一种Cu/PAA复合膜及其制备方法以及应用与流程

本发明属于生物活性材料及其制备领域，特别涉及一种Cu/PAA复合膜及其制备方法以及应用。

背景技术：

多孔阳极氧化铝(Porous Anodic Alumina,PAA)是一种典型的具有长程有序的纳米多孔自组装材料。其表面相互平行排列的大面积纳米孔道能够模拟骨组织中胶原纤维的尺寸和排列(International Journal of Nanomedicine 2014；9:3325-3334)。研究表明，阳极氧化铝的纳米孔阵列能显著促进成骨细胞生长，细胞能在其表面牢固附着(Acta Biomaterialia 2014；10:968-74)。然而，PAA表面不具有抗菌活性，易于受到细菌的侵染。利用PAA表面高度规整的孔道结构负载生物活性物质，可赋予其抑制细菌感染同时促进相关功能细胞生长的多重生物学功能，因此PAA是一种潜在的生物医学材料表面涂层。

Cu因为具有突出的杀菌作用而在生物材料领域被广泛运用。作为人体内必需的一种微量元素，Cu参与多种蛋白质和酶的构成。近期的研究表明，Cu在机体骨的正常生长发育过程中发挥着重要的作用，能刺激骨组织的再生与修复(International Journal of Nanomedicine 2014；9:3325-3334)。另有研究表明，Cu可以诱导相关生长因子表达，从而促进新血管的生成(Applied and Environmental Microbiology:2011.77:1541-1547)。引入适量Cu的生物陶瓷材料对成骨相关细胞的黏附、增殖及功能表达方面具有明显的促进作用(Journal of Controlled Release 2014；193:282-295)。

生物材料的表面修饰已发展出诸多技术方法，包括低温等离子体法、辐射接枝技术、表面固定化、自组装技术等。然而大多数表面修饰方法均难以实现生物材料表面生物活性物质装载量的有效控制。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种Cu/PAA复合膜及其制备方法以及应用，该方法快速，简便，高效；该方法制得的Cu/PAA复合生物膜材料具有良好抗菌性能并且可促进成骨相关细胞增殖。

本发明的一种Cu/PAA复合膜，所述复合膜的结构为：纳米Cu通过交流电沉积均匀分布在PAA的孔道结构内。

上述交流电沉积在PAA表面多孔结构中由孔底向外组装纳米Cu，使得Cu均匀分布于PAA多孔结构内。

所述纳米Cu的尺寸为8－46nm，PAA的孔道尺寸为25－75nm。

本发明的一种Cu/PAA复合膜的制备方法，包括：

(1)将多孔阳极氧化铝PAA进行减薄阻挡层和扩孔预处理；

(2)将步骤(1)中预处理得到的PAA加入电沉积液中，进行外加交流电沉积，得到Cu/PAA复合膜；其中，电沉积液为CuSO₄·5H₂O、(NH₄)₂SO₄、H₃BO₃的混合液；交流电压为5V－15V，沉积时间为2s－10s。

所述步骤(1)中PAA的制备方法包括：将高纯铝(99.999％)在C₂H₂O₄·2H₂O溶液体系中进行两次阳极氧化，得到PAA。

所述C₂H₂O₄·2H₂O溶液的浓度为0.4M；阳极氧化的条为：40V，0～2℃，每次阳极氧化的时间为2～3h。

所述步骤(1)中减薄阻挡层的方法为：将PAA进行阶梯降压处理；扩孔的方法为：PAA浸入H₃PO₄溶液中进行扩孔。

所述阶梯降压速率为1－2V/30s，阶梯降压下限为2V－6V；H₃PO₄溶液的浓度为5wt.％，扩孔温度为45℃，扩孔的时间为55min－65min。

所述步骤(2)中电沉积液中CuSO₄·5H₂O浓度为8.0wt.％－10.0wt.％，(NH₄)₂SO₄浓度为1.0wt.％－2.0wt.％，H₃BO₃浓度为2.0wt.％－2.5wt.％；使用1mol/L H₂SO₄溶液调节电沉积液pH至3.0。

所述Cu/PAA复合膜应用于同时具备抗菌性能和促进成骨细胞粘附增殖的医用涂层的制备。

本发明利用电化学阳极氧化工艺制备多孔阳极氧化铝(PAA)，运用交流电沉积技术在其孔道结构内组装纳米Cu生物活性粒子，赋予材料表面抗菌性能和促进成骨细胞增殖作用，以期望获得良好的抗菌性能，促进成骨相关细胞的黏附、增殖。

本发明利用交流电沉积技术可以实现各种金属在PAA孔道内的组装，并且可以通过改变电沉积时间对孔道内金属沉积量进行有效控制。通过运用交流电沉积在PAA表面多孔结构中由孔底向外组装纳米Cu，使得Cu均匀分布于PAA多孔结构内。通过改变电沉积时间有效地控制孔道内Cu装载量，以期望获得同时具备抗菌性能和促进成骨细胞增殖的新型医用涂层。

采用场发射扫描电镜(FESEM)观察PAA、Cu/PAA表面形貌，并用X-射线能谱分析法(EDS)分析材料元素组成。为了进一步确定Cu/PAA中Cu元素的价态，对其进行了X射线光电子能谱(XPS)扫描。

有益效果

(1)本发明的制备方法简单高效，成本低廉；可以通过控制电沉积时间，有效控制铜的装载量；

(2)本发明方法制备得到的Cu/PAA仍然保持了PAA表面的纳米多孔结构；

(3)本发明方法中制备得到的纳米Cu分布均匀、分散性好；

(4)本发明方法制备得到的Cu/PAA抗菌效率高，对大肠杆菌的抑菌率在82％±11％，对金黄色葡萄球菌的抑菌率达到89％±4％；

(5)本发明方法制备得到的Cu/PAA可明显促进乳鼠成骨细胞增殖。

附图说明

图1为实施例2中PAA(A、C、E)、Cu/PAA(B、D、F)表面纳米结构放大20.0K、50.0K、100.0K的FESEM图；

图2为实施例2中Cu/PAA的XRD图谱；

图3为实施例3中Cu/PAA的XPS图谱；

图4为实施例3中Cu/PAA XPS的Cu元素分峰图谱；

图5为实施例1中PAA、Cu/PAA对于E.coli(A1、B1)和S.aureus(A2，B2)抗菌效果鉴定图；

图6为实施例1中PAA、Cu/PAA分别对于E.coli和S.aureus抗菌率统计图；

图7为实施例1中PAA、Cu/PAA对于乳鼠成骨细胞增殖促进作用统计图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

(1)高纯铝片作为阳极，以石墨板作为对阴极，采用40V直流恒压在2℃的0.4M C₂H₂O₄·2H₂O溶液中进行两次阳极氧化，第一次阳极氧化2h，第二次阳极氧化3h，得到PAA；

(2)二次阳极氧化结束后立即进行阶梯降压，降幅1V/30s，阶梯降压下限为2V，去离子水冲洗；

(3)在45℃条件下，采用5wt％H₃PO₄溶液对氧化铝薄膜进行扩孔，时间为55min；

(4)预先配制CuSO₄·5H₂O浓度为10.0wt.％、(NH₄)₂SO₄浓度为2.0wt.％、H₃BO₃浓度为2.5wt.％的混合溶液作为电沉积液；

(5)步骤(3)中得到的PAA用去离子水清洗后立即浸入电沉积液中，以石墨板为对电极进行电沉积，外加交流电电压10V、时间10s，制得Cu(10s)/PAA，沉积完成后去离子水冲洗，自然风干；

将PAA、Cu/PAA用于抗菌性能和乳鼠成骨细胞增殖性能的评价。

抗菌性能的测试采用如下方法：

实验菌种采用大肠杆菌(E.coli，ATCC 8099)和金黄色葡萄球菌(S.aureus，ATCC 6538)。取一定量的菌种接种于50mL的LB培养基中，于37℃的恒温摇床上160rpm培养18h－24h，以备抗菌实验测试。实验样品及测试中所用器材经121℃高温灭菌20min；从恒温摇床培养后的菌液中取出1mL的菌悬液加入到9mL的磷酸盐缓冲溶液(PBS)的试管中，震荡均匀，再取1mL到另一支9mL的PBS试管中，原菌液被稀释100倍；稀释后的菌液1mL接种于装有规格为10mm×10mm的材料的24孔板中，使菌液浸没材料，其中用PAA作为对照组；样品于菌液在37℃的恒温培养箱中培养16h－24h后，吸去孔中多余菌液，用1mL的无菌PBS轻轻洗去材料表面没有粘附上的细菌，重复三次；将材料移入试管中，加10mL PBS，塞紧塞子，超声5min，将贴附在材料表面的细菌洗脱下来；洗脱后的菌液用PBS稀释适当的倍数后，取100μL在LB固体培养基上涂板，平行涂3个，在37℃的恒温培养箱中培养18h－24h后计数取平均值，然后进行换算得到试管中的细菌存活数。按照如公式计算抗菌样品的抑菌率：

式中：

C-对照样接种并培养24h后测得的细菌数的平均值；

T-实验样接种并培养24h后测得的细菌数的平均值。

成骨细胞的增殖实验采用CCK-8法，实验方法如下：

从1日龄乳鼠中取原代成骨细胞培养传代后用于后续实验。取对数生长期的成骨细胞，调节细胞的浓度，使得细胞的密度为5×10³个/孔，将细胞接种到事先加有灭菌过的PAA薄膜的24孔板中，每孔加入400μL培养液并使细胞悬液在材料整个表面铺展开来，将接种了细胞的多孔板放入37℃，5％CO₂的培养箱中，培养过程中根据消耗情况及时更换培养基。具体操作均在超净台内完成。为了定量比较细胞在各种材料上的增殖情况，分别在培养1天、2天和3天后取样进行细胞活性检测。具体测试步骤如下，在特定的时间点，取出种植有细胞的PAA、Cu/PAA薄膜，置于新的24孔培养板中，用PBS轻轻漂洗材料以去除未贴附的细胞。每孔加入0.5mL新鲜培养液，避光条件下每孔加入20μL CCK-8试剂，放置于培养箱中遮光培养3h后，利用酶联免疫检测仪测定在波长为450nm处测定OD值。每次实验重复3次，每组样品设置5个复孔。

根据上述方法得到的抗菌效果如图5、图6所示，乳鼠成骨细胞增殖统计如图7所示。图5、图6表明Cu/PAA对E.coli和S.aureus均具有明显抗菌作用；同时，从图中可以看出Cu/PAA对两种细菌均有显著杀菌效果；Cu/PAA抗大肠杆菌的效率达到82％±11％，抗金黄色葡萄球菌的效率达到89％±4％。图7表明Cu/PAA对乳鼠成骨细胞的黏附和增殖具有显著促进作用。

实施例2

(1)以高纯铝片作为阳极，石墨板作为对阴极，以40V直流恒压在0℃的0.4M C₂H₂O₄·2H₂O溶液中进行两次阳极氧化，第一次阳极氧化3h，第二次阳极氧化3h，得到PAA；

(2)二次阳极氧化结束后立即进行阶梯降压，降幅2V/30s，阶梯降压下限为6V，去离子水冲洗；

(3)在45℃条件下，采用5wt％H₃PO₄溶液对氧化铝薄膜进行扩孔，时间为65min；

(4)预先配制CuSO₄·5H₂O浓度为9.0wt.％、(NH₄)₂SO₄浓度为1.5wt.％、H₃BO₃浓度为2.0wt.％的混合溶液作为电沉积液；

(5)步骤(3)中得到的PAA用去离子水清洗后立即浸入电沉积液中，以石墨板为对电极进行电沉积，外加交流电电压10V、时间10s，制得Cu(10s)/PAA，沉积完成后去离子水冲洗，自然风干；

(6)采用场发射扫描电镜(FESEM)观察样品表面微观结构，如图1所示；采用X射线衍射(XRD)分析样品表面物象，如图2所示。

(7)图1A、1C、1E表明，PAA表面纳米孔直径均匀，图1B、1D、1F表明，纳米Cu充分装载进PAA纳米孔道，并且完整地保持了PAA表面原有的纳米多孔结构；

(8)图2中看出纳米Cu沿Cu(111)晶面择优取向，没有明显杂峰；

(9)将PAA、Cu/PAA用于抗菌性能和乳鼠成骨细胞增殖性能的评价，同发明内容中的性能评价；所得PAA、Cu(10s)/PAA基本特性与实施例1相似。

实施例3

(1)以石墨板为阴极，高纯铝片作为阳极，在0℃的0.4M C₂H₂O₄·2H₂O溶液中以40V直流恒压进行两次阳极氧化，第一次阳极氧化2h，第二次阳极氧化2.5h，得到PAA；

(2)二次阳极氧化结束后立即进行阶梯降压，降幅2V/30s，阶梯降压下限为4V，去离子水冲洗；

(3)在45℃条件下，采用5wt％H₃PO₄溶液对氧化铝薄膜进行扩孔，时间为60min；

(4)配制CuSO₄·5H₂O浓度为8.0wt.％、(NH₄)₂SO₄浓度为1.0wt.％、H₃BO₃浓度为2.0wt.％的混合溶液作为电沉积液；

(5)步骤(3)中得到的PAA用去离子水清洗后立即浸入电沉积液中，以石墨板为对电极进行电沉积，外加交流电电压13V、时间5s，制得Cu(5s)/PAA，沉积完成后去离子水冲洗，自然风干；

(6)采用X射线光电子能谱分析样品表面元素组成和重要元素价态，如图3所示。

(7)由图3可知，Cu/PAA主要含有Cu、O、Al、C、S等元素，由图4可知Cu/PAA中Cu元素为0价和+2价；

(7)将PAA、Cu(5s)/PAA用于抗菌性能和乳鼠成骨细胞增殖性能的评价，同发明内容中的性能评价；所得PAA、Cu/PAA基本特性与实施例1相似。