专利名称：：辅助筛选具有较低株高性状的大豆的方法及其专用引物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种辅助筛选具有较低株高性状的大豆的方法及其专用引物。
背景技术：
：大豆株高对产量的形成有重要的影响,研究它的发育遗传规律有助于了解产量形成的机制。大豆株高是多基因控制的数量性状，人们曾以传统的统计分析方法对它的遗传规律进行了大量研究。王连铮等总结了前人的研究结果，认为株高的遗传力在45%-75%之间。陈恒鹤指出，大豆高矮秆杂交后代符合一或两对基因控制的分离比例，但大多数杂交后代都呈现多基因控制的连续分布。杨庆凯等认为株高的加性基因效应比非加性效应更重要，显性效应比上位性效应重要，株高与产量的相关系数一般认为在0.3-0.45之间。Wilcox等认为株高对产量的影响较大。Luis等用2组杂交材料的研究结果表明，株高的广义遗传力高达80%,而狭义遗传力只有38%，与产量呈极显著正相关。用常规方法进行育种，具有准确性差、育种效率低的局限性。近些年来，随着分子标记辅助育种技术的发展，有效地解决了这一问题。例如该方法在水稻上辅助选育新品种已有成功的先例，且在提高育种速度和加快育种进程方面优势明显。彭应财等利用分子标记辅助选择技术把白叶枯病抗性基因Xsi7导入到强优恢复系辐恢838中，选育出抗白叶枯病恢复系中恢218，组配出强优势杂交中晚稻新组合协优218，该组合具有产量较高、抗白叶枯病、易制种等特性，于2002年2月通过江西省品种审定。曹立勇等利用分子标记辅助选择育种技术育成带有抗白叶枯病基因&W的恢复系中恢8006，再与印水型胞质不育系中9A组配的中晚兼用杂交稻新组合。并于2004年3月通过江西省品种审定,2004年10月通过国家审定，定名为国稻l号。大豆株高受生态环境影响极大，年际间波动极大，因此通过常规方法对大豆株高性状进行选择非常困难。
发明内容本发明的目的是提供一种辅助筛选具有较低株高性状的大豆的方法及其专用引物。本发明提供的辅助筛选以Charleston为亲本衍生的大豆中具有较低株高性状的大豆的方法，包括如下步骤以待测大豆的基因组DNA为模板，分别用引物对甲和引物对乙进行PCR扩增，得到待测大豆的扩增产物；以Charleston的基因组DNA为模板，分别用引物对甲和引物对乙进行PCR扩增，得到Charleston的扩增产物；将待测大豆的扩增产物和Charleston的扩增产物进行电泳，如果待测大豆的扩增产物和Charleston的扩增产物呈现同样的带型，待测大豆为候选的具有较低株高性状的大豆；所述较低株高性状为成株株高小于80cm的性状；所述引物对甲由序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸组成；所述引物对乙由序列表的序列3和序列表的序列4所示核苷酸组成。所述待测大豆可为东农594与Charleston杂交的子代。所述待测大豆具体可为东农594与Charleston的杂交后代Fl的自交12代和自交13代。本发明还保护辅助筛选以Charleston为亲本衍生的大豆中具有较低株高性状的大豆的专用引物，由引物对甲和引物对乙组成；所述引物对甲由序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸组成；所述引物对乙由序列表的序列3和序列表的序列4所示核苷酸组成；所述较低株高性状为成株株高小于80cm的性状。所述大豆可为东农594与Charleston杂交的子代，具体可为东农594与Charleston的杂交后代Fl的自交12代和自交13代。所述专用引物在制备辅助筛选以Charleston为亲本衍生的大豆中具有较低株高性状的大豆的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围；所述较低株高性状为成株株高小于80cm的性状。所述大豆可为东农594与Charleston杂交的子代，具体可为东农594与Charleston的杂交后代Fl的自交12代和自交13代。本发明还保护一种辅助筛选Charleston为亲本衍生的大豆中具有较低株高性状的大豆的试剂盒，包括所述专用引物；所述较低株高性状为成株株高小于80cm的性状。所述大豆可为东农594与Charleston杂交的子代，具体可为东农594与Charleston的杂交后代Fl的自交12代和自交13代。本发明还保护一个大豆株高的数量性状基因位点，定位于L连锁群，位于SSR引物位点Sat—099和Sat—113之间。本发明能够克服大豆株高受环境影响大，且只能在成熟期进行评定的缺点，在苗期就能够通过分子标记对大豆品种和品系的株高水平进行预测和筛选，对理想株4高进行有效选择，减少人力和物力的浪费，提高育种效率。图1为与大豆株高相关的位点-htL一l。图2为实施例2中的部分PCR产物电泳结果。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。东农594和Charleston(孙德生等，大豆株高QTL发育动态分析大豆株高QTL发育动态分析，作物学报，2006:32(4))(东北农业大学)。东农594为东北农业大学大豆研究所培育的稳定品系(1997年底)，保存在东北农业大学大豆种质资源库中；Charleston为引进美国栽培大豆品种(1997年底)，保存在东北农业大学大豆种质资源库中(由于获自东北农业大学大豆种质资源库，原始来源不清)。实施例l、与大豆株高紧密连锁的数量性状遗传位点(htL一l)的获得一、Charleston重组自交系的构建及成熟期株高的鉴定1、Charleston重组自交系的构建用中国大豆栽培品种东农594(早)和要测试的美国栽培品种Charleston($)进行杂交，得到杂种F1;由杂种Fl代自花授粉获得子代，通过子代单粒传法(SingleSeedDescent,SSD)(Brim，C.A.1966.Amodifiedpedigreemethodofselectioninsoybeans.Cr叩Sci.6:220.)获得143个「12代重组自交系。2、Charleston重组自交系成熟期株高的鉴定在呼兰、绥化、哈尔滨三地分别种植143个F,2代重组自交系。按3米行长，6cm株距播种，每行51株，每个株系重复三次(即三行)；随机区组。大豆完全成熟时，在各地的每个家系随机抽取10株单株，测三次重复。二、遗传图谱构建及QTL分析选取在父母本间具有扩增多态性的SSR引物对143个家系进行分析，根据SSR条带在群体中的分离情况，将有母本类型条带的个体记为"A"，有父本类型条带的个体记为"B"，杂合的和缺失不清的记为"-"。利用Mapmaker/EXP3.0作图软件，构建分子标记连锁图谱。应用Group命令进行5连锁分析和分组(L0D=5.0)，连锁标记少于8个的用Compare命令进行优化排序，多于8个的用Ripple命令排序，错误检测水平设为1%，利用Kosarabi函数将重组率转化为遗传图距(cM)。根据已由Cregan等定位的SSR标记作为锚定标记以确定相应的连锁。将L0D》2.0作为QTL存在的阙值，用WinQTLCartographV2.0进行QTL定位。在L连锁群上由SSR标记sat—099和sat—113定位的与大豆株高紧密连锁的数量性状遗传位点htL一l(见图l)在7个环境下连续4年被检测到。表l控制大豆株高的数量遗传位点(QTL)—htLj信息<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>LOD、A、R2为三个指标，分别代表极大似然比、加性效应值和遗传贡献率。实施例2、控制大豆株高的数量遗传位点htL一l的验证用实施例l得到的143个Fu重组自交系中的植株进行株高预测和株高测定。一、株高预测先从待测植株的叶片中分离基因组DNA,然后在不同的PCR体系中，分别利用分子标记Sat—099和Sat—113进行PCR扩增，通过检测是否存在数量遗传位点(QTL)来预测这些家系所能达到的株高水平。Sat—099:上游引物5>-GCGAAAATGGCAGAGATM-3';下游引物5'-AATGCTAAAAGAGGAATGAAATAA-3'。Sat—113:上游引物5'-GGAGCATACAGCCTTAAGAGAT-3';下游引物5一-TGGGCATCAMACTAAGAAAA-3'。PCR产物在6%聚丙烯酰胺凝胶(PA)测序胶上分离，在IOOW恒功率下电泳约2小时，银染检测。部分结果见图2。图2中，A为charleston的带型，B为东农594的带型。与东农594带型相同的待测植株应具有高杆性状，反之，与charleston带型相同的待测植株应具有矮杆性状。二、株高测定在呼兰、绥化、哈尔滨三地种植143个Fu重组自交系。按3米行长，6cm株距播种，每行51株，每个株系重复三次(即三行)；随机区组。大豆完全成熟时，在各地的每个家系随机抽取10株单株测成熟期株高。并与预测结果进行对比(表2，表3)。预测结果与实际结果非常吻合，基因型与表现型非常吻合。表2与大豆株高主效QTL相关6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表3与大豆株高主效QTL相关6<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>序列表<110>东北农业大学<120〉辅助筛选具有较低株高性状的大豆的方法及其专用引物<130〉CGGNARY92613<210〉1<211>19〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉<400〉1gcgaaaatggcagagataa19〈210〉2〈211〉24<212〉DNA<213>人工序列〈220〉〈223><400〉2aatgctaaaagaggaatgaaataa24<210>3〈211〉22<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223〉〈400〉3ggagcatacagccttaagagat22<210〉4〈211〉21<212〉腿<213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉4tgggcatcaaaactaagaaaa2权利要求1、辅助筛选以Charleston为亲本衍生的大豆中具有较低株高性状的大豆的方法，包括如下步骤以待测大豆的基因组DNA为模板，分别用引物对甲和引物对乙进行PCR扩增，得到待测大豆的扩增产物；以Charleston的基因组DNA为模板，分别用引物对甲和引物对乙进行PCR扩增，得到Charleston的扩增产物；将待测大豆的扩增产物和Charleston的扩增产物进行电泳，如果待测大豆的扩增产物和Charleston的扩增产物呈现同样的带型，待测大豆为候选的具有较低株高性状的大豆；所述较低株高性状为成株株高小于80cm的性状；所述引物对甲由序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸组成；所述引物对乙由序列表的序列3和序列表的序列4所示核苷酸组成。2、如权利要求1所述的方法，其特征在于所述待测大豆为东农594与Charleston杂交的子代。3、如权利要求2所述的方法，其特征在于所述待测大豆为东农594与Charleston的杂交后代Fl的自交12代和自交13代。4、辅助筛选以Charleston为亲本衍生的大豆中具有较低株高性状的大豆的专用引物，由引物对甲和引物对乙组成；所述引物对甲由序列表的序列l和序列表的序列2所示核苷酸组成；所述引物对乙由序列表的序列3和序列表的序列4所示核苷酸组成；所述较低株高性状为成株株高小于80cm的性状。5、如权利要求4所述的专用引物，其特征在于所述大豆为东农594与Charleston杂交的子代。6、权利要求4或5所述专用引物在制备辅助筛选以Charleston为亲本衍生的大豆中具有较低株高性状的大豆的试剂盒中的应用；所述较低株高性状为成株株高小于80cm的性状。7、如权利要求6所述的应用，其特征在于所述待测大豆为东农594与Charleston杂交的子代。8、一种辅助筛选以Charleston为亲本衍生的大豆中具有较低株高性状的大豆的试剂盒，包括权利要求4或5所述专用引物；所述较低株高性状为成株株高小于80cm的性状。9、如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于所述待测大豆为东农594与Charleston杂交的子代。10、大豆株高的数量性状基因位点，定位于L连锁群，位于SSR引物位点Sat一099和Sat—113之间。全文摘要本发明公开了一种辅助筛选具有较低株高大豆的方法及其专用引物。本发明的方法包括如下步骤以待测大豆的基因组DNA为模板，分别用引物对甲、乙进行PCR扩增，得到待测大豆的扩增产物；以Charleston的基因组DNA为模板，分别用引物对甲、乙进行PCR扩增，得到Charleston的扩增产物；将待测大豆和Charleston的扩增产物进行电泳，如呈现同样的带型，待测大豆为候选的具有较低株高性状的大豆；引物对甲由序列表的序列1和序列表的序列2所示核苷酸组成；引物对乙由序列表的序列3和序列表的序列4所示核苷酸组成。本发明还提供了大豆株高的数量性状基因位点，定位于L连锁群，位于SSR引物位点Sat_099和Sat_113之间。应用本发明的方法可通过大豆品种资源或杂交后代的DNA测定，判断是否含有该数量遗传位点(QTL)--htL_1，从而预测大豆株高水平，加快和提高对大豆株高的选育速度。文档编号C12Q1/68GK101671743SQ200910236418公开日2010年3月17日申请日期2009年10月21日优先权日2009年10月21日发明者孙德生,张忠臣,李文滨,杜玉平,滕卫丽,韩英鹏申请人:东北农业大学