被暴露，并且清洗表面位于吸头内。优选地，清洗表面位于吸头内且与吸头的第一部分和第二部分之间的过渡部处于同一水平面上。也就是说，吸头以第一部分的形式在笔尖的清洗表面上方变宽。

9、笔尖上方的吸头高度允许清洗液的“头部”足以打破笔尖中保持的液体的表面张力，并允许材料在重力作用下流动。这可以使用清洗液中的粘度和表面张力调节剂来调节。优选地，吸头的第一部分的长度大于同一部分的直径；并且优选地也大于笔尖的长度。出乎意料的是，为了吸收样品所需的笔尖的毛细管作用预计会使笔尖饱和并保留样品，而不使用压力迫使清洗流体通过笔尖。然而，我们发现该结构允许几乎相同体积的液体滴过饱和材料，从浸入其中的样品材料中释放提取的核酸和蛋白质。释放的效率是出乎意料的。

10、空心吸头结构的使用允许吸头和笔尖附接到采样仪器上。方便地，这可以是移液器或类似的处理装置。例如，多吸头移液器和/或机器人移液器可用于快速处理和加工多个样品。替代性地，采样仪器可以简单地是与吸头接合以允许抓握和操纵的手柄。

11、在使用中，可以设想吸头和笔尖如下操作。用户将吸头和笔尖附接到移液器上。然后将笔尖放入患者的口中，并允许吸收唾液(其中包含用于测试的核酸)。然后，使用者将移液器保持在试管或样品板上，并将吸头从移液器中弹出，以便将吸头和笔尖释放到试管中。然后可以使用相同的移液器将清洗液添加到吸头内的笔尖的上表面。在重力和/或毛细管作用下，清洗液然后进入笔尖并将样品从笔尖的下表面洗脱到试管中。然后可以移除笔尖和吸头，并使用任何合适的程序分析洗脱的样品。在一些实施方案中，试管或样品板可以含有吸水构件或吸水纸，其将进而吸附任何洗脱的样品。在其他实施方案中，可以首先将唾液样品收集在试管或其他容器中。然后，吸头/笔尖组合可以从试管中收集唾液样品，其方式与直接从口腔中收集唾液样品的方式大致相同。在又一变型中，可将笔尖单独放置在具有唾液样品的试管中。然后笔尖将吸收唾液，然后用户可以将笔尖放置在位于移液器上的吸头内，并以类似的方式进行进一步处理。

12、本发明提供了获得和制备用于分析的样品的便利方法，特别是通过核酸扩增方法如pcr、rpa或lamp，但也潜在地通过其他分析方法如免疫检测。这至少部分地通过用于通过吸收液体或部分液体，或用于擦拭包含生物样品的表面的笔尖来收集样品来实现。

13、笔尖可以是总体上圆柱形的形式，但是可以使用任何合适的形状，只要笔尖长于其宽度即可。例如，总体上圆柱形的笔尖可以在工作表面和清洗表面中的任一个或两个处包括弯曲的或圆形的表面；或者，工作和/或清洗表面与笔尖主体之间形成的角度可以大于90度。这些配置可以在进行样品采集时提高患者的舒适度，并且还可以减少对毛细管保持的边缘效应，否则在精确地笔尖中可能会看到这种效应。在一种形式中，笔尖具有凿子形或倾斜凿子形工作表面，以便于在细点、细边缘或作为粗笔画采集样品。这对于从各种表面获取样品的法医学尤其有用。

14、笔尖可以通过干涉配合固定在吸头内；例如，可以在吸头的第二部分的内侧上形成一个或多个环形圈；因为这些会减小吸头的内径，并且由于笔尖是可压缩的，这将使笔尖在使用过程中保持在适当的位置。也可以将笔尖热熔或粘合到吸头上。

15、在一个实施方案中，可以在样品收集之前向笔尖提供液体以润湿笔尖。这可以促进从干燥样品表面收集样品(例如，从已触摸的区域进行法医收集；或从前鼻孔收集)。在优选实施方案中，笔尖可以是干燥的，用于收集液体样品如血液、唾液、尿液等。

16、适当地，提供至少一个可拆卸的帽以在使用之前和/或之后遮盖笔尖。一种此类盖子可以在使用前设置在笔尖上，并且在使用后可更换以保护在笔尖上获得的样品。

17、笔尖可设有水变色标记以指示所采集的水性样品的量。例如，标记可以设置在沿笔尖长度的特定点处，以便指示预定量的水性样品何时已被吸入笔尖中。替代性地，标记可以采用遍布笔尖的水敏染料的形式，其出现或消失与存在的水量成比例。

18、在一个实施方案中，多孔笔尖可以是烧结多孔笔尖。

19、多孔笔尖可以包括多孔塑料、多孔金属、多孔陶瓷和具有内部通道的纤维或挤压塑料或金属。在具体实施方案中，多孔塑料是烧结多孔塑料。塑料笔尖可由多种塑料如聚乙烯制成。可以使用的聚乙烯包括但不限于高密度聚乙烯(hdpe)、低密度聚乙烯(ldpe)和超高分子量聚乙烯(uhmwpe)。笔尖还可以由聚丙烯(pp)、聚偏二氟乙烯(pvdf)、聚酰胺、聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯腈(pan)、乙烯-乙酸乙烯酯(eva)、聚酯、聚碳酸酯或聚四氟乙烯(ptfe)制成。塑料笔尖还可以由多于一种上述塑料制成。在一个实施方案中，塑料笔尖由约30％pp和约70％pe(重量：重量％)制成。在其他实施方案中，当pp和pe组合时，pp可以以约100％至约0％的范围存在，并且pe可以以约0％至约100％的范围存在(100％至0％：0％至100％重量：重量％)。当pe与其他聚合物组合时，pe以至少约50％(重量％)存在。在一个实施方案中，塑料是hdpe。在其他实施方案中，塑料是uhmwpe、pp、聚酰胺或聚丙烯腈。其他合适的笔尖材料包括us2016/0349153中描述的那些。

20、如下文更详细描述的，笔尖可以包含用于处理在笔尖上获得的样品的活性剂，优选地，笔尖用所述活性剂功能化。活性剂优选地包含一种或多种具有裂解细胞(例如细菌)或病毒、释放其组分的能力的膜破坏剂。例如，可以收集裂解细胞的dna和/或rna用于进一步处理或分析；替代性地，可以收集脂质、蛋白质或肽、或亚细胞细胞器、或包括细胞膜或细胞壁碎片的细胞碎片。优选地，活性剂对人类无毒。一种优选的活性剂包括季铵化合物(qac)，并且更优选的活性剂是氯化十六烷基吡啶，尽管可以使用替代物(例如如表1中列举的，单独地或组合地使用)。在一些实施方案中，活性剂是冻干或干燥的形式，并且可以通过润湿笔尖来再水合活性剂；例如，当笔尖用于采集液体样品(如血液或唾液)时。活性剂的其他用途可以是捕获可能抑制分析过程的某些组分。

21、如本文更详细描述的，我们惊奇地发现某些活性剂不仅对人类无毒，而且能够以不干扰后续核酸扩增的浓度有效地从细胞和/或病毒中释放核酸。这种特征的组合使得这些活性剂特别适合于本文所述的采样和处理技术，而且还为这些活性剂在制备用于核酸分析的样品中更普遍用途开辟了道路。

22、在一个实施方案中，活性剂包含聚乙烯吡咯烷酮(pvp；聚维酮)。聚乙烯吡咯烷酮(pvp)以前曾用于提取缓冲液中，以帮助去除酚类化合物；其在dna纯化过程中特别擅长于吸收多酚。多酚在许多植物组织中很常见，如果不去除，会使蛋白质失活，从而抑制许多下游反应如pcr。在分子生物学中，pvp可作为denhardt缓冲液的成分在southern印迹分析中用作封闭剂。然而，我们已经确定pvp能够破裂病毒以释放核酸(和/或其他病毒组分)，而不抑制扩增；因此令人惊讶的是，我们发现pvp可以在本文所述的收集装置的笔尖中干燥。

23、在一个实施方案中，活性剂包含氯己定和/或柠檬醛。可以通过将该药剂干燥到多孔基质中来对笔尖进行功能化；例如，通过使氯己定溶液吸收到笔尖中，然后在使用前将其干燥。优选地，待干燥到笔尖上的溶液包含小于或等于5％、4％、3％、2.5％、2％、1.5％或1％的活性剂。当使用多种活性剂时，这可以是所有活性剂的总量。选择活性剂百分比，使得当笔尖再水化(来自样品、或者来自缓冲液或清洗液的添加)时，最终溶液含有小于或等于5％、4％、3％、2.5％、2％、1.5％或1％的活化剂。例如，这可以通过具有已知体积的笔尖来实现，该笔尖吸附已知体积的样品，并且可以用已知体积的缓冲液冲洗。在本发明的实施方案中，当液体样品被吸收到笔尖中时，发生样品的初始裂解；然后用缓冲液(例如tris缓冲液)从笔尖冲洗裂解的样品。这具有以下效果：裂解步骤中的活性剂浓度高于清洗后后续扩增中的活性剂浓度；从而允许优化裂解浓度，同时随后降低浓度以免干扰扩增。

24、在优选的实施方案中，活性剂包含pvp以及氯己定和柠檬醛之一或两者。虽然pvp对于从病毒中释放核酸特别有用，但氯己定和柠檬醛对细菌等微生物具有活性；这些活性剂的组合提供了广谱的核酸释放。在一个优选的实施方案中，活性剂包含0.9％pvp和0.1％氯己定或柠檬醛。由于氯己定和柠檬醛在较高浓度下均可干扰扩增，因此在该实施方案中，上述较高浓度下的初始裂解和清洗以降低浓度更为重要。

25、其他活性剂可以包括保护核酸免于降解的药剂。例如，烷基聚葡萄糖苷已被证明可以结合dna，并可以有助于保护收集的样品免受核酸酶活性的影响，并增加收集的样品的储存时间；在一个实施方案中，试剂进一步包含烷基多葡糖苷。peg并且特别是支链peg(支链、星形和梳状以及较小程度线性的peg)也已被证明可以通过聚乙二醇化过程稳定寡核苷酸。在一个实施方案中，除了膜破坏剂之外，笔尖还可以包括保护剂；例如，除了氯己定之外，还可以将1％的peg 6000干燥到笔尖中。这将允许自我收集和稳定所收集的样品，该样品随后在用于分配到测试设施中是生物安全的，而不会降解在使样品生物安全时释放的核酸。peg 6000还可以减少疏水蛋白与粘液/纤维的相互作用，并增强从笔尖的释放。

26、尽管本文主要描述了关于获得和使用测试样品来分析其特征性核酸含量，但是本发明还可以应用于免疫学(抗体/抗原)测试程序，或者实际上应用于收集和/或检测可以在存在合适检测试剂的生物样品中发现的其他分析物。例如，脂质、蛋白质、肽、亚细胞细胞器或片段、细胞膜或细胞壁片段等都可以在本发明的合适应用中被收集和处理。

27、本发明能够提供测试取样装置及其使用方法，其中该装置包括多孔基质以吸收限定体积的测试样品，并将样品暴露于已通过干燥过程预功能化到笔尖的活性成分。当样品芯吸到笔尖时，会重新水化这些组分。从那里，提取的核酸(或免疫诊断中的蛋白质、或脂质等)可以立即可用，或者可以在运输过程中干燥，以便随后通过缓冲液交换(通过将缓冲液通过笔尖传回)进行洗脱。

28、本发明的另一方面提供了pvp在制备用于扩增的核酸中的用途。优选地，该方面还包括氯己定和/或柠檬醛在制备用于扩增的核酸中的用途。

29、本发明的又一方面提供了制备和扩增核酸的方法，该方法包括：

30、将样品与包含pvp的裂解缓冲液混合，以从样品中的材料中释放核酸；

31、对样品进行核酸扩增过程。

32、优选地，核酸扩增过程是pcr。优选地，样品在pvp存在下经历核酸扩增过程。通过包含适当的试剂(例如，引物、dntp、酶等)，裂解缓冲液还可以用作核酸扩增混合物。这些试剂可以在初始步骤中存在于裂解缓冲液中，或者可以后续添加。

33、优选地，裂解缓冲液还包含氯己定和/或柠檬醛。

34、pvp可以以小于或等于5％、4％、3％、2.5％、2％、1.5％或1％存在于裂解缓冲液中。在一个优选的实施方案中，裂解缓冲液包含0.9％pvp和0.1％氯己定或柠檬醛。

35、本发明的又一方面提供了核酸扩增混合物，其包含pvp和用于进行核酸扩增过程的一种或多种另外的试剂。优选地，核酸扩增过程是pcr。优选地，另外的试剂选自引物、dntp和酶。扩增混合物还可以包含氯己定或柠檬醛；更优选0.9％pvp和0.1％氯己定或柠檬醛。

36、本发明的又一方面提供了用于收集生物样品的多孔笔尖，该多孔笔尖包含在其中干燥的pvp。笔尖还可以包含在其中干燥的氯己定或柠檬醛。