一种用于皮革制文物微量胶原蛋白富集的吸附材料及其制备方法和应用与流程

本发明涉及古代文物蛋白检测，尤其涉及一种用于皮革制文物微量胶原蛋白富集的吸附材料及其制备方法和应用。

背景技术：

1、皮质文物是世界文明发展不可或缺的见证实物，研究皮质文物的物种来源对分析古代皮革起源有重要意义，对探寻古代生产生活活动有重要价值。由于皮革是天然高分子材料，主要由胶原蛋白、水分以及加工时使用的鞣剂、脂质组成。受埋藏条件影响，出土皮革文物往往难以维持最初的形态，干燥皮革表面硬化发黑，干裂发脆，饱水皮革糟朽腐烂，失水变形，这些珍贵的皮质文物发生了十分严重的劣化现象，从内部结构到外观形貌都产生了巨大改变，有些遗址中仅出现了皮革制文物的印迹或矿物物。这些已经劣化降解严重的皮质文物及残留物对鉴定其物种来源带来困难，一些常规检测分析方法如表面分析、光谱分析、波谱分析、色谱分析、热分析等难以进行物种鉴别，或者鉴定结果不够准确，一些新兴的鉴别手段如dna技术从中提取短线粒体十分困难，存在一定局限性。同时，皮质文物稀少且珍贵，许多考古发掘的皮质文物仅以微量甚至痕量存留，因此迫切需要一种取样量达到微克甚至更低的取样提取纯化方法，对皮质文物进行物种来源的鉴别。

2、质谱分析检测具有灵敏度高，特异性强的特点，能更加精准有效地对蛋白质进行检测鉴别，在古代皮质文物物种来源鉴别上十分具有优势，检测过程分为三部分：蛋白质组的提取和纯化、生物质谱检测、蛋白数据库对比，其中蛋白质组的提取与纯化是质谱分析流程中最为关键的一步。目前常用的皮革蛋白质的提取方法主要包括酸提取法、碱提取法、盐提取法、酶提取法及联合提取法，但这些提取方法主要用于工业中皮革废料再利用及明胶生产，提取过程中皮革用量较大，不适用于珍贵文物上进行微量取样检测，尤其是对极低丰度蛋白质的检测仍具有挑战性。尤其对于微量甚至痕量的皮质文物及残留物，需要有效手段进行胶原蛋白的提取和纯化，使用最少的样品量获得胶原蛋白的序列和氨基酸序列，实现对皮革制文物及残留物的物种鉴别。

技术实现思路

1、为了解决皮革制文物中的微量胶原蛋白不易检测的技术问题，本发明提供了一种用于皮革制文物微量胶原蛋白富集的吸附材料及其制备方法和应用。该吸附材料对胶原蛋白分子、肽段和氨基酸具有较好的吸附富集效果，能够实现皮革制文物微量胶原蛋白的富集纯化，有助于对皮革制文物中胶原蛋白进行检测分析，从分子水平上对古代皮质文物进行物种鉴定。

2、本发明的具体技术方案为：

3、第一方面，本发明提供了一种用于皮革制文物微量胶原蛋白富集的吸附材料，所述吸附材料为由电气石、还原氧化石墨烯和fe3o4磁性纳米微球构成的复合材料，所述fe3o4磁性纳米微球表面包覆有壳聚糖。

4、在本发明的吸附材料中，还原氧化石墨烯利用其单片纳米柱结构，能对完整胶原蛋白分子、肽段等大分子和氨基酸小分子进行等度和梯度分离；电气石具有良好的热电释放性能，在一定温度下可释放正负电荷，从而吸附带电荷的游离胶原蛋白分子、肽段、氨基酸分子。相较于单一使用还原氧化石墨烯或电气石而言，二者结合后，通过石墨烯的空间结构吸附作用叠加电气石的电荷吸附作用，能将处于还原氧化石墨烯附近但还未进入其结构空间的多肽小分子，通过电气石正负电荷的吸附，让这些小分子能逐渐靠近，并进入还原氧化石墨烯结构空间中，尽可能将溶液中游离的小分子多肽和氨基酸吸附和富集，达到可以进行蛋白质组学检测分析的条件。对于珍贵的文物而言，样品量越少越好，本发明的吸附材料对于胶原蛋白的微量提取具有重要意义。

5、由于石墨烯和四氧化三铁无法直接组装，因此反应过程中先使用氧化石墨烯完成与四氧化三铁的组装。同时，氧化石墨烯表面比石墨烯多出很多亲水基团，一能在水中更好地分散，二是表面带负电(能与fe3o4-cs完成静电组装)。反应结束，再将氧化石墨烯还原成石墨烯。由于氧化石墨烯亲水性较好，在富集蛋白后，使用磁铁分离过程速度较慢，氧化石墨烯的亲水性影响其从水溶液中分离，氧化石墨烯性质也不如石墨烯性质稳定，影响材料的重复使用，所以需要先采用氧化石墨烯进行磁性组装，然后对其进行还原反应，发挥石墨烯的优良吸附性能。总之，两者(氧化石墨烯和石墨烯)都有很好的吸附性能，但因为石墨烯无法直接与四氧化三铁组成复合材料，所以先选用氧化石墨烯用在合成过程中以提供方便，最后为了材料的稳定性和更好地磁分离作用，还是要把氧化石墨烯还原为石墨烯。

6、fe3o4磁性纳米微球能够赋予吸附材料磁响应性能，在吸附和富集胶原蛋白后，利用外部磁铁即可将吸附材料从胶原蛋白提取液中分离出来。通过在fe3o4磁性纳米微球包覆一层壳聚糖，能够利用壳聚糖所带有的正电荷，通过静电吸引力与电气石、还原氧化石墨烯结合，从而将电气石、还原氧化石墨烯和fe3o4磁性纳米微球复合到一起，并避免内核fe3o4晶体结构在复合过程中发生改变而影响其磁性。

7、在应用时，本发明的吸附材料可以快速分散在胶原蛋白提取液中，并吸附低浓度溶液中的胶原蛋白(包括蛋白分子、肽段、氨基酸)，能够实现皮革制文物中微量胶原蛋白的富集纯化，实现从低浓度提取液中提取到高丰度肽段及蛋白，达到富集纯化胶原蛋白、除去干扰信号的目的，取样量可以少至微克，便于后续胶原蛋白的检测分析(包括定性、定量检测，以及蛋白质序列和氨基酸序列检测)，有助于从分子水平上对古代皮质文物进行物种鉴定。

8、第二方面，本发明提供了一种所述吸附材料的制备方法，包括以下步骤：

9、(a)将fe3o4磁性纳米微球分散到壳聚糖溶液中，加入京尼平，在55～65℃下进行包覆，制成fe3o4@cs微球；

10、(b)将氧化石墨烯和磁化电气石粉分散到溶剂中，加入缩合剂和活化剂，混匀后，加入fe3o4@cs微球，进行交联反应和静电组装，分离出产物，制得fe3o4@cs/(go&mto)粉末；(c)将fe3o4@cs/(go&mto)粉末中的氧化石墨烯还原成还原氧化石墨烯，制得吸附材料。

11、在上述制备过程中，“fe3o4@cs微球”即由fe3o4磁性纳米微球及其外包覆的壳聚糖构成的微球；“fe3o4@cs/(go&mto)粉末”即由fe3o4@cs微球、氧化石墨烯和磁化电气石构成的复合粉末。

12、步骤(a)中，在55～65℃下，壳聚糖中的氨基与京尼平中的酯基反应，将京尼平接枝到壳聚糖上；步骤(b)中，利用壳聚糖上的氨基，能够通过静电吸引力结合氧化石墨烯和磁化电气石，从而使氧化石墨烯、磁化电气石和fe3o4@cs结合到一起，并且，电气石在磁化后可以与，同时，在缩合剂和活化剂的作用下，京尼平中的羟基与壳聚糖中的羧基结合，从而利用京尼平在壳聚糖分子之间形成交联，使多个fe3o4磁性纳米微球结合到一起。通过上述方式，能够实现吸附材料的自组装，且内核fe3o4晶体结构在上述交联反应和自组装过程中不会发生改变，能保持较好的磁性。

13、作为优选，步骤(a)中，所述fe3o4磁性纳米微球的粒径为100～600nm，所述壳聚糖的粘度＜200mpa.s。

14、当fe3o4磁性纳米微球的粒径小于100nm时，容易在溶液中团聚，无法有效与氧化石墨烯组装；当fe3o4磁性纳米微球的粒径大于600nm时，fe3o4磁性纳米微球在氧化石墨烯和磁化电气石粉外部的分布较少，通过交联反应和静电组装形成的fe3o4@cs/(go&mto)粒径较大，进而造成制得的吸附材料粒径较大，对胶原蛋白的吸附量降低，富集效果相对较差。

15、当壳聚糖的粘度高于200mpa.s时，配制出的壳聚糖溶液易出现流动性较差，fe3o4磁性纳米微球不易分散，会造成后续进行fe3o4@cs微球与氧化石墨烯及磁化电气石粉的结合时，结合率下降，导致获得的吸附材料对胶原蛋白的富集效果相对较差。

16、作为优选，步骤(b)中，所述磁化电气石粉的粒度＞10000目。

17、当磁化电气石粉的粒度小于10000目时，在溶液中对周围fe3o4@cs微球的磁性吸附过大，会影响氧化石墨烯与fe3o4@cs微球的结合，造成吸附材料对胶原蛋白的富集效果相对较差。

18、作为优选，步骤(b)中，所述交联反应和静电组装为在20～30℃下震荡反应10～14h。

19、作为优选，步骤(a)中，所述fe3o4磁性纳米微球与壳聚糖的质量比为1:1.5～5；步骤(b)中，所述氧化石墨烯、磁化电气石粉和fe3o4@cs微球的质量比为1:0.5～2:2.5～10。

20、作为优选，步骤(b)中，所述磁化电气石粉的制备方法包括以下步骤：将电气石粉置于磁化器中进行不少于48h的磁化，得到磁化电气石粉。

21、作为优选，步骤(b)中，所述缩合剂为1-乙基-3-二甲基氨基丙基碳二亚氨盐酸盐，活化剂为n-羟基琥珀酰亚胺；所述fe3o4@cs微球、缩合剂和活化剂的质量比为1:0.15～0.5:0.075～0.3。

22、作为优选，步骤(a)中，所述包覆的方法为在55～65℃下搅拌至混合物呈干粉状态。

23、作为优选，步骤(c)的具体过程包括以下步骤：将fe3o4@cs/(go&mto)粉末分散到抗坏血酸溶液中，在20～30℃下震荡反应18～28h，分离出产物，制得吸附材料。

24、进一步地，步骤(c)中，所述fe3o4@cs/(go&mto)粉末与抗坏血酸的质量比为1:1～4。

25、第三方面，本发明提供了所述吸附材料在皮革制文物微量胶原蛋白富集中的应用。

26、作为优选，所述应用包括以下步骤：

27、(1)对含有微量胶原蛋白的皮革制文物待测样品进行胶原蛋白提取，获得胶原蛋白提取液；

28、(2)将吸附材料分散到胶原蛋白提取液中，在40～60℃下充分振动混合2～3h，进行磁性分离后，洗去杂质和盐，获得吸附有胶原蛋白的吸附材料；

29、(3)对吸附有胶原蛋白的吸附材料进行洗脱，而后进行磁性分离，获得富集纯化后的胶原蛋白溶液。

30、通过上述步骤，可实现皮革制文物中微量胶原蛋白的提取和富集纯化，获得的富集纯化后的胶原蛋白溶液可进行胶原蛋白的定性或定量检测，或者胶原蛋白的蛋白质序列和氨基酸序列检测。

31、作为优选，步骤(3)中，所述洗脱的过程中，采用的洗脱液是体积比为80～100:0.1～0.2:100的乙腈、三氟乙酸和去离子水的混合液。

32、吸附材料作为一种固体物，会对后续的检测分析(如质谱分析)产生影响，因而需要将胶原蛋白从吸附材料上洗脱下来，获得的胶原蛋白溶液后再进行检测分析。本发明团队经理论分析和实验后发现，采用体积比为80～100:0.1～0.2:100的乙腈、三氟乙酸和去离子水的混合液作为洗脱液，能够较好地将胶原蛋白从吸附材料上洗脱下来；当洗脱液中乙腈的含量过低时，洗脱效果会下降；当洗脱液中三氟乙酸的含量过高时，其与胶原蛋白中的氨基结合，会影响蛋白质的活性，进而影响后续胶原蛋白的检测分析。

33、作为优选，步骤(2)中，所述吸附材料与胶原蛋白提取液的质量体积比为1mg:25～100μl。

34、当吸附材料在胶原蛋白提取液中的添加量较小时，会对胶原蛋白富集效果产生不良影响；而当添加量较大时，吸附材料易发生团聚，同样会不利于胶原蛋白的富集。

35、作为优选，步骤(2)中，在将吸附材料分散到胶原蛋白提取液中之前，对吸附材料进行洗涤和平衡，具体过程包括以下步骤：采用ph值稳定在7.2～7.6之间的pbs缓冲液将吸附材料洗涤1～3次后，将洗涤后的吸附材料置于ph值稳定在7.2～7.6之间的pbs缓冲液中平衡不少于10min，而后分离出吸附材料，弃去溶液。

36、在提取过程中，胶原蛋白分子及肽段等小分子的结构需要保存稳定，所以需要pbs缓冲液先对吸附材料进行ph平衡，然后待吸附胶原蛋白分子及肽段等小分子后，再次使用pbs缓冲液进行洗涤，保持胶原蛋白分子及肽段等小分子的结构稳定性，同时去除杂质和盐。

37、进一步地，所述ph值稳定在7.2～7.6之间的pbs缓冲液以总体积1l计，包括以下组分：0.2～0.3g磷酸二氢钾，1.4～1.5g磷酸氢二钠，8.1～8.5g氯化钠，0.2～0.3g氯化钾，余量为水。

38、作为优选，步骤(1)的具体过程包括以下步骤：将含有微量胶原蛋白的皮革制文物待测样品与tris-hcl/cacl2提取液混合后，在75～85℃下反应1.5～2.5h，而后进行固液分离，分离出的固体与胰蛋白酶溶液混合，在35～40℃下酶解18～36h，进行固液分离后，将分离出的固体与酶抑制剂溶液混合以终止酶解反应，而后进行固液分离，获得胶原蛋白提取液。

39、在上述过程中，先通过待测样品与tris-hcl/cacl2提取液反应，使胶原蛋白变性明胶化，而后利用胰蛋白酶进行酶解，可在较大程度上提取出待测样品中的胶原蛋白，获得的胶原蛋白提取液中含有胶原蛋白的蛋白分子、肽段和氨基酸。

40、作为优选，步骤(1)中，所述皮革制文物待测样品为皮革制文物中的胶原纤维。

41、与现有技术相比，本发明具有以下优点：

42、(1)本发明的吸附材料对分散在溶液中的微量胶原蛋白分子、肽段及氨基酸能有效吸附富集，尤其是高丰度的肽段及蛋白，能达到纯化蛋白、除去干扰信号的目的，对于低浓度的蛋白质溶液更显优势，在实际应用中，能够使皮革制文物或残留物的取样量降至微克级别，大大降低了对珍贵文物取样量要求。

43、(2)本发明的吸附材料中，内核fe3o4晶体结构在合成过程中未发生改变，性质稳定，使吸附材料，具有良好的磁响应性能，可在外部磁场作用下从溶液中快速分离。

44、(3)本发明在制备吸附材料的过程中，通过控制fe3o4磁性纳米微球的粒径、壳聚糖溶液的粘度以及磁化电气石粉的粒度，能够进一步提高吸附材料对皮革制文物中微量胶原蛋白的富集效果。

45、(4)利用本发明的吸附材料进行胶原蛋白富集后，用于质谱分析时，肽段定量pep.quantity显著升高，完全可以用于皮革制文物的材质种属鉴定，分子鉴定依据的蛋白序列和肽段序列均无遗漏。