一种具有体积排阻作用的磁性亲和吸附剂的合成方法

本发明属于功能化纳米材料，具体涉及具有体积排阻作用的磁性亲和吸附剂的合成方法。

背景技术：

1、生物样品的分析中往往涉及需要到从组织、体液等生物样品中选择性提取特定物质。这些复杂的生物基质即使可以经过初步研磨离心除去大块的组织和细胞，所得上清液体中仍然存在大量难以离心除去的囊泡、细胞碎片等物质，给后续提取和分析操作带来极大的干扰。除此之外，生物样品中具有重要分析提取意义的往往是如抗体、酶、细胞因子、核酸等生理活性物质，这一类物质的提取必须依靠特定的亲和配基来实现，而传统的基于疏水/亲水/离子交换等作用的固相萃取难以实现对生物样品中特定生理活性物质的有效提取。

2、为了解决生物样品分析中现存的问题，近年来，基于亲和配基的磁性限进介质固相萃技术被广泛应用于生物样品的前处理中。该技术基于经典磁性固相萃取的方法原理，使用具有多孔结构的磁性材料作为吸附剂，并在吸附剂表面固定与待提取目标物具有相互作用的特定亲和配基，从而实现在复杂样品基质中选择性提取目标物，同时基质中尺寸大于吸附剂孔径的干扰物经由体积排阻作用被除去。考虑到待提取的目标活性物质的分子尺寸(如抗体、酶、核酸等2～20nm)与生物基质中干扰物的尺寸(如囊泡30～150nm、细胞碎片300-500nm)差异，孔径在50～300nm的固定孔径多孔材料被广泛用作具有体积排阻作用的磁性亲和吸附剂。

3、3d有序大孔zif-8材料是近年来备受关注的“明星”多孔材料，其通过在有序聚苯乙烯微球模板上生长经典zif-8晶体再溶解除去微球模板，从而得到孔径与模板球直径相近的3d有序大孔zif-8材料。与传统多孔材料相比，3d有序大孔zif-8材料具有比表面积大、孔隙率高、大孔有序分布、孔径分布高度均匀、孔径在50-800nm内可调等优势。然而，这一“明星”多孔材料仍然难以直接作为磁固相萃取吸附剂使用。主要是因为：①现有3d有序大孔zif-8材料无磁性，只能依靠离心的方式从样品体系中分离，操作较为繁琐；②所有zif-8类材料表面非特异性吸附极强，若作为固相萃取吸附剂使用时会吸附样品中的无关杂质，导致提取选择性降低；③zif-8类材料不耐酸(ph＝6.0溶液放置10分钟即发生溶解)的特性也限制了其作为吸附剂使用的应用场景；④zif-8类材料表面主要分布甲基咪唑和锌离子，缺少如氨基、羰基、羟基等可以用于固定亲和配基的活性基团。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种具有体积排阻作用的磁性亲和吸附剂的合成方法，以克服现有技术中3d有序大孔zif-8材料的种种不足，使其能够直接作为磁固相萃取吸附剂使用。

2、本发明提供的具有体积排阻作用的磁性亲和吸附剂的合成方法，具体步骤为：

3、(1)合成3d有序大孔zif-8材料(mzif-8)：首先以离心或抽滤等形式将特定直径(50-800nm)的单分散聚苯乙烯微球制备为有序排列的聚苯乙烯微球模板；将干燥后的有序聚苯乙烯微球模板浸入到zif-8前体离子溶液(如二价锌离子溶液、甲基咪唑溶液)中，施加双溶剂系统完成原位结晶，zif-8晶体在聚苯乙烯微球模板空隙中生长；随后使用有机溶剂洗去聚苯乙烯微球，得到3d有序大孔zif-8材料；

4、(2)合成氨基修饰的磁性四氧化三铁微球，记为fe3o4-nh2：称取三氯化铁、1，6-己二胺、无水乙酸钠于圆底烧瓶中并加入乙二醇溶解，转移至高压反应釜中高温加热反应；反应完毕后使用适当溶剂清洗所得的fe3o4-nh2微球；

5、(3)合成磁性大孔zif-8材料，记为magmzif-8：将50-200mg步骤(1)合成的产物mzif-8材料与10～40ml氨丙基硅烷化试剂均匀分散于20～100ml无水乙醇中，在30-80℃下搅拌反应2～24小时以实现mzif-8材料表面的氨基化修饰；随后将所得产物以适当中性溶剂清洗除去未反应的硅烷化试剂并离心收集；将收集的沉淀物分散于0.1～2.0％的戊二醛水溶液中，于4～30℃反应5～30分钟；以适当中性溶剂清洗除去未反应的戊二醛并离心收集产物；将所得产物与5～50mg的步骤(2)合成的fe3o4-nh2微球共同分散于ph 8～9的碱性溶液中，于4～30℃反应1-48小时，然后通过施加磁场分离产物magmzif-8，并用适当中性溶剂清洗后干燥；

6、(4)合成聚多巴胺包覆的磁性大孔zif-8材料，记为magmzif-8@pda：取步骤(3)合成的产物magmzif-8均匀分散于50～200ml的ph 8～9的碱性溶液中，搅拌下缓慢加入浓度为8～20mg/ml的盐酸多巴胺水溶液，于4～30℃反应2～24小时，然后通过施加磁场分离产物magmzif-8@pda，并用适当中性溶剂清洗后干燥；

7、(5)合成特定配基修饰的聚多巴胺包覆的磁性大孔zif-8材料，记为magmzif-8@pda-ligand：将步骤(4)合成的产物magmzif-8@pda分散于ph 8～9的碱性溶液中，随后加入结构中带有氨基的亲和配基(如亲和素、酶、抗体等蛋白质，或适配体、mrna等核酸)，于4～50℃反应1～48小时确保配基被固定于magmzif-8@pda材料表面，使用适当的、与配基兼容的缓冲盐溶液对所得产物进行温和清洗，通过施加磁场分离产物magmzif-8@pda-ligand，并储存于4～30℃与配基兼容的环境中。

8、进一步地：

9、步骤(3)中，以戊二醛水溶液活化mzif-8材料表面氨基，戊二醛浓度为0.1～2.0％，反应时间为5～30分钟。

10、步骤(4)中，在ph 8～9的碱性溶液中，使浓度为8～20mg/ml盐酸多巴胺单体在magmzif-8材料表面聚合形成聚多巴胺包覆层，聚多巴胺层厚度不超过步骤(1)中合成的mzif-8材料大孔直径的三分之一。

11、步骤(3)和步骤(4)中，使用ph呈中性的溶剂(ph＝7.0±0.5)清洗材料。

12、步骤(5)中，在ph 8～9的碱性溶液中通过氨基与聚多巴胺层表面羟基反应，使带有氨基的配基共价固定于magmzif-8@pda材料表面。

13、本发明提供的具有体积排阻作用的磁性亲和吸附剂的合成方法，在3d有序大孔zif-8材料的基础上进行了结构优化，具体包括：

14、对3d有序大孔zif-8材料表面进行氨基化，再通过戊二醛交联的方式将氨基四氧化三铁微球固定于其表面，使其在保持原有结构不被破坏的同时获得磁性修饰，克服了现有3d有序大孔zif-8材料因无磁性而只能依靠离心分离的不足；

15、在磁性大孔zif-8材料表面包覆聚多巴胺，增加了材料表面的生物兼容性，克服了现有经典zif-8类材料在处理生物样本时表面非特异性吸附过强等问题；同时，多巴胺包覆层的存在，显著增加材料表面的化学稳定性，克服现有zif-8类材料不耐酸的不足；

16、利用pda表面丰富的活性羟基作为亲和配基固定化位点，克服现有大孔zif-8材料表面缺少活性修饰基团的不足；

17、优化适宜的条件，确保材料聚多巴胺层合适的厚度，保持大孔结构的完整性，避免常规聚合物包覆方式中因包覆层过厚导致孔结构被掩盖的问题。

18、本发明最终制备得到的材料具有良好化学稳定性、高度有序大孔结构、生物兼容性外表面、高载量且高活性地固定有亲和配基等优异特性，可以作为理想的大孔尺寸排阻磁性吸附剂应用于复杂样品的前处理中。