一种复合磁性固相萃取材料及其制备方法和在类固醇激素提取中的应用与流程

本发明属于生物检测，特别涉及一种复合磁性固相萃取材料及其制备方法和在类固醇激素提取中的应用。

背景技术：

1、类固醇激素又称甾体激素，是一类以环戊烷多氢菲结构为核心的脂溶性低分子化合物，它在调节新陈代谢、治疗相关炎症、维持水盐平衡、促进性征发育等方面都起着关键的作用。正因如此，其被广泛的应用于免疫调节、生育调控等领域，而这也导致了其容易流入环境，并随着食物链富集，对相关生物产生影响。测量生物样本中的类固醇激素是毒理学中内分泌相关研究的关键因素，因此，实现对样品中类固醇激素的提取富集至关重要。

2、类固醇激素在生物样品中通常以结合形式存在，因此，早期许多预处理方法采用样品水解法。近年来，酶水解法逐渐取代酸水解法，成为了样品水解法的主流，但其仍存在操作时间长，实验费用高等缺点。且生物样品通常较为复杂，采用水解法进行前处理，往往会引入其他未知的副产物，使得样品预处理过程复杂化。因此，为了实现快速高效提取生物样品中的类固醇激素，解决样品提取法所存在的问题，亟需一种更具优势的预处理方法。

3、选择磁性材料作为吸附剂以实现固相萃取提取血液中类固醇激素方法，具有样品体积需求量低，操作时间短，实验成本低廉等优点。因此在磁性材料的基础上加以改性，制备具有针对性的提取、富集类固醇激素的磁固相萃取材料，具有广泛的应用前景和实际意义。

技术实现思路

1、为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种复合磁性固相萃取材料的制备方法。

2、本发明的另一目的在于提供一种上述制备方法制备得到的复合磁性固相萃取材料。

3、本发明的另一目的在于提供一种上述复合磁性固相萃取材料在类固醇激素提取中的应用。

4、本发明的目的通过下述技术方案实现：

5、一种复合磁性固相萃取材料的制备方法，包括如下步骤：

6、(1)将tritonx-100溶解在环己烷中超声10～30min，得到a混合物；将油酸包裹的磁性纳米粒子(omnps)超声悬浮在环己烷中，得到b混合物；将a混合物和b混合物混合并振摇，滴加入氨水和四乙氧基硅烷(teos)，然后在室温下搅拌反应，所得纳米复合材料通过磁性倾析用乙醇和水彻底洗涤以去除表面活性剂和溶剂，得到二氧化硅包裹的磁性纳米粒子(smnps)；

7、(2)将二氧化硅包裹的磁性纳米粒子(smnps)分散在乙醇水溶液中，在氮气环境下滴加氨水，然后在搅拌下添加甲基丙烯酸3-三甲氧基甲硅烷基丙酯(mps)的乙醇溶液，在室温下搅拌反应，所得产物用磁铁收集，然后用水和乙醇洗涤数次，最后超声分散溶解在乙腈中，得到msmnps纳米粒子溶液；

8、(3)将偶氮二异丁腈加入到上述msmnps纳米粒子溶液中充分搅拌溶解，随后在氮气环境下加入二乙烯基苯(dvb)与n-乙烯基吡咯烷酮(nvp)并搅拌，加热至80℃反应12～48小时，所得产物经过磁分离，用丙酮和乙醇漂洗数次，在60℃下真空干燥12h，得到复合磁性固相萃取材料(amnps)；所述复合磁性固相萃取材料(amnps)贮存于纯水中得到复合磁性固相萃取材料悬浊液。

9、步骤(1)所述油酸包裹的磁性纳米粒子(omnps)按照以下方法制备得到：将摩尔比为1:1的六水合氯化铁和四水合氯化亚铁搅拌溶解于超纯水中，滴加溶有油酸的丙酮溶液；滴加完毕后以300～450rpm的转速搅拌混匀10～30min，接着向混合液中逐滴加入质量百分浓度为25％的氨水，加热至50～100℃进行反应1～5h，反应结束后冷却至室温，收集黑色磁性粒子，分别用乙醇和超纯水洗涤，然后真空干燥，得到油酸包裹的磁性纳米粒子(omnps)。

10、步骤(1)中所述a混合物与b混合物的体积比为10：1；所述tritonx-100和油酸包裹的磁性纳米粒子的质量比为1.26：1；所述氨水与四乙氧基硅烷的体积比为1：1；所述氨水的用量按照每1g油酸包裹的磁性纳米粒子使用250μl氨水；所述搅拌反应的时间为24～48h；所述氨水的浓度为质量分数25％；所述的搅拌速度为300～600rpm。

11、步骤(2)中所述乙醇水溶液的组成为体积比3：1的乙醇和水混合液；所述甲基丙烯酸3-三甲氧基甲硅烷基丙酯(mps)的乙醇溶液是由体积比4：5的甲基丙烯酸3-三甲氧基甲硅烷基丙酯(mps)和乙醇组成；所述甲基丙烯酸3-三甲氧基甲硅烷基丙酯与氨水的体积比为2：1；所述甲基丙烯酸3-三甲氧基甲硅烷基丙酯(mps)与二氧化硅包裹的磁性纳米粒子(smnps)的用量关系为：4ml甲基丙烯酸3-三甲氧基甲硅烷基丙酯对应1mg二氧化硅包裹的磁性纳米粒子(smnps)；所述氨水的浓度为质量分数25％；所述msmnps纳米粒子溶液的浓度为每100ml乙腈中含有1g msmnps纳米粒子；所述搅拌均为采用300～600rpm的搅拌速度。

12、步骤(3)所述二乙烯基苯与n-乙烯基吡咯烷酮的质量比为1:1～1:2，优选为0.78：1；所述的偶氮二异丁腈与二乙烯基苯的质量比为1：15.6；所述偶氮二异丁腈的用量按照每200ml msmnps纳米粒子溶液使用0.1g偶氮二异丁腈；所述的搅拌速度为300～600rpm。

13、一种由上述的制备方法制备得到的复合磁性固相萃取材料。

14、上述的复合磁性固相萃取材料在类固醇激素的富集、浓缩和/或检测中的应用，所述类固醇激素为化学结构中含有羟基、羧基的类固醇激素。

15、所述类固醇激素优选为美雄醇、可的松和勃地酮中的至少一种。

16、一种利用上述的复合磁性固相萃取材料富集、浓缩和检测类固醇激素的方法，包括如下步骤：

17、(a)样品预处理：向待测离体血液加入预处理制剂，预处理制剂和待测离体血液的体积比为1～4：1，在0～20℃低温条件下以5000～10000rpm转速高速离心分离，将上清液分离收集，得到预处理全血；

18、(b)萃取：取预处理全血加入复合磁性固相萃取材料悬浊液中，以1000～2500rpm震荡混匀3～20min以富集浓缩目标物，再利用磁吸附将复合磁性固相萃取材料取出，用纯水润洗数次，晾干；

19、(c)洗脱：用甲醇对步骤(b)晾干后的复合磁性固相萃取材料进行洗脱、过滤，得到含有类固醇激素的洗脱液。

20、步骤(a)中所述的预处理制剂为等同体积的无水甲醇与0.1mol/l的硫酸锌溶液混合而成的甲醇-硫酸锌溶液；所述预处理制剂和待测离体血液的体积比为2：1；所述的低温条件为5℃；所述的离心分离的转速为9000rpm；

21、步骤(b)中所述的预处理全血和复合磁性固相萃取材料悬浊液的用量为10ml复合磁性固相萃取材料悬浊液添加200μl预处理全血；所述震荡的转速为1500rpm；所述震荡的时间为10min；

22、步骤(c)中所述的甲醇和复合磁性固相萃取材料的用量为每1ml甲醇洗脱100mg复合磁性固相萃取材料；所述洗脱的次数为两次。

23、本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：

24、1、本发明制备了一种复合磁性固相萃取材料，该方法制备得到的磁固相萃取材料由二氧化硅包覆的磁核(fe3o4)和复合hlb吸附层(n-乙烯基吡咯烷酮与二乙烯基苯聚合物)两部分构成；该材料在保证满足磁吸附分离使用要求的前提下，适当牺牲材料的磁饱和强度，构架多层复合结构，进一步提升了材料的稳定性。

25、本发明在制备过程中，通过二氧化硅包裹与mps接枝改性，增加磁核表面碳碳双键反应位点，巩固了hlb聚合物层与磁核的连接，良好的实现了无机与有机材料的结合，避免提取过程中洗涤造成的吸附层脱落，同时二氧化硅的包裹也减缓了磁核的氧化，进一步提高材料稳定性；本发明材料多层的复合结构，赋予了材料更大的比表面积，增加了材料的表面吸附位点，进而实现应用于复杂生物基质，低样品量、低浓度类固醇激素的富集萃取。

26、2、本发明复合磁性固相萃取材料制备流程简单，对类固醇激素具有优异的富集提取效果。本发明所提出的萃取操作简便，所需材料简单易得，前处理流程便捷，能实现小体积生物样品的快速提取富集；前处理方案不引入额外的干扰物，避免了传统生物样品提取方法的弊端。且该材料体现了较好的稳定性，在多次重复使用下依然具有较高的回收率，具有良好的经济效益，绿色环保。