专利名称：大豆品种抗光氧化的快速筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种大豆抗光氧化特性的快速筛选方法，适用于作物育种技术领域。
背景技术：
大豆[Glycine max (L. )Merr.]是当今世界上重要的植物蛋白和植物油来源， 大豆产量在世界食品构成和国际油料生产中占有重要地位，目前的世界大豆年产量约占世 界油料生产的35%。大豆不仅是重要的蛋白质和油料兼用作物，还是重要的用地养地作物。大豆的 根系富含根瘤，根瘤里面的根瘤菌可以将空气中的游离氮素通过一系列生物还原过程，转 变为可以被作物吸收的氮素。据研究，种过一季大豆的田块，其土壤的肥力提高程度相当于 增施了 50斤硫酸铵。大豆根瘤腐烂后产生的多种有机酸，还能明显改变土壤的物理和化学 性质，利于其他作物的高产和优质。大豆在高温、干旱等逆境下会产生光氧化现象，光氧化直接影响大豆的光合 作用效率，不同大豆品种和育种材料的光氧化特性差异很大，抗(耐)光氧化的大豆种质资 源和育种材料，在高温、干旱等逆境下，光合作用下降的速度和强度远低于不耐光氧化的种 质。因此，认真筛选抗(耐)光氧化的种质，让这些抗性种质参与大豆抗(耐)光氧化的遗传 重组，并在分离的杂交后代中注重选出抗(耐)光氧化的优良个体和家系，是大豆高光效育 种的重要内容。大豆光氧化是和光合作用密切相关的生理特性，根据田间生长的表型特征基本上 无法筛选出抗(耐)光氧化材料。在实验室，人们主要是通过测定与光氧化有关的酶的活性 和生化产物来评价大豆的光氧化抗性的，常用的酶类有多酚氧化酶，过氧化物酶、过氧化氢 酶、超氧物歧化酶等，有关的生化产物包括叶黄素、抗坏血酸、玉米黄素、类胡萝卜素、维生 素E等。测定这些酶的活性和生化产物不仅费工、费时、而且速度很慢、工作效率很低，大量 的实验室污水还会在一定程度上造成环境污染。因此，通过实验，尽快创建一套高效、节本、 低污染的大豆光氧化特性测定技术是大豆品种改良刻不容缓的工作。1997年开始，在江苏 省科委的支持下，我们开始了这方面的探索，以我院保存的我省1500份大豆种质资源和国 外引进的200份大豆品种为试验材料，在夏季高温强光照条件下，将顶端第四张大豆叶片 进行批量光氧化处理，并将用此法选出来的不同类型的抗性材料进行酶活性和酶类产物测 定，检验快速批量筛选技术的有效性，事实说明该法是行之有效的。作物的抗光氧化研究，最早开始于上世纪七十年代。焦德茂等人首先用快速筛选 法鉴定了部分水稻品种资源，并对光氧化的生理基础进行了一系列研究。大豆抗光氧化种 质的快速筛选技术操作简单、省工、省本、运作高效，是一项非常有用的实践技术，它不仅可 以运用于大豆种质资源的抗性批量筛选，还可用于杂交后代的分离群体选择。它不仅可以 运用于大豆，在小豆和豇豆的抗光氧化筛选上也可运用。因为该技术人为的创造了一个加 速光氧化的条件，在对多种作物进行抗光氧化特性的筛选时均可参考。
发明内容
技术问题
在夏季高温强光照季节，人为创造加速作物光氧化的条件，通过大豆叶片的叶绿素氧 化褪色程度，评价大豆的抗光氧化差异，进而选出抗光氧化种质和杂交后代材料。技术方案
大豆品种抗光氧化的快速筛选方法，其特征在于在夏季温度超过30°C时，选择晴好 天气，在大豆初花后，于早上6点在田间摘取大豆顶部第四片复叶的中间小叶，每个品种摘 叶八张，置于深度为4厘米的白色磁盘，叶面朝上，不要重叠，在叶片上盖上厚度为4毫米的 透明普通玻璃片，磁盘加满自来水，然后将装有叶片的磁盘置于高温(30-40度)、强光(夏 天晴天自然光)下曝晒，(每天早上6点钟将磁盘里面的水倒掉，换上新鲜的自来水)，连续四 昼夜后，调查大豆叶片的叶绿素氧化情况，将其褪色情况分为四级叶片90%-100%保持绿 色的定为1级，划为抗性品种；绿色部分75%-89%以上的定为2级，划为耐性品种；绿色部 分50%-74%定为3级，划为耐性较差品种；绿色部分低于49%的定为4级，划为耐性最差品 种。大豆叶片的面积按照下列方法计算卵园型和椭圆型叶片的面积是(叶片长X叶片 宽)X2 + 3 .长椭圆型和披针型叶片的面积是(叶片长X叶片宽)X4 + 7。大豆抗光氧化的快速筛选方法可在大豆品种抗旱性筛选中应用。其中所述大豆品 种对光氧化的抗性定为抗性的，则该大豆品种在抗旱性鉴定中表现为抗性；所述大豆品种 对光氧化的抗性定为耐性的，在抗旱性鉴定中表现为耐性；所述大豆品种在光氧化的抗性 鉴定中定为耐性较差的，在抗旱性鉴定中表现为耐性较差；所述大豆品种在光氧化抗性鉴 定中定为耐性最差的，在抗旱性鉴定中也表现为耐性最差。有益效果 本发明的技术思路是
1.大豆抗光氧化能力和大豆本身的遗传性有关，也和大豆生长过程的逆境因子的内 容、强度有关，遗传性是相对稳定的，逆境因子的数量和强度是可以人为设计和控制的。我 们设计的快速测定法就是人为的给予大豆一个加速光氧化的逆境条件，使其在较短的时间 内，让批量大豆的抗光氧化能力得以表达。从而大大提高大豆抗光氧化批量筛选的速度和 效果。2.导致大豆光氧化的逆境很多，但是高温、强光照和缺氧是最有效、最经济、最容 易人为获得的逆境，所以我们采用了这种逆境。3.测定光氧化抗性的方法有很多种，包括酶活性测定、叶绿素类型变化的测定、 其他有关色素变化的测定，但是综合考量，我们认为，在快速测定中，观察叶绿素的氧化程 度是最方便和直观的，所以我们选用了这种观察方法。4.为了检验快速测定效果，我们经常将快速测定结果和经典的酶活性测定法结 果进行比对，确保两种结果的同步性和一致性。本发明主要技术效果
1.极大的提高了测定速度，同样数量的样本，采用快速测定法，只要经典测定方法20% 的时间。2.大大减少了测定成本，同样数量的样本，只要花费20%的测定费用和人力。3.因为没有使用生化物质，因此没有造成酶活性测定过程中不可避免的化学物 质污染。
4
4.因为速度快、成本低、可以对大量种质资源和育种中间材料进行批量筛选和鉴 定，从而提高了农作物生理育种的可能性和普及性。
具体实施方式
1.准备一批深度为4厘米，长宽一致的新磁盘；准备一批新的、厚度为4毫米的透 明普通玻璃片；寻找一块没有任何遮档的水泥晒场，保证所有样本接收到辐射强度几乎完 全一致的阳光。
2.在夏季温度超过30°C时，选择晴好天气，在大豆初花后，于清早在田间摘取大 豆顶部第四片复叶的中间小叶，每个品种摘叶八张，装入事先准备好的保温桶内，带回试验 场。
3.将大豆叶片平铺在白色磁盘里，叶面朝上，不要重叠，在叶片上盖上透明玻璃 片，然后在磁盘里放满干净的自来水，将磁盘放在没有任何遮阳设备的水泥场上曝晒。每天 早上6点将前一天的水全部倒掉，换上新鲜的自来水。
4.上述处理四昼夜后，调查大豆叶片的叶绿素氧化情况，我们将其褪色情况分为 级，叶片90-100%保持绿色的定为1级，绿色部分75-89%以上的定为2级，绿色部分50-74% 的定为3级，绿色部分低于49%的定为4级。然后，我们将1级的定为抗性品种，1+—— 2-级，定为耐性品种，3级为耐性较差品种。4级是耐性最差品种。
验证快速筛选技术的准确性和可行性。将上述方法选出的代表性品种，进行酶活 性和生化产物分析，检验生理测定和快速测定结果的一致性和同步性。结果表明S0D活性 强的大豆品种，其抗光氧化能力就强；反之，SOD活性弱的大豆品种，其抗光氧化能力就弱。
超氧物岐化酶SOD活性的测定方法 1.试剂反应液含 13X10-3M 甲硫氨酸(MW=149. 21292)，75X10-6MNBT (MW=817. 7), 2父10-611核黄素(丽=376. 36)，100X10-9MEDTA，50X10-3M 磷酸缓冲液，pH7. 8。4. 0962g Na2HPO4. 12H20,0. 1658g NaH2PO4. 2H20 用蒸馏水溶解，加入 0. 484942g 甲硫氨酸、0. 01533g ΝΒΤ、0· 00075272g核黄素(扩大10倍，溶于IOml蒸馏水，取0. 25ml，此2种药剂现用现加) 及0. 000037224g EDTANa2 (配时扩大100倍，用蒸馏水定容IOOml后，取0. 75ml)，定容至 250ml，4 °C避光保存。
2.操作取30支粗细、厚薄一致的洁净试管，分别加入3. 98 ul反应液，四支加20ul酶液， 另一支不加酶液加同样体积的提取缓冲液，以1支加酶的不作光照处理的为空白对照，于 4000Lux照光20-25分钟后测0D560，每提取液重复3次，取平均值。
3.计算在上述条件下，抑制50%NBT光化还原的酶量定为一个酶单位，按 Constantine N. et al 1977 (PI. Physiol. 59:309-314)方法计算酶比活力。
SOD units/mg protein = {[ 0D560 (不加酶)/ 0D560 (加酶)_1] X 稀释倍数 X4 (反应液体积)} /
抗坏血酸的测定原理在乙酸溶液中，抗坏血酸与固蓝盐B反应生成黄色的草酰胼-2-羟基丁酰内酯衍 生物。在最大吸收波长420nm处测定吸光度，与标准系列比较定量。
1.试剂
1. 1乙酸溶液(2mol/L)吸取11. 6mL冰乙酸，加水稀释至IOOmL ； 1. 2乙酸溶液(0. 5mol/L)吸取2. 9mL冰乙酸，加水稀释至IOOmL ； 1. 3乙二胺四乙酸二钠溶液(0.25mol/L):称取9.3g乙二胺四乙酸二钠 [C10H14N2O8Na2]于水中，加热使之溶解后，放冷，并稀释至IOOmL ； 1. 4蛋白沉淀剂
1. 4. 1乙酸锌溶液(220g/L)称取22. Og乙酸锌[Zn (CH3COO)2]，加3mL冰乙酸溶于 水，并稀释至IOOmL ；
1. 4. 2亚铁氰化钾溶液(106g/L)称取10. 6g亚铁氰化钾[K4Fe (CN)6]，加水溶解至 IOOmL ；
1. 5 显色剂固蓝盐B (Fast Blue Salt B)溶液(2g/L):准确称取0.2g固蓝盐B， 加水溶解于IOOmL棕色容量瓶中，并稀释至刻度(该溶液在室温下贮存可稳定3d以上)；
1. 6抗坏血酸标准储备溶液(2. Og/L)精密称取0. 2000g抗坏血酸，加20mL乙酸溶 液(2mol/L)溶解后移入IOOmL棕色容量瓶中，用水稀释到刻度，混勻。此溶液每毫升相当 于2. Omg抗坏血酸(10°C下冰箱内贮存在2d内稳定)；
1. 7抗坏血酸标准储备溶液(0. lg/L)用移液管精密吸取5. OmL抗坏血酸标准储备 溶液(2. Og/L)于IOOmL棕色容量瓶内，加5mL乙酸溶液(2mol/L)，用水稀释至刻度，混勻。 此溶液每毫升相当于100 μ g抗坏血酸(临用时配制)。2 仪器
分光光度计，捣碎机，离心沉淀机，IOmL具塞玻璃比色管。3分析步骤
3. 1试样溶液的制备
称取新鲜大豆叶片20. Og飞0. Og于捣碎机内，加同倍量的乙酸溶液(2mol/L)捣成勻 浆。称取10. 0g^20. Og勻浆(含0. 2g/kg以下抗坏血酸)于IOOmL棕色瓶内，加5mL乙酸溶 液(2mol/L)，用水稀释至刻度，混勻。滤纸过滤，滤液备用。不易过滤的试样可用离心机离 心后，上清液供测定。3. 2标准曲线的绘制
精密吸取 0，0. ImL, 0. 2mL, 0. 4mL, 0. 6mL, 0. 8mL, 1. OmL, 1. 5mL, 2. OmL 抗坏血酸标准 使用溶液(相当于抗坏血酸 0，10. 0 μ g，20. 0 μ g，40. 0 μ g，60. 0 μ g, 80. 0 μ g，100. 0 μ g， 150. 0 μ g，200. 0 μ g)，分别置于IOmL比色管中，各加0. 3mL乙二胺四乙酸二钠溶液 (0. 25mol/L)、0. 5mL乙酸溶液(0. 5mol/L);l. 25mL固蓝盐B溶液(2g/L)，加水稀释至刻度， 混勻。室温(20°C 25°C)下放置20min后，移入Icm比色皿内，以零管为参比，于波长420nm 处测量吸光度，以标准各点吸光度绘制标准曲线。3. 3试样测定
大豆叶片抗坏血酸含量的测定吸取按3. 1制备的试样溶液0. 5mL 5. OmL (约相当 于抗坏血酸200 μ g以下)于IOmL比色管内。以下按3. 2加0. 3mL乙二胺四乙酸二钠溶液 (0. 25mol/L)，试样吸光度从标准曲线上查出抗坏血酸含量与判断级别间的关系。抗坏血酸 含量高，则大豆的抗光氧化能力就弱；抗坏血酸含量低，则大豆的抗光氧化能力就强。实施时间1997-1999年
实施地点南京市孝陵卫，江苏省农业科学院内
1. 1997年，对我所保存的1500份大豆种质资源进行抗光氧化快速筛选，从中选出抗 性较好的材料28份。2. 1998年，对上年快速鉴定的材料进行一次复鉴，看看两年的鉴定结果是否一 致，事实表明，两年的结果有着高度的一致性。对上两年鉴定出来的28份抗性材料和40份光氧化敏感材料进行抗旱性鉴定，研 究抗光氧化和抗旱之间是否存在明显的相关性，结果指出抗光氧化和大豆抗旱性之间存 在高度正向相关，相关系数为0. 88，初步说明，抗大豆光氧化快速筛选技术可以作为大豆抗 旱性筛选的一种间接方法。即所述大豆品种对光氧化的抗性定为抗性品种的，则该大豆品 种抗旱性也定为抗性品种；所述大豆品种对光氧化的抗性定为耐性品种的，则该大豆品种 抗旱性也定为耐性品种；所述大豆品种对光氧化的抗性定为耐性较差品种的，则该大豆品 种抗旱性也定为耐性较差品种；所述大豆品种对光氧化的抗性定为耐性最差品种的，则该 大豆品种抗旱性也定为耐性最差品种。实施时间2008-2009年
实施地点江苏农科院溧水植物育种基地
连续两年对2006-2007年补充征集的1200份大豆资源进行抗光氧化快速筛选，两年的 鉴定结果有着高度的一致性。并用此法对大豆杂交后代进行快速筛选，将快速筛选技术用 于育种实践。实施效果
1.大豆品种资源的鉴定增加了一项非常有用的生理性状——抗光氧化性状。使得 我们有可能对大样本大豆种质和杂交后代进行批量筛选和鉴定。丰富了我们的资源研究内 涵和大田选择手段。2.大豆的高光效育种由于上述技术的突破，开始从理论走向实践。使得大豆的大 田育种增加了生理辅助育种的选择机制。育种实践表明，将抗光氧化快速鉴定技术运用于 育种，可明显提高大豆入选材料的光合作用能力。3.上述快速筛选技术节工、省本、高效、可靠，是一项非常有效的快速测定技术， 其他作物的抗光氧化种质筛选和鉴定也可借鉴。
权利要求
1.大豆品种抗光氧化的快速筛选方法，其特征在于在夏季温度超过30°c时，选择晴 好天气，在大豆初花后，于早上6点在田间摘取大豆顶部第四片复叶的中间小叶，每个品种 摘叶八张，置于深度为4厘米的白色磁盘，叶面朝上，不要重叠，在叶片上盖上厚度为4毫米 的透明普通玻璃片，磁盘加满自来水，然后将装有叶片材料的磁盘置于强光下曝晒，每天早 上6点换上新鲜自来水，继续放在高温30-40度、夏天晴天自然光下曝晒，连续四昼夜后，调 查大豆叶片的叶绿素氧化情况，将其褪色情况分为四级叶片90%-100%保持绿色的定为1 级，定为抗性品种；绿色部分75%-89%以上的定为2级，定为耐性品种；绿色部分50%-74%定 为3级，定为耐性较差品种；绿色部分低于49%的定为4级，是耐性最差品种，大豆叶片的面 积按照下列方法计算卵园型和椭圆型叶片的面积是(叶片长X叶片宽)X2 + 3 .长椭圆 型和披针型叶片的面积是(叶片长X叶片宽)X4 + 7。
2.权利要求1所述大豆抗光氧化的快速筛选方法在大豆品种抗旱性筛选中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，权利要求1所述大豆品种对光氧化的抗性 定为抗性品种的，则该大豆品种抗旱性也定为抗性品种；权利要求1所述大豆品种对光氧 化的抗性定为耐性品种的，则该大豆品种抗旱性也定为耐性品种；权利要求1所述大豆品 种对光氧化的抗性定为耐性较差品种的，则该大豆品种抗旱性也定为耐性较差品种；权利 要求1所述大豆品种对光氧化的抗性定为耐性最差品种的，则该大豆品种抗旱性也定为耐 性最差品种。
全文摘要
本发明公开了一种大豆品种抗光氧化的快速筛选方法，涉及作物生理学和育种学。其方法是在夏季高温强光照季节，选取大豆顶端第四张叶片，置于规格一致的白色磁盘，叶面朝上，在叶片上盖着透明普通玻璃片，磁盘加满自来水，然后将装有试验材料的磁盘置于强光下曝晒，次日清晨，换上新鲜自来水，继续放在高温强光照下曝晒，连续四昼夜后，观察已经处理的大豆叶片的叶绿素氧化、褪淡情况，褪色越多说明供试材料对光氧化的抗性越差。连续四年的试验表明该方法的鉴定结果有着很强的重演性，所选出的抗性材料有着很强的一致性。本方法操作简单、快速高效、省工节本、没有化学污染，结果可靠实用。
文档编号G01N17/00GK102033038SQ201010522198
公开日2011年4月27日 申请日期2010年10月28日 优先权日2010年10月28日
发明者崔晓艳, 张红梅, 袁星星, 陈华涛, 陈新, 顾和平 申请人:江苏省农业科学院