一种糖化血红蛋白层析柱用填料及其制备方法与流程

本发明属于离子交换色谱填料，尤其涉及一种强阳离子交换色谱填料合成方法及其应用，具体涉及一种糖化血红蛋白层析柱用填料及其制备方法。

背景技术：

1、糖化血红蛋白(ghb)是红细胞中的血红蛋白与血清中的糖类相结合的产物。它是通过缓慢、持续及不可逆的糖化反应形成，其含量的多少取决于血糖浓度以及血糖与血红蛋白接触时间，而与抽血时间、患者是否空腹、是否使用胰岛素等因素无关。ghb由hba1a、hba1b、hba1c组成，其中hba1c约占70％,且结构稳定，目前hba1c是评价糖尿病患者长期血糖控制状况的“金标准”，在糖尿病治疗及其并发症监测中具有重要价值。

2、高效液相糖化血红蛋白检测系统实现的是对hba1c的定量检测。根据高效液相色谱法(hplc)的工作原理，在离子交换法对糖化血红蛋白的检测分析中，高效液相分析仪、洗脱试剂、层析柱、校准品等对检测结果都会产生影响，而其中层析柱对于糖化血红蛋白的分离能力起着非常重要的作用。

3、目前，大多数hplc法最易受血红蛋白变异体的干扰，这种干扰可能引起hba1c的极度异常或hba1c测定值与血糖浓度不一致。到目前为止发现的最为常见的血红蛋白变异体是hbs、hbe、hbc和hbd，全球范围的分布规律为hbs＞hbe＞hbc＞hbd，这四种变异体由于相对较低的糖化血红蛋白分离能力，可能导致血红蛋白变异体与a0共洗脱，从而导致hba1c假性偏低产生异常结果。而大部分血红蛋白变异体的杂合子通常无症状，红细胞生存率正常，如果糖尿病患者同时携带血红蛋白变异体基因，不易引起临床医生的注意，从而影响诊断。因此亟需开发一种糖化血红蛋白层析柱用填料，提高对糖化血红蛋白的分离度，分离血红蛋白变异体

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种糖化血红蛋白层析柱用填料及其制备方法，通过原料的选择和工艺步骤的设计，使得到的糖化血红蛋白层析柱用填料能够得到a0前后血红蛋白变异体较好的分离度，实现糖化血红蛋白高效液相色谱检测过程中对hbs、hbe、hbc和hbd等蛋白良好的分离效果。

2、为达此目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种糖化血红蛋白层析柱用填料的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

4、(1)单体和交联剂进行反应，得到微球；

5、(2)所述微球与酸性溶液进行反应，得到含改性微球的溶液；

6、(3)所述含改性微球的溶液与含羧基物料进行反应，得到含羧基化微球的溶液；

7、所述含羧基物料包括乙二酸、丙二酸、琥珀酸、柠檬酸、水杨酸、丙三羧酸或丁烷四羧酸中的任意一种或至少两种的组合；

8、(4)所述含羧基化微球的溶液与含磺酸基物料进行反应，得到所述糖化血红蛋白层析柱用填料。

9、本发明提供的糖化血红蛋白层析柱用填料的制备方法，先制备微球，然后用酸性溶液对微球进行亲水改性处理，最后在微球上引入羧基与磺酸基两种功能官能团，通过调节两种官能团在微球上所占的比例，可以提高糖化血红蛋白的分离度，有利于分离血红蛋白变异体。本发明提供的制备方法，可以制备粒径单分散的填料，实现糖化血红蛋白高效液相色谱检测过程中hbs、hbe、hbc和hbd等蛋白良好的分离效果。

10、本发明提供的糖化血红蛋白层析柱用填料的制备方法，通过分散聚合制得微球后，对微球进行分步改性获得含有多功能官能团的强阳离子交换色谱填料。填料的制备方法简单易于操作，功能官能团的比例易于调控且分布均匀，能够得到a0前后血红蛋白变异体较好的分离度。

11、优选地，所述糖化血红蛋白层析柱用填料的表面羧基与磺酸基的质量比为(1-4):1，例如可以为1:1、1.5:1、2:1、2.5:1、3:1、3.5:1或4:1等。

12、以下作为本发明的优选技术方案，但不作为对本发明提供的技术方案的限制，通过以下优选的技术方案，可以更好的达到和实现本发明的目的和有益效果。

13、作为一个优选的技术方案，以重量份计，所述单体为10-15重量份，所述交联剂为1-5重量份。

14、所述单体为10-15重量份，例如可以为10重量份、11重量份、12重量份、13重量份、14重量份或15重量份，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

15、所述交联剂为1-5重量份，例如可以为1重量份、2重量份、3重量份、4重量份或5重量份，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

16、优选地，所述含羧基物料与所述微球的质量比为(2-10):1，例如可以为2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1等。

17、优选地，所述含磺酸基物料与所述微球的质量比为(1-5):1，例如可以为1:1、2:1、3:1、4:1或5:1等。

18、优选地，所述单体包括第一单体和第二单体的组合。

19、优选地，所述第一单体包括甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸异丁酯、甲基丙烯酸十二烷基酯、甲基丙烯酸二乙基氨基乙酯、甲基丙烯酸己酯、苯乙烯、4-甲氧基苯乙烯、对甲基苯乙烯或3-甲基苯乙烯中的任意一种或至少两种的组合。

20、优选地，所述第二单体包括甲基丙烯酸缩水甘油酯、烯丙基缩水甘油醚、4-乙烯基苯基缩水甘油醚或4-乙烯基苄基缩水甘油醚中的任意一种或至少两种的组合。

21、优选地，所述第一单体与所述第二单体的质量比为(0.4-2.4):1，例如可以为0.4:1、0.6:1、0.8:1、1:1、1.2:1、1.4:1、1.6:1、1.8:1、2:1、2.2:1或2.4:1等。

22、优选地，所述交联剂包括乙二醇二甲基丙烯酸酯和/或二乙烯基苯。

23、优选地，步骤(1)所述反应在引发剂、稳定剂和溶剂存在下进行。

24、优选地，所述引发剂包括偶氮二异丁腈、偶氮二异丁酸二甲酯、过氧化苯甲酰或过氧化二酰中的任意一种或至少两种的组合。

25、优选地，所述稳定剂包括聚乙烯醇、聚氧乙烯、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟甲基丙基纤维素或聚天冬酸氨钠中的任意一种或至少两种的组合。

26、优选地，所述溶剂包括乙醇、甲醇、甲苯或水中的任意一种或至少两种的组合。

27、优选地，以重量份计，所述引发剂为2-5重量份，所述稳定剂为5-10重量份，所述溶剂为70-83重量份。

28、所述引发剂为2-5重量份，例如可以为2重量份、3重量份、4重量份或5重量份，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

29、所述稳定剂为5-10重量份，例如可以为5重量份、6重量份、7重量份、8重量份、9重量份或10重量份，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

30、所述溶剂为70-83重量份，例如可以为70重量份、71重量份、72重量份、74重量份、76重量份、78重量份、80重量份、81重量份、82重量份或83重量份，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

31、优选地，步骤(1)所述反应的时间为2-6h，例如可以为2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h、5h、5.5h或6h，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

32、优选地，步骤(1)所述反应的温度为60-80℃，例如可以为60℃、65℃、70℃、75℃或80℃，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

33、优选地，步骤(1)所述反应完成后，还包括对所得产物依次进行地清洗、干燥的步骤。

34、优选地，所述微球的粒径为1-5μm，例如可以为1μm、2μm、3μm、4μm或5μm，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

35、优选地，所述酸性溶液包括盐酸、硫酸或硝酸中的任意一种。

36、优选地，所述酸性溶液的浓度为0.1-2mol/l，例如可以为0.1mol/l、0.2mol/l、0.4mol/l、0.6mol/l、0.8mol/l、1mol/l、1.2mol/l、1.4mol/l、1.6mol/l、1.8mol/l或2mol/l，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

37、优选地，所述酸性溶液与所述微球的质量比为(50-100):1，例如可以为50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1或100:1等。

38、优选地，步骤(2)所述反应的温度为70-90℃，例如可以为70℃、72℃、75℃、78℃、80℃、82℃、85℃或90℃，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

39、优选地，步骤(2)所述反应的时间为24-72h，例如可以为24h、25h、30h、35h、40h、45h、50h、55h、60h、65h、70h或72h，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

40、优选地，步骤(3)所述反应的温度为70-90℃，例如可以为70℃、72℃、75℃、78℃、80℃、82℃、85℃或90℃，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

41、优选地，步骤(3)所述反应的时间为24-72h，例如可以为24h、25h、30h、35h、40h、45h、50h、55h、60h、65h、70h或72h，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

42、优选地，所述含磺酸基物料包括3-环已胺基-2-羟基丙磺酸、3-(n-吗啉基)-2-羟基丙磺酸、4-甲基苯磺酸2-(2-羟基乙氧基)乙酯、3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-2-羟基-1-丙磺酸、4-羟基-7-(苯基氨基)萘-2-磺酸、3-(4-吗啉基)-2-羟基丙烷磺酸、3-(环己基胺)-2-羟基丙烷-1-磺酸、3-羟基丙磺酸或2-羟基-3-吗啉基丙磺酸中的任意一种或至少两种的组合。

43、优选地，步骤(4)所述反应的温度为70-90℃，例如可以为70℃、72℃、75℃、78℃、80℃、82℃、85℃或90℃，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

44、优选地，步骤(4)所述反应的时间为24-72h，例如可以为24h、25h、30h、35h、40h、45h、50h、55h、60h、65h、70h或72h，以及上述点值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

45、优选地，步骤(4)所述反应完成后，还包括对所得产物依次进行地清洗、干燥的步骤。

46、优选地，所述清洗所用试剂包括乙醇水溶液和水。

47、优选地，所述乙醇水溶液中乙醇的质量百分含量为5-30％。

48、优选地，所述清洗的方法包括：先使用所述乙醇水溶液清洗，再使用水清洗。

49、优选地，所述制备方法具体包括如下步骤：

50、(1)将单体、交联剂、引发剂、稳定剂和溶剂混合后进行反应，所述反应完成后对所得产物依次进行清洗、干燥，得到微球；所述反应的时间为2-6h；所述反应的温度为60-80℃；以重量份计，所述单体为10-15重量份，所述交联剂为1-5重量份，所述引发剂为2-5重量份，所述稳定剂为5-10重量份，所述溶剂为70-83重量份；所述单体包括第一单体和第二单体的组合；所述第一单体与所述第二单体的质量比为(0.4-2.4):1；所述微球的粒径为1-5μm；

51、(2)将所述微球与酸性溶液混合后进行反应，得到含改性微球的溶液；所述酸性溶液的浓度为0.1-2mol/l；所述酸性溶液与所述微球的质量比为(50-100):1；所述反应的温度为70-90℃；所述反应的时间为24-72h；

52、(3)将含改性微球的溶液与含羧基物料混合后进行反应，得到含羧基化微球的溶液；所述含羧基物料包括乙二酸、丙二酸、琥珀酸、柠檬酸、水杨酸、丙三羧酸或丁烷四羧酸中的任意一种或至少两种的组合；所述反应的温度为70-90℃；所述反应的时间为24-72h；以重量份计，所述含羧基物料与所述微球的质量比为(2-10):1；

53、(4)将所述含羧基化微球的溶液与含磺酸基物料混合后进行反应，所述反应完成后对所得产物依次进行清洗、干燥，得到所述糖化血红蛋白层析柱用填料；所述反应的温度为70-90℃；所述反应的时间为24-72h；以重量份计，所述含磺酸基物料与所述微球的质量比为(1-5):1。

54、第二方面，本发明提供一种糖化血红蛋白层析柱用填料，所述糖化血红蛋白层析柱用填料采用如第一方面所述的制备方法制备得到。

55、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

56、采用本发明提供的糖化血红蛋白层析柱用填料的制备方法，制备得到的填料粒径小，分散均匀，填料上有羧基和磺酸基两种官能团，可通过调控这两种官能团的配比来调节填料对变异血红蛋白的分离性能；同时本发明提供的制备方法简单易于操作。