一种基于三金属纳米酶构建比色传感器检测新城疫病毒的方法

本发明属于比色传感，具体涉及了一种基于三金属纳米酶构建比色传感器检测新城疫病毒的方法。

背景技术：

1、新城疫病毒((newcastlediseasevirus，ndv)是ssrna病毒，有包膜，病毒颗粒具多形性，有圆形、椭圆形和长杆状等。ndv的基因组为不分节段rna。病毒基因组”主要编码6种结构蛋白:核衣壳蛋白(nuele－ocapsidprotein，np)、磷蛋白(phosphoprotein，p)、基质蛋白(matrixprotein，m)、融合蛋白(fusionprotein，f)、血凝素－神经氨酸酶蛋白(heamagglutinin－neuraminidaseprotein，hn)和大分子蛋白(largeprotein，l)，其中f和hn蛋白是ndv表面重要的2个囊膜糖蛋白，它们在病毒的免疫中扮演了重要的角色。

2、目前对ndv的检测，主要有酶联免疫吸附试验(elisa)，免疫胶体金技术和real-time rt-pcr。elisa检测新城疫病毒主要是将新城疫抗原或抗体吸附在固相载体上进行的特异性免疫酶试验。该方法检测新城疫病毒操作简便，但特异性和灵敏度欠缺，且成本高。免疫胶体金是利用胶体金标记的抗体或抗原来检测相对应的新城疫抗体或抗原试纸条。其优点在于检测新城疫病毒操作简便，节约时间，但这种方法会因检测灵敏度低而导致假阳性率较高。real-time rt-pcr是通过提取病毒rna，设计并合成引物和探针，用定量pcr仪进行荧光定量。该检测虽然灵敏度高结果可靠，但是需要提取和反转病毒核酸，需要昂贵仪器才能进行检测，限制了其在现场检测中的应用。

3、在本发明中，三金属纳米酶(aupt3cu1.2)作为新一代三金属材料，具有良好的过氧化物酶活性和漆酶活性，能溶于水，且能结合抗体、适配体、多肽等识别元件的特点。

4、同时，在本发明中，通过利用还原反应来制备aupt3cu1.2用作elisa传感器的显色材料，从而增加传感器的灵敏度和稳定性。目前还未见将此三金属纳米酶用于比色传感器的报道。

5、重组新城疫病毒血凝素神经氨酸酶vhh单克隆抗体(recombinant ndvhemagglutinin-neuraminidase vhh monoclonal antibody)是一种特异性识别新城疫病毒hn蛋白的纳米抗体，在此，我们利用其可以与aupt3cu1.2表面的au和pt结合的特性，构建基于aupt3cu1.2的比色传感器，用于检测ndv。

技术实现思路

1、本发明正是为了解决上述问题缺陷，提供一种基于三金属纳米酶构建比色传感器检测新城疫病毒的方法。

2、本发明的目的在于将ndv antibody(多克隆抗体)作为一抗(ab1)孵育在酶标板上，用于固定ndv病毒颗粒，再使用将纳米抗体(ndv vhh antibody)用作二抗(nb2)组装到aupt3cu1.2上的复合材料，捕获ndv hn蛋白，组成抗体-病毒-抗体的夹心结构，最后加入3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(tmb)，ph＝4.5的醋酸缓冲液及10mm的h2o2进行显色反应，构成一种可以快速有效检测样品中新城疫病毒含量的比色检测方法。

3、本发明采用如下技术方案实现。

4、一种elisa传感器的显色材料，本发明所述elisa传感器的显色材料为aupt3cu1.2。所述显色材料的应用为构建比色传感器检测新城疫病毒。

5、aupt3cu1.2制备方法包括以下步骤：首先称取haucl4用超纯水溶解为haucl4溶液，称取h2ptcl6用超纯水溶解为h2ptcl6溶液，称取cucl2用超纯水溶解为cucl2溶液；将超纯水提前预热至40℃，取haucl4溶液、h2ptcl6溶液、cucl2溶液加入预热好的超纯水中，向体系中加入l-抗坏血酸，溶液由无色变为黑色，40℃反应后将产物用超纯水离心洗脱后进行冷冻干燥，得到aupt3cu1.2。

6、aupt3cu1.2的制备方法，具体包括以下步骤：

7、首先称取0.0357g haucl4用10ml超纯水溶解为10mm的haucl4溶液，称取0.1163gh2ptcl6·6h2o用10ml超纯水溶解为10mm的h2ptcl6溶液，称取0.2218g cucl2用49.5ml超纯水溶解为10mm的cucl2溶液；

8、将5ml超纯水提前预热至40℃，取75μl 10mm的haucl4溶液，225μl10mm的h2ptcl6溶液，400μl 10mm的cucl2溶液加入预热好的超纯水中，继续加热5min后向体系中加入300μl100mm的l-抗坏血酸，见溶液由无色变为黑色，继续40℃反应4h后将产物用超纯水在12000rpm离心下洗2次后进行冷冻干燥，得到aupt3cu1.2。

9、表征方法有：扫描电镜图像(sem)，透射电镜图像(tem)，eds元素分析，xrd粉末x射线衍射图谱，xps光电子能谱。

10、本发明使用aupt3cu1.2制备构建比色传感器的材料为nb2@aupt3cu1.2。所述构建比色传感器的材料的应用为检测新城疫病毒。

11、nb2@aupt3cu1.2的制备方法包括：将新城疫hn蛋白纳米抗体nb2加入到aupt3cu1.2溶液中，室温震荡，离心洗涤。

12、nb2@aupt3cu1.2的制备方法，具体包括以下步骤：将200μl 10μg/ml的新城疫hn蛋白纳米抗体nb2加入到2ml 1mg/ml的aupt3cu1.2溶液中，室温震荡12h，离心洗涤。

13、使用nb2@aupt3cu1.2构建比色传感器检测新城疫病毒的方法，包括以下步骤：

14、(1)配制ndv抗体ab1溶液，滴加在酶标孔中，4℃过夜孵育；

15、(2)将未吸附在酶标孔上的抗体溶液倒去，用pbst清洗酶标孔3次，倒去多余水分，滴加5％脱脂奶粉，孵育；

16、(3)将脱脂奶粉倒去，用pbst清洗酶标孔，倒去多余水分，将一系列不同浓度的新城疫病毒溶液滴加酶标孔中，孵育；

17、(4)将未吸附在酶标孔上的病毒溶液倒去，用pbst清洗酶标孔，吸去多余水分，将nb2@aupt3cu1.2加入，孵育；

18、(5)将未吸附在酶标孔上的材料倒去，用pbst清洗酶标孔，倒去多余水分，滴加醋酸缓冲液，tmb溶液及h2o2进行显色，使用酶标仪测定。

19、本发明上述方法具体包括以下步骤：

20、(1)配制1μ/ml的ndv antibody溶液，pbs稀释，取50μl滴加在酶标孔中，4℃过夜孵育；

21、(2)将未吸附在酶标孔上的抗体溶液倒去，用pbst清洗酶标孔3次，倒去多余水分，滴加50μl 5％脱脂奶粉，4℃孵育30min；

22、(3)将5％的脱脂奶粉倒去，用pbst清洗酶标孔3次，倒去多余水分，将50μl浓度为10-2-2*103ng/ml的一系列不同浓度的新城疫病毒溶液滴加酶标孔中，4℃孵育2h；

23、(4)将未吸附在酶标孔上的病毒溶液倒去，用pbst清洗酶标孔3次，吸去多余水分，将50μl nb2@aupt3cu1.2加入，4℃孵育2h；

24、(5)将未吸附在酶标孔上的材料倒去，用pbst清洗酶标孔3次倒去多余水分，滴加200μl ph＝4.5的醋酸缓冲液，50μl 10mm tmb溶液及50μl 10mm的h2o2进行显色，使用酶标仪测定od652。

25、扩展：除上述技术方案之外，本发明可以用来识别新城疫病毒的分子还可以是其他生物分子，比如新城疫病毒的其他抗体、适配体或与多肽等识别元件。

26、本发明的有益效果为：1)aupt3cu1.2纳米材料成功制备，并通过红外光谱，扫描电镜图像，透射电镜图像，eds元素分析，zeta电位，xrd粉末x射线衍射图谱和xps光电子能谱证明。

27、2)aupt3cu1.2合成简单，且本身具有过氧化物酶活性，并且可以直接与抗体结合，vhh是目前已知最小的活性抗原结合蛋白，nb2@aupt3cu1.2合成，将两种材料的优良性能有效地结合在一起，充分发挥了作为比色传感器显色材料的优良性能。

28、3)随着病毒浓度增加，显色颜色变深，酶标仪检测到的od652增强，且在10-2-2*103ng/ml的新城疫病毒浓度范围内具有良好的线性关系。

29、4)将新城疫溶液替换为其他物质，例如盐溶液，生物蛋白分子，以及可能会与新城疫病毒共同感染禽的其它病毒(禽流感病毒、传染性法氏囊病毒和马立克氏病病毒)，均不能检测到相应的吸光度。证明用上述方法构建的比色传感器具有较高的特异性。

30、5)成功制备了nb2@aupt3cu1.2纳米材料。ndv antibody可以与新城疫病毒表面蛋白结合，nb2@aupt3cu1.2可以有效的捕获新城疫病毒表面的hn蛋白，两种抗体与新城疫病毒表面的不同蛋白结合，从而组成抗体-病毒-抗体的夹心结构，实现比色信号的放大。同时，ndv antibody与新城疫病毒纳米抗体nb2对于新城疫的筛选作用使构建的比色传感器对新城疫具有特异性识别的能力，制备得到的传感器的线性检测范围是0.01ng/ml-2*103ng/ml，最低检测下限为41.53pg/ml。

31、下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步解释。