一种微电极阵列及其用于化合物电化学合成的方法

1.本发明涉及化合物电化学合成方法，特别涉及一种化合物微阵列并行合成法。


背景技术：

2.高通量快速低成本dna合成是合成生物学、dna信息存储以及dna芯片等前沿科技领域的重要核心技术之一。合成生物学的高速发展引领第三次生物技术革命，dna作为生命遗传物质的载体，是绘制各种人工生命系统蓝图的基础。与此同时，人类获取信息能力一直在快速增强，每年全球获取信息的总量超过100zb量级。dna分子具有大信息容量、稳定性好、读取过程能耗低等特点，其作为未来新的信息存储介质正受到越来越多的关注。正是上述新兴研究领域对dna合成片段的巨大需求加速了对dna合成技术发展的重新关注。目前基于合成柱的dna合成通量低，最大合成柱仪器的只有1536种，成本在0.05～0.17元/碱基，无法满足未来dna合成的需求。同时基于酶等dna合成技术尚未成熟，其发展还存在一定的不确定性。因此，发展基于不同序列并行合成的dna微阵列固相化学合成技术，仍然是快速、低成本获得dna序列的一条重要技术路径。
3.在现有商业化的dna微阵列中，affymetrix公司的genechip
tm
最有高密度，107dna序列/cm2，但序列合成长度较短(小于60nt)；其它dna合成长度超过100nt的微阵列，如twist bioscience、customarray的dna微阵列芯片阵点(feature)大小一般为100μm，如customarray公司为客户定制12k、4
×
2k等不同类型的电化学合成dna微阵列等。理论上，如果dna微阵列的阵点大小能从现有100μm降至1μm水平，其阵点数目将由现在的104/cm2提升至108/cm2、增加10 000倍，(如果不考虑芯片的加工成本)其合成费用也将降低1万倍。虽然dna微阵列不同原位化学合成法，其限制提升微阵列合成密度的关键因素不尽相同，但本质是其生化反应，即如何消除或者减少不同序列合成时的污染；也就是说，在选择某些阵点合成某个碱基时，如何避免反应试剂污染到临近非合成区域的阵点、导致错误碱基的合成。基于cmos芯片的电致酸dna原位化学合成技术，在选择性电致酸脱保护时，会发生酸扩散到临近非脱保护区域阵点，导致错误的碱基序列合成，同时芯片上微电极间氢离子串扰问题尚未解决，更高密度的dna微阵列序列难以合成，由此导致了成本增加。


技术实现要素：

4.发明目的：本发明的目的在于提供一种微电极阵列及其用于化合物电化学合成的方法。
5.技术方案：本发明的微电极阵列，微电极阵列由若干微电极对组成，单个微电极对由阳极通过绝缘隔离层和外围的阴极构成，单个微电极对在加入电解液后构成电解池，每个电解池的阳极均可由外围电路单独控制，所有的阴极则可以连通为一个电极；单个微电极对还可以由阴极通过绝缘隔离层和外围的阳极构成，单个微电极对在加入电解液后构成电解池，每个电解池的阴极均可由外围电路单独控制，所有的阳极则可以连通为一个电极；阳极或阴极表面可以用于化合物的电化学合成，微电极阵列可以用于不同化合物的并行合
成。
6.进一步地，所述微电极阵列中阳极、阴极、及其绝缘隔离层可以属于同一平面层，也可以分属于不同的平面层。
7.进一步地，所述微电极阵列中单个微电极对可以是圆形、正方形、长方形、或者多边形；所述微电极对尺寸为直径或者对角线为0.1～1000微米。
8.进一步地，所述微电极阵列的材料对化合物合成的溶剂、试剂是惰性的，阳极、阴极材料均为优良的导电材料，包括金属、合金、非金属。
9.进一步地，所述绝缘材料为高电阻的非金属、非金属化合物。
10.进一步地，所述电解液包含在阳极能够电解出氢离子的物质，包括对苯二酚、1,2
‑
二(4
‑
羟基苯)
‑
1,2
‑
二苯乙烯、二苯肼、高氯酸四乙基胺；电解液包含在阴极能够将氢离子被还原的物质，包括苯醌、蒽醌；电解液包含稳定的电解质，包括四乙基对甲苯磺酸胺、六氟磷酸四丁基铵；电解液包含稳定溶剂，如乙腈、二氯甲烷、甲醇，及其三者的混合物。
11.进一步地，所述电化学反应采用直流电模式，电压范围在1.0～3v，电化学反应施加在不同阳极电极的电压相差不超过0.05v。
12.进一步地，所述电压范围优选在1.5
‑
1.8v。
13.进一步地，所述化合物由有限个单体构成的聚合物，包括dna、rna、多肽、多糖。
14.本发明的一种微电极阵列及其用于dna电化学合成的方法，包括如下步骤：
15.(1)微电极阵列表面修饰：
16.(a)表面活化：将微电极阵列在氧化剂中浸泡10分钟，分别用自来水、去离子水洗涤，95％乙醇充分冲洗，除去表面残酸，干燥；进入步骤(b)；
17.(b)硅烷化：清洗好的微电极阵列置于5％的n
‑
(三乙氧基硅丙基)氨基羰基
‑
聚乙烯氧化物甲苯中，常温反应4h，然后用甲苯洗涤三次，在90度下维持反应1h，冷却至室温；进入步骤(c)；
18.(c)丁二酸连接反应：将上述硅烷化反应的微电极阵列至于0.1m的丁二酸，0.01m的4
‑
二甲氨基吡啶，0.1m的1
‑
(3
‑3‑
氨丙基
‑3‑
乙基羧酸盐酸盐于22毫升三乙胺：无水吡啶两者体积比10:1中，室温反应16h；分别用甲醇、二氯甲烷洗涤3次；进入步骤(d)；
19.(d)带dmt单体分子的连接：将上述连接丁二酸的微电极阵列至于0.1m的dmt
‑
核苷(如5
’‑
二甲氧基三苯基脱氧胸腺嘧啶核苷等)，0.01m的4
‑
二甲氨基吡啶，0.1m的1
‑3‑3‑
氨丙基
‑3‑
乙基羧酸盐酸盐于22毫升三乙胺：无水吡啶两者体积比10:1中，室温反应16h，分别用甲醇、二氯甲烷洗涤3次；进入步骤(2)，
20.(2)dna微阵列的合成：
21.(a)选择性脱保护：将50mm对苯二酚、2.5mm蒽醌、50mm四乙基对甲苯磺酸胺的甲醇/乙腈两者体积比1:10的混合液通过dna合成仪器输送加入到由微电极阵列构建的反应池中，选择需要进行下一个碱基合成的所有微电极进行脱保护反应：电压，1.8v；反应时间1分钟；然后用乙腈冲洗3次；进入下列步骤(b)；
22.(b)单体的偶联反应：将0.1m单体与0.5m催化剂通过dna合成仪器输送加入到由微电极阵列构建的反应池中，常温反应30秒；然后用乙腈冲洗3次；进入下列步骤(c)；
23.(c)封闭反应：将封闭试剂a为无水乙酐:2，6二甲基吡啶:四氢呋喃＝1:1:8的体积比和封闭试剂b为n
‑
甲基咪唑：四氢呋喃＝17：83的体积比按照1：1体积比通过dna合成仪器
输送加入到由微电极阵列构建的反应池中，常温反应30秒；然后用乙腈冲洗3次；进入下列步骤(d)；
24.(d)氧化反应：将0.1m的氧化剂包括质量比：3％碘：2％水：20％吡啶：75％四氢呋喃通过dna合成仪器输送加入到由微电极阵列构建的反应池中，常温反应30秒；然后用乙腈冲洗3次；进入步骤(e)；
25.(e)重复(2)中(a)～(d)，直到电极微阵列上所有碱基合成；进入下列步骤(f)；
26.(f)氨解反应：将浓氨水加入到由微电极阵列构建的反应池中，常温反应15分钟；然后用收集反应液，并用浓氨水洗涤三次、并一同收集；收集后的反应液在60℃下反应5小时，然后在真空下抽干；进入下列步骤(g)；
27.(g)dna序列的纯化：选择高效液相色谱hplc或者聚丙烯酰胺凝胶电泳page纯化。
28.有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
29.1.微电极阵列中单个微电极对由阳极通过绝缘隔离层和外围的阴极构成，使得电解时阳极产生的h
+
只在阳极表面发生脱保护反应，而h
+
一旦扩散到阴极、即被还原而失去酸性，而当扩散到阴极的氢离子的速度小于氢离子在阳极被还原的速度时，h
+
扩散层被阻断、不在继续扩散到临近非脱保护区域干扰dna序列的合成。这将增加化合物微阵列电化学合成密度，大幅度降低合成化合物的价格。
30.2.本发明适用面广，可以直接采用商品化的试剂用于dna、rna、多肽微阵列的合成，降低化学物合成成本。
附图说明
31.图1是本发明所设计的一种单个微电极对结构示意图；
32.图2是本发明所设计的一种微电极阵列结构示意图；
33.图3是本发明所设计的一种微电极阵列电路选择性控制示意图。
具体实施方式
34.下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。
35.本发明的微电极阵列由若干微电极对组成，单个微电极对由阳极通过绝缘隔离层和外围的阴极构成，单个微电极对在加入电解液后构成电解池，每个电解池的阳极均可由外围电路单独控制，所有的阴极则可以连通为一个电极；单个微电极对还可以由阴极通过绝缘隔离层和外围的阳极构成，单个微电极对在加入电解液后构成电解池，每个电解池的阴极均可由外围电路单独控制，所有的阳极则可以连通为一个电极；阳极或阴极表面可以用于化合物的电化学合成，微电极阵列可以用于不同化合物的并行合成。如图1、图2所示，其中图1中，(a)为俯视图，其中1为阴极、2为绝缘层、3为阳极；(b)为侧视图，其中1为阴极、2为绝缘层、3为阳极、4为阳极引线、5为硅片。图2中，1为阴极、2为阳极、3为阳极引线。通过互补金属氧化物半导体(cmos)制备微电极阵列集成电路芯片。
36.图3是本发明所设计的一种微电极阵列电路选择性控制示意图。图中，1为单个阳极，2为所有阴极连接线。
37.微电极芯片及其dna微阵列的合成：
38.(1)微电极阵列芯片的制备：根据需要合成的dna序列数目，如图1、图2、附图3所
示，设计微电极阵列芯片，并委托加工。
39.(2)微电极阵列表面修饰：
40.(a)表面活化：将微电极阵列在氧化剂(如5％的h2o2水溶液、10％重铬酸钾水溶液等)中浸泡10分钟h，分别用自来水、去离子水洗涤，95％乙醇充分冲洗，除去表面残酸，干燥；进入步骤(b)。
41.(b)硅烷化：清洗好的微电极阵列置于5％的n
‑
(三乙氧基硅丙基)氨基羰基
‑
聚乙烯氧化物(n
‑
(triethoxysilylpropyl)
‑
o
‑
poly(ethylene oxide)urethane)甲苯中，常温反应4h，然后用甲苯洗涤三次,
42.在90度下维持反应1h，冷却至室温；进入步骤(c)。
43.(c)丁二酸连接反应：将上述硅烷化反应的微电极阵列至于0.1m的丁二酸，0.01m的4
‑
二甲氨基吡啶，0.1m的1
‑
(3
‑3‑
氨丙基
‑3‑
乙基羧酸盐酸盐于22毫升三乙胺：无水吡啶(＝10:1体积比)中，室温反应16h。分别用甲醇、二氯甲烷洗涤3次；进入步骤(d)。
44.(d)带dmt单体分子的连接：将上述连接丁二酸的微电极阵列至于0.1m的dmt
‑
核苷(如5
’‑
二甲氧基三苯基脱氧胸腺嘧啶核苷等)，0.01m的4
‑
二甲氨基吡啶，0.1m的1
‑
(3
‑3‑
氨丙基
‑3‑
乙基羧酸盐酸盐)溶于22毫升三乙胺：无水吡啶＝10:1(体积比)中，室温反应16h。分别用甲醇、二氯甲烷洗涤3次；进入步骤(3)。
45.(3)dna微阵列的合成：将所有需要合成的dna序列分成若干个循环，每个循环只合成一个碱基(用相应软件控制下列合成步骤)。
46.(a)选择性脱保护：如图3所示。将50mm对苯二酚、2.5mm蒽醌、50mm四乙基对甲苯磺酸胺的甲醇/乙腈(1:10)混合液通过dna合成仪器输送加入到加入到由微电极阵列构建的反应池中。选择需要进行下一个碱基合成的所有微电极进行脱保护反应：电压，1.8v；反应时间1分钟；然后用乙腈冲洗3次；进入下列步骤(b)。
47.(b)单体的偶联反应：将0.1m单体(如：n6
‑
甲基
‑
2'
‑
脱氧腺苷亚磷酰胺；da
‑
ce phosphoramidite)与0.5m催化剂(如：5
‑
乙硫基四氮唑)通过dna合成仪器输送加入到由微电极阵列构建的反应池中，常温反应30秒；然后用乙腈冲洗3次；进入下列步骤(c)。
48.(c)封闭反应：将封闭试剂a(无水乙酐:2，6二甲基吡啶:四氢呋喃＝1:1:8(体积比)和封闭试剂b(n
‑
甲基咪唑：四氢呋喃＝17：83(体积比))按体积比1：1通过dna合成仪器输送加入到由微电极阵列构建的反应池中，常温反应30秒；然后用乙腈冲洗3次；进入下列步骤(d)。
49.(d)氧化反应：将0.1m的氧化剂(3％碘：2％水：20％吡啶：75％四氢呋喃(质量比))通过dna合成仪器输送加入到由微电极阵列构建的反应池中，常温反应30秒；然后用乙腈冲洗3次；进入步骤(e)。
50.(e)重复(3)中(a)～(d)，直到电极微阵列上所有碱基合成。完成dna微阵列的合成；并依据需要选择是否入下列步骤(f)和(g)。
51.(f)氨解反应：将浓氨水加入到由微电极阵列构建的反应池中，常温反应15分钟；然后用收集反应液，并用浓氨水洗涤三次、并一同收集；收集后的反应液在60℃下反应5小时，然后冷却、并在真空下抽干；进入下列步骤(g)。
52.(g)dna序列的纯化：选择高效液相色谱(hplc)或者聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)纯化。