一种高纯度糖化血红蛋白制备方法与流程

本发明涉及高纯度糖化血红蛋白的制备，具体为一种高纯度糖化血红蛋白制备方法。

背景技术：

1、糖化血红蛋白(hemoglobin a1c，hba1c)作为一种典型的糖基化蛋白，其含量作为糖尿病的早期诊断和监控指标，具有重要的临床应用价值。其含量与糖尿病并发症的发生发展有着密切联系，糖基化会导致血红蛋白(hemoglobin，hb)结构的改变，从而引起一系列生化效应，最终影响hb的正常输氧功能，2主体架(1)0年美国糖尿病协会(ada)首次将hba1c≥6.5％作为糖尿病诊断标准，hba1c在5.7％～6.4％范围内可认为是糖尿病高风险人群，并要求实验室应采用经美国糖化血红蛋白标准化计划(ngsp)认可并符合糖尿病控制与并发症试验(dcct)检测标准的方法进行检测，hba1c反映了过去2～3个月血糖平均控制水平，在制备糖化血红蛋白抗体和建立糖化血红蛋白的免疫学测定方法时，需要获得高纯度的hba1c，从健康人或糖尿病人血中提取糖化血红蛋白的纯度和产量较低，且经离子交换纯化并不能特异性地去除所有杂蛋白，纯化后的产物纯度约为80％左右，使用糖化血红蛋白抗体进行亲和纯化的纯度较高，但相应的成本也有所增加；

2、糖化血红蛋白制备后废弃的白细胞过滤器中残留的红细胞，不便对其再次利用，从而导致其十分浪费，进而增大用户的制备成本，并且现有部分通过废弃白细胞过滤器制备糖化血红蛋白的方法得到的糖化血红蛋白，纯度较低，且稳定性也较差。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种高纯度糖化血红蛋白制备方法，以解决上述背景技术中提出的糖化血红蛋白制备后废弃的白细胞过滤器中残留的红细胞，不便对其再次利用，从而导致其十分浪费，进而增大用户的制备成本，并且现有部分通过废弃白细胞过滤器制备糖化血红蛋白的方法得到的糖化血红蛋白，纯度较低，且稳定性也较差的问题，通过本装置方便用户对过滤器主体的冲洗和收集工作，同时能够提高离心时的安全性，避免其产生安全事故，同时在离心时能够方便用户对离心管的锁定工作，进一步提高离心的安全性，同时采用通过将废弃的白细胞过滤器进行利用，降低了用户的制备成本，同时通过体外糖化和硼酸琼脂糖凝胶纯化获得了高纯度和高稳定性的糖化血红蛋白，能够用于糖化血红蛋白标准品的制备工作，同时本装置采用一体化的方式对糖化血红蛋白的制备工作，极大的方便用户工作，同时亦能够提高用户的使用安全性以及人身安全。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种高纯度糖化血红蛋白制备方法，该装置包括主体架、冲洗机构和离心机构，所述主体架的一端开设有两组冷冻解冻室，所述冷冻解冻室的内部皆均匀固定连接有放置板，所述冷冻解冻室相互远离的一侧皆通过转轴连接有密封门，所述主体架的一侧开设有工作仓，所述工作仓的顶端开设有门槽，所述主体架的一侧的顶端固定连接有导向套，所述工作仓的一侧设置有三组闭合门，且闭合门皆与门槽和导向套滑动连接，所述闭合门相互靠近的一端皆滑动连接，所述闭合门的一侧皆滑动连接有两字导向块，且导向块分别与门槽的内壁和导向套的内壁固定连接，所述主体架的顶端设置有第一电机，所述第一电机的输出端固定连接有第一转杆，且第一转杆的一端通过轴承座与主体架固定连接，所述第一转杆的表面均匀固定连接有三组第一锥形齿轮，所述闭合门的一侧皆均匀设置有齿槽，所述主体架的顶端均匀固定连接有三组第一齿轮，且第一齿轮皆分别与齿槽相啮合，所述主体架的顶端均匀设置有三组第一电推杆，所述主体架的顶端通过轴承均匀连接有三组蜗杆，且蜗杆皆分别与第一齿轮相啮合，所述蜗杆的顶端皆设置有传动套，所述传动套的顶端皆固定连接有第二锥形齿轮，所述传动套的中部皆通过轴承连接有移动器，且移动器的一端皆分别与第一电推杆的输出端固定连接，所述蜗杆的顶端皆固定连接有传动杆，且传动杆皆分别与传动套滑动连接，所述传动套的内壁皆均匀滑动连接有传动滑板，且传动滑板皆分别与传动杆固定连接。

3、优选的，所述第一电机和第一电推杆的控制端皆通过外接开关与外界电源电性连接，方便本装置进行工作。

4、优选的，所述冲洗机构包括储液室、第二电推杆、冲洗上座、冲洗下座、连接管、计量泵、下放置槽、上放置槽、过滤器主体、第一套筒、第一抵杆、第一弹簧、十字抵杆、排液管和阀门，所述主体架的一端开设有储液室，所述工作仓顶端的内壁设置有第二电推杆，所述第二电推杆的输出端固定连接有冲洗上座，所述工作仓底端的内壁固定连接有冲洗下座，所述储液室的一端连接有连接管，且连接管的另一端与冲洗上座相连接，所述连接管的中部设置有计量泵，所述冲洗下座的顶端均匀开设有下放置槽，所述冲洗上座的底端均匀开设有上放置槽，且上放置槽与下放置槽一一相对应，所述下放置槽的内部皆设置有过滤器主体，且过滤器主体的顶端皆穿过上放置槽延伸至冲洗上座的内部，所述冲洗上座顶端的内壁均匀固定连接有第一套筒，所述第一套筒的内部皆滑动连接有第一抵杆，所述第一抵杆的顶端皆固定连接有第一弹簧，且第一弹簧的顶端皆与冲洗上座的内壁固定连接，所述第一弹簧的底端皆固定连接有十字抵杆，且十字抵杆的底端皆分别与过滤器主体的顶端相抵触，所述第一抵杆的中线轴线、冲洗下座的中线轴线和冲洗上座的中心轴线三线相重合，所述冲洗下座的底端连接有排液管，所述排液管的中部设置有阀门，方便用户的冲洗工作。

5、优选的，所述冲洗下座底端的内壁为漏斗状，方便排出冲洗液。

6、优选的，所述第二电推杆、计量泵和阀门的控制端皆通过外接开关与外界电源电性连接，方便本装置进行工作。

7、优选的，所述离心机构包括离心室、安全盖、动力仓、第二电机、离心座、万向节、安全锁盖、第三电推杆、支撑座、滚珠、水平检测器、管槽、压板、第二弹簧、插槽、锁槽、固定套筒、螺纹转杆、连接杆、方槽、通槽、锁板、锥头、固定板、收槽和第三弹簧，所述工作仓底端的内壁开设有两组离心室，所述离心室的一端皆通过转轴连接有安全盖，所述离心室底端的内壁皆开设有动力仓，所述动力仓的内部皆设置有第二电机，所述离心室的内部皆设置有离心座，所述第二电机的输出端皆固定连接有万向节，且万向节的顶端皆与离心座的底端固定连接，所述万向节的顶端皆设置有安全锁盖，所述离心室底端的内壁均匀设置有第三电推杆，所述第三电推杆的输出端皆固定连接有支撑座，所述支撑座的顶端皆转动连接有滚珠，且滚珠的一端皆与离心座的表面相贴合，所述离心室的内壁皆均匀设置有水平检测器，所述离心座的表面皆开设有管槽，所述安全锁盖的内部皆滑动连接有压板，所述压板的顶端皆均匀固定连接有第二弹簧，且第二弹簧的顶端皆与安全锁盖的内壁固定连接，所述离心座底端的内壁皆开设有插槽，所述插槽中部的内壁皆开设有锁槽，所述安全锁盖的中部皆固定连接有固定套筒，且固定套筒的底端皆分别与插槽滑动连接，所述压板的中部皆与固定套筒滑动连接，所述固定套筒的顶端皆通过螺纹连接有螺纹转杆，所述螺纹转杆的底端皆通过轴承连接有连接杆，所述固定套筒的底端皆开设有方槽，所述方槽的内壁对称开设有通槽，所述方槽的内部对称滑动连接有锁板，且锁板的两端皆与通槽滑动连接，所述锁板的两端皆穿过通槽延伸至锁槽的内部，所述连接杆的底端皆固定连接有锥头，且锥头皆分别位于锁板之间，所述方槽底端的内壁对称固定连接有固定板，且固定板分为位于两组锁板之间，所述固定板分别位于锥头的两侧，所述锁板相互靠近一侧的两端皆开设有两组收槽，所述收槽的内壁皆固定连接有第三弹簧，且第三弹簧的一端皆分别与固定板固定连接，方便用户进行离心工作，同时提高用户的使用安全性。

8、优选的，所述离心座皆为半球状，所述水平检测器的高度皆与离心座的顶端齐平，方便对离心座的水平进行调节，所述锥头皆为倒锥形，所述锁板相互靠近的一侧皆与锥头相贴合，方便将锁板推动。

9、优选的，所述第二电机的控制端皆通过外接开关与外界电源电性连接，所述第三电推杆的控制端皆通过水平检测器与外界电源电性连接，方便本装置进行工作。

10、制备方法：

11、步骤一：开启，用户控制第一电机和第一电推杆工作，第一电机的输出端带动第一转杆和第一锥形齿轮转动，第一电推杆的输出端上移，使得移动器带动传动套和第二锥形齿轮上移，当第一锥形齿轮和第二锥形齿轮相啮合后，通过第一锥形齿轮带动第二锥形齿轮和传动套转动，传动套通过传动滑板带动传动杆和蜗杆转动，蜗杆通过第一齿轮和齿槽使得闭合门上移，此时用户便可将闭合门升起，同时通过蜗杆、第一齿轮和齿槽亦能够将闭合门进行固定；

12、步骤二：冲洗，用户先将废弃的过滤器主体倒放在下放置槽的内部，然后用户通过第二电推杆控制冲洗上座下移，使得冲洗上座向冲洗下座靠近，从而使得过滤器主体的顶端穿过上放置槽将冲洗上座内部的十字抵杆和第一弹簧顶起，同时通过第一弹簧对第一弹簧进行压缩，此时第一抵杆的底端不再与冲洗上座底端的内壁贴合，用户控制计量泵工作，从而使得储液室内部的pbs进入冲洗上座，在通过冲洗上座对过滤器主体进行冲洗，从而将过滤器主体内部剩余的红细胞冲洗至冲洗下座的内部，用户通过计量泵抽取一百至两百毫升pbs即可，然后用户再将冲洗下座内部的冲洗液通过排液管和阀门放在离心管内；

13、步骤三：离心，用户将安全盖打开后，转动螺纹转杆，螺纹转杆带动连接杆和锥头上移，此时锁板在第三弹簧自身回弹力的作用下使得锁板相互靠近，从而使得锁板的一端不再处于锁槽的内部，然后用户便可将安全锁盖取下，用户将装有冲洗液的离心管放在管槽的内部，使得离心管对称分布，然后用户再将安全锁盖盖在离心座的顶端，在离心管的作用下使得压板对第二弹簧压缩，同时在第二弹簧的作用下通过压板对离心管进行加固，用户在反向转动螺纹转杆，此时使得连接杆和锥头下移，通过锥头将锁板向两侧顶出，从而使得锁板的一端再次处于锁槽的内部，从而完成对安全锁盖和离心管的固定工作，提高在离心时的安全性，然后用户再将安全盖盖上，用户控制第二电机工作，第二电机的输出端通过万向节带动离心座、安全锁盖和离心管高速转动，控制其转速在每分钟两千转至四千转，离心五至二十分钟即可，离心座在转动的同时带动滚珠在支撑座的内部转动，通过第三电推杆、支撑座和滚珠保证离心座转动的稳定性；

14、步骤四：加入十至二十倍体积的pbs重悬沉淀，控制其转速在每分钟两千转至四千转，离心五至二十分钟，反复洗涤两至五次，弃上清；

15、步骤五：然后用户加入十倍体积的红细胞裂解液(纯水等低渗溶液)重悬红细胞，吹打混匀充分裂解后室温静置十至二十分钟，然后用户在对其离心，控制其转速在每分钟八千转至一万转，离心十至二十分钟，取上清，放置在冷冻解冻室内，控制其温度在零下二十度，将其冻存；

16、步骤六：然后用户再将保存于零下二十度的样品置于四度解冻，在进行离心，控制其转速每分钟五千转至八千转，离心五至十五分钟，取上清，测定血红蛋白含量；

17、步骤七：在血红蛋白溶液中加入等体积的糖基化反应液(一百毫升mm pb ph七点五，二十至一百mm葡萄糖，零点五至五mm edta)，置于恒温箱中，二十至四十度温育五至十天；

18、步骤八：然后将上述反应液置于四度透析至上样缓冲液中(二十至一百mmtaurine/naoh缓冲液，十至三十mm mgcl2，ph八至九)，按照一比一万换液三至五次，每次六至八小时；

19、步骤九：然后再将透析好的样品上样至平衡完毕的broic acid beads 4ff，平衡液为二十至一百mm taurine/naoh缓冲液、十至三十mm mgcl2、ph八至九，洗脱液为二十至一百0mm taurine/naoh缓冲液、十至三十mm mgcl2、八十至一百五mm山梨醇、ph八至九；

20、步骤十：然后再将洗脱获得的样品四度透析至高盐储存液(十mm pbs两百mmnacl)中，按照一比一万换液三至五次，每次六至八小时，完成后加入稳定剂(终浓度为二十至八十mmβ-吗啉乙磺酸，五至五十mm kcl，零点五至三m na2co3，ph六点二)；

21、步骤十一：调平，当用户长期使用离心座时，离心座的表面会产生轻微的磨损，从而导致离心座不再水平，此时通过水平检测器对离心座的顶端进行检测，然后控制第三电推杆的伸长和缩短来控制离心座的水平，进而保证离心座水平。

22、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

23、用户在制备糖化血红蛋白时，用户控制第一电机和第一电推杆工作，第一电机的输出端带动第一转杆和第一锥形齿轮转动，第一电推杆的输出端上移，使得移动器带动传动套和第二锥形齿轮上移，当第一锥形齿轮和第二锥形齿轮相啮合后，通过第一锥形齿轮带动第二锥形齿轮和传动套转动，传动套通过传动滑板带动传动杆和蜗杆转动，蜗杆通过第一齿轮和齿槽使得闭合门上移，此时用户便可将闭合门升起，同时通过蜗杆、第一齿轮和齿槽亦能够将闭合门进行固定，从而便于用户工作，然后用户先将废弃的过滤器主体倒放在下放置槽的内部，然后用户通过第二电推杆控制冲洗上座下移，使得冲洗上座向冲洗下座靠近，从而使得过滤器主体的顶端穿过上放置槽将冲洗上座内部的十字抵杆和第一弹簧顶起，同时通过第一弹簧对第一弹簧进行压缩，此时第一抵杆的底端不再与冲洗上座底端的内壁贴合，用户控制计量泵工作，从而使得储液室内部的pbs进入冲洗上座，在通过冲洗上座对过滤器主体进行冲洗，从而将过滤器主体内部剩余的红细胞冲洗至冲洗下座的内部，用户通过计量泵抽取一百至两百毫升pbs即可，然后用户再将冲洗下座内部的冲洗液通过排液管和阀门放在离心管内，用户将安全盖打开后，转动螺纹转杆，螺纹转杆带动连接杆和锥头上移，此时锁板在第三弹簧自身回弹力的作用下使得锁板相互靠近，从而使得锁板的一端不再处于锁槽的内部，然后用户便可将安全锁盖取下，用户将装有冲洗液的离心管放在管槽的内部，使得离心管对称分布，然后用户再将安全锁盖盖在离心座的顶端，在离心管的作用下使得压板对第二弹簧压缩，同时在第二弹簧的作用下通过压板对离心管进行加固，用户在反向转动螺纹转杆，此时使得连接杆和锥头下移，通过锥头将锁板向两侧顶出，从而使得锁板的一端再次处于锁槽的内部，从而完成对安全锁盖和离心管的固定工作，提高在离心时的安全性，然后用户再将安全盖盖上，用户控制第二电机工作，第二电机的输出端通过万向节带动离心座、安全锁盖和离心管高速转动，控制其转速在每分钟两千转至四千转，离心五至二十分钟即可，离心座在转动的同时带动滚珠在支撑座的内部转动，通过第三电推杆、支撑座和滚珠保证离心座转动的稳定性，然后用户通过转动十字抵杆取下安全锁盖，用户取出离心管弃上清，再加入十至二十倍体积的pbs重悬沉淀，控制其转速在每分钟两千转至四千转，离心五至二十分钟，反复洗涤两至五次，弃上清，然后用户加入十倍体积的红细胞裂解液(纯水等低渗溶液)重悬红细胞，吹打混匀充分裂解后室温静置十至二十分钟，然后用户在对其离心，控制其转速在每分钟八千转至一万转，离心十至二十分钟，取上清，放置在冷冻解冻室内，控制其温度在零下二十度，将其冻存，然后用户再将保存于零下二十度的样品置于四度解冻，在进行离心，控制其转速每分钟五千转至八千转，离心五至十五分钟，取上清，测定血红蛋白含量，在血红蛋白溶液中加入等体积的糖基化反应液(一百毫升mm pb ph七点五，二十至一百mm葡萄糖，零点五至五mm edta)，置于恒温箱中，二十至四十度温育五至十天，然后将上述反应液置于四度透析至上样缓冲液中(二十至一百mmtaurine/naoh缓冲液，十至三十mm mgcl2，ph八至九)，按照一比一万换液三至五次，每次六至八小时，然后再将透析好的样品上样至平衡完毕的broic acid beads4ff，平衡液为二十至一百mm taurine/naoh缓冲液、十至三十mm mgcl2、ph八至九，洗脱液为二十至一百0mmtaurine/naoh缓冲液、十至三十mm mgcl2、八十至一百五mm山梨醇、ph八至九，然后再将洗脱获得的样品四度透析至高盐储存液(十mm pbs两百mm nacl)中，按照一比一万换液三至五次，每次六至八小时，完成后加入稳定剂(终浓度为二十至八十mmβ-吗啉乙磺酸，五至五十mm kcl，零点五至三m na2co3，ph六点二)，当用户长期使用离心座时，离心座的表面会产生轻微的磨损，从而导致离心座不再水平，此时通过水平检测器对离心座的顶端进行检测，然后控制第三电推杆的伸长和缩短来控制离心座的水平，进而保证离心座水平，进而避免离心座在磨损后发生安全事故，提高使用的安全性，本装置方便用户对过滤器主体的冲洗和收集工作，同时能够提高离心时的安全性，避免其产生安全事故，同时在离心时能够方便用户对离心管的锁定工作，进一步提高离心的安全性，同时采用通过将废弃的白细胞过滤器进行利用，降低了用户的制备成本，同时通过体外糖化和硼酸琼脂糖凝胶纯化获得了高纯度和高稳定性的糖化血红蛋白，能够用于糖化血红蛋白标准品的制备工作，同时本装置采用一体化的方式对糖化血红蛋白的制备工作，极大的方便用户工作，同时亦能够提高用户的使用安全性以及人身安全。