一种用于捕获外泌体的异质性复合材料及其制备方法和应用

本发明属于生物学检测，具体涉及一种用于捕获外泌体的异质性复合材料及其制备方法，以及采用该异质性复合材料特异性富集外泌体和检测外泌体代谢物的方法及其在疾病筛查诊断中的应用，具体涉及新型磁性氧化过渡金属碳化物材料的合成方法，使用磁性氧化过渡金属碳化物材料连续对外泌体进行捕获和代谢物质谱分析的方法，以及筛选潜在的膀胱癌外泌体代谢标志物的方法。

背景技术：

1、外泌体是一类直径为30-150nm，具有磷脂双层膜结构的细胞外囊泡，它们可以被各种细胞分泌并释放到各种体液中，如尿液、血液、泪液等。外泌体中含有各种类型的生物分子，包括蛋白质、核酸、脂质和代谢物，它们可以打破正常细胞与细胞外环境之间的动态平衡，并介导癌细胞与周围正常细胞之间的通讯。因此，外泌体是液体活检的理想对象，近年来，基于外泌体的液体活检在癌症早期诊断、监测和预后方面的优异表现已引起了广泛关注。当前，研究者们认为外泌体中的蛋白质和微小核糖核酸是有前景的生物标志物，迄今为止，开发利用外泌体代谢物作为生物标志物的相关报道很少。然而，代谢物是基于转录和翻译的生化反应网络的下游产物，可以提供比基因组和蛋白质组更接近表型的终端信息在直接反映个体的生理病理状态方面具有巨大潜力。因此，有必要开发外泌体代谢物的检测和分析方法，为基于外泌体的液体活检提供崭新视角。

2、预分离是通过外泌体实施液体活检的先决条件。传统的外泌体分离方法主要包括超速离心、尺寸排阻和沉淀。然而，这些方法耗时、成本高，并且得到产物的纯度有限，限制了其广泛应用。色谱串联质谱是外泌体代谢物分析的最成熟技术，但其高成本和劳动密集型的预处理步骤，包括淬灭、裂解、代谢物提取、浓缩和重溶，阻碍了其在临床疾病检测中的广泛应用。近年来，纳米科学的进步为外泌体分离和外泌体代谢物分析提供了新的解决方案。基于纳米结构的吸附剂凭借高表面积、强修饰性、丰富的结合位点以及协同亲和效应，可实现外泌体高效分离。纳米结构辅助激光解吸电离质谱利用含纳米结构基质的物理特性，如光热转换、光电效应和表面等离子体共振等，可促进代谢物的解吸和电离过程，并通过特定结构实现目标物的选择性吸附。与传统的质谱技术相比，纳米结构辅助激光解吸电离质谱提供更简单的操作、更快的分析速度、更高的通量和增强的抗干扰能力，同时确保了低背景干扰、高灵敏度和可重复性，已被广泛应用于各种临床场景，协助医疗决策的进行。

3、膀胱癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤，具有发病率高、突变率高、复发率高等特点。2020年，全球新诊断膀胱癌病例573278例，死亡212536例。根据膀胱肌肉浸润的组织病理学结果，膀胱癌可分为非肌肉浸润性膀胱癌和肌肉浸润性膀胱癌。这两种膀胱癌亚型表现出不同的分子驱动因素、临床结果和治疗方法。目前，膀胱镜检查和尿液细胞学检查是检测膀胱癌的金标准。实际上，在疑似人群中通过侵入性膀胱镜检查确诊的膀胱癌病例不足30％。此外，非肌肉浸润性膀胱癌的高复发率需要频繁的膀胱镜检查，监测尿液中稀有脱落肿瘤细胞的灵敏度低，这导致膀胱癌筛查和临床管理的费用较高。据报道，早期膀胱癌、肌肉浸润性膀胱癌和转移性膀胱癌患者的五年生存率分别为94％、50％和20％。在上述情况下，无创的液体活检具有作为膀胱癌检测工具的巨大潜力。然而，由于疾病进展过程中的高突变异质性，目前尚未确定可广泛应用于膀胱癌液体活检的具有优异性能的生物标志物。因此，迫切需要开发先进的膀胱癌筛查、早期诊断和治疗监测技术，为其精准医疗提供全面指导。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于捕获外泌体的异质性复合材料及其制备方法，以及采用该异质性复合材料特异性富集外泌体和检测外泌体代谢物的方法及其在疾病筛查诊断中的应用。

2、为实现上述目的，本发明所采取的解决方案如下：

3、第一个方面，本发明提供一种用于捕获外泌体的异质性复合材料，其特征在于，为在具有二维层状结构的被氧化的过渡金属碳化物材料的表面负载修饰有氨基的四氧化三铁的异质性复合材料。

4、优选地，所述具有二维层状结构的经氧化的过渡金属碳化物材料包括具有二维层状结构的经氧化的ti3c2、ti2c和ti4c3中的一种或几种。

5、优选地，所述具有二维层状结构的经氧化的过渡金属碳化物材料为具有二维层状结构的二氧化钛材料。

6、优选地，所述具有二维层状结构的经氧化的过渡金属碳化物材料的制备方法包括如下步骤：用氢氟酸(hf)将钛碳化铝(ti3alc2)中的al剥离形成具有二维层状结构的钛碳化物，然后经高温氧化得到。

7、第二个方面，本发明还提供一种如上所述的用于捕获外泌体的异质性复合材料的制备方法，包括如下步骤：

8、步骤(1)，具有二维层状结构的经氧化的过渡金属碳化物材料的制备：用氢氟酸(hf)将钛碳化铝(ti3alc2)中的al剥离形成具有二维层状结构的钛碳化物，然后经高温氧化，得到所述的具有二维层状结构的二氧化钛材料；

9、步骤(2)，采用溶剂热法合成获得如上所述的异质性复合材料。

10、优选地，步骤(1)包括如下步骤：

11、步骤(1.1)、将钛碳化铝(ti3alc2)缓慢加入到50％氢氟酸(hf)溶液中，于室温下搅拌16-24小时，用去离子水通过离心反复洗涤所得固体，直至上清液ph值大于6，将产物于50℃下真空干燥；

12、步骤(1.2)、将步骤(1.1)所得产物加入去离子水中，得到的悬浮液于120-200℃下反应16-24h，然后用去离子水通过离心洗涤，所得固体置于50℃下真空干燥；

13、步骤(1.3)、将步骤(1.2)所得产物在空气氛围中于200-500℃下煅烧2-3h，升温速率为2-5℃/min，将所得固体置于4℃下保存。

14、优选地，所述钛碳化铝(ti3alc2)和50％氢氟酸(hf)溶液的质量体积比为1：(10～40)g/ml，优选地为1：25g/ml。

15、优选地，步骤(2)包括如下步骤：将步骤(1)得到的产物放入乙二醇中形成悬浮液，将六水合三氯化铁、无水乙酸钠和亲水性胺类化合物加入到上述悬浮液中，搅拌至固体完全溶解，然后在200-300℃下反应6-12h，最后在外加磁场作用下用去离子水洗涤所得固体，于50℃下真空干燥后，置于4℃下保存。

16、优选地，所述亲水性胺类化合物选自1，2-丙二胺、1，3-丁二胺、1，2-丁二胺、1，3-戊二胺、1，4-戊二胺、4-甲基-1，3-戊二胺、2-甲基-1，3-戊二胺、2-甲基-1，4-戊二胺、3-甲基-1，4-戊二胺，2，4-戊二胺、2，5-戊二胺、2，4-己二胺、1，3-己二胺、1，4-己二胺、1，5-己二胺、5-甲基-1，3-己二胺、4-甲基-1，3-己二胺、3-甲基-1，3-己二胺、2-甲基-1，3-己二胺、2-甲基-1，4-己二胺、3-甲基-1，4-己二胺、5-甲基-1，4-己二胺、2-甲基-1，5-己二胺、3-甲基-1，5-己二胺、4-甲基-1，5-己二胺、1，3-庚二胺、1，4-庚二胺、1，5-庚二胺、1，3-辛二胺、1，4-辛二胺和1，5-辛二胺中的一种或几种；优选地，所述亲水性胺类化合物选自2，4-己二胺、1，3-己二胺、1，4-己二胺、1，5-己二胺、5-甲基-1，3-己二胺、4-甲基-1，3-己二胺、3-甲基-1，3-己二胺、2-甲基-1，3-己二胺、2-甲基-1，4-己二胺、3-甲基-1，4-己二胺、5-甲基-1，4-己二胺、2-甲基-1，5-己二胺、3-甲基-1，5-己二胺和4-甲基-1，5-己二胺中的一种或几种。

17、优选地，所述亲水性胺类化合物选自聚丙烯酰胺、聚酰胺、聚酰亚胺、聚醚酰亚胺和聚酞胺中的一种或几种；优选地，所述亲水性胺类化合物为聚醚酰亚胺。

18、优选地，所述步骤(2)获得的负载修饰有氨基的四氧化三铁的二维异质性复合材料中各原子所占的百分比为：c 9.99％，o 65.78％，ti 17.89％，fe 4.90％，n 1.43％。

19、第三个方面，本发明还提供一种如上所述的用于捕获外泌体的磁性复合材料和如上所述的制备方法制备的用于捕获外泌体的磁性复合材料在分离和检测外泌体中的应用。

20、第四个方面，本发明还提供一种筛查癌症外泌体代谢物标志物的方法，包括如下步骤：

21、步骤(一)、用如上所述的用于捕获外泌体的异质性复合材料和如上所述的制备方法制备的用于捕获外泌体的异质性复合材料捕获外泌体：取所述的异质性复合材料加入到目标样品中，室温孵育，用磷酸缓冲盐溶液洗涤，加去离子水，得到捕获外泌体的异质性复合材料悬浮液；

22、步骤(二)、将步骤(一)获得的捕获外泌体的异质性复合材料悬浮液滴加到靶板上，待其自然干燥后进行激光解吸电离质谱分析，得到外泌体的质谱谱图；

23、步骤(三)、将步骤(二)所得的外泌体质谱谱图导入正交偏最小二乘判别分析模型中，筛选外泌体代谢标志物。

24、优选地，步骤(二)中激光解吸电离质谱分析的具体条件为：使用brukerultraflextreme maldi-tof/tof质谱仪，采用355nm nd:yag激光光源，激光频率为2000hz，加速电压为20kv；采集模式为阳离子反射器模式，采集质荷比范围为100-1000da；从flexcontrol 3.4获得外泌体质谱谱图数据，并在flexanalysis 3.4中导出数据。

25、优选地，步骤(三)中筛选外泌体代谢标志物的条件为：变量重要性投影值大于1、p值小于0.05、p(cov,x-axis)的绝对值大于0.05、p(corr,y-axis)的绝对值大于0.5。

26、优选地，步骤(一)中目标样品为尿液。

27、第五个方面，本发明还提供一种膀胱癌的外泌体代谢标志物，通过如上所述的一种筛查癌症外泌体代谢物标志物的方法获得，获得的膀胱癌的外泌体代谢标志物为乙醇胺、l-天冬氨酸、l-乙酰肉碱、前列腺素e2、5,6-二羟基前列腺素f1a。

28、第六个方面，本发明还提供一种用于分离外泌体的试剂盒，包括如上所述的用于捕获外泌体的磁性复合材料和如上所述的制备方法制备的用于捕获外泌体的磁性复合材料。

29、现有技术相比，本发明的有益效果在于：

30、(1)本发明提出的异质性复合材料，含有二氧化钛和氨基修饰的四氧化三铁两个组分，可通过钛-氧簇和铁-氧簇与外泌体膜上的磷脂发生螯合，通过质子化氨基与带负电荷的外泌体结合，且材料具有良好的磁响应性，因此本发明方法可以简捷、高效地实现外泌体的特异性富集分离。

31、(2)本发明的异质性复合材料为二维层状堆叠结构，决定了其在光热转换和离子转移方面的高效率，二氧化钛和四氧化三铁组分的熔点高且热导率低，能大幅减少激光解吸电离质谱分析中的背景干扰，并实现代谢物的有效热解吸。材料的表面粗糙，紫外吸收能力强，电子-空穴分离效率高，可实现复杂生物流体中小分子代谢物的选择性吸附，高效地将质谱离子源激光能量转移到代谢物上，促进代谢物的电离，因此本发明可以实现外泌体代谢物的有效质谱检测。

32、(3)本发明通过机器学习模型可以分析外泌体代谢物在健康对照和膀胱癌患者之间的表达差异，进而筛选外泌体代谢标志物，实现膀胱癌的准确判别。

33、(4)本发明制备的异质性复合材料具有良好的磁响应性、优异的紫外吸收能力和电子-空穴分离效率，可成功用于对健康对照和膀胱癌患者尿液外泌体的连续捕获和代谢物质谱分析，并筛选出5个外泌体代谢物作为潜在的膀胱癌生物标志物，成功实现了膀胱癌患者的准确判别，这表明其在膀胱癌的大规模人群筛查、早期诊断和预后监测方面具有巨大应用前景。