专利名称：操纵单独液滴形式的液体样本以便对其进行化学和生物化学处理的激光解吸装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种对液体样本进行微流体分析(analysemicrofluidique)的集成系统，其尤其应用于(但不限于)激光解吸分析，其对单独液滴形式的液体样本进行操作以便对液体样本进行化学和生物化学处理。
激光解吸可使存在于表面上的物质蒸发。这种效应伴随着存在于表面上的分子的离子化。这种现象已经应用于名为MALDI(Matrixassisted Laser Desorption Ionization，基质辅助激光解吸离子化)的质谱分析中。在MALDI中，激光束的能量被基质先储存起来，然后释放。所述基质最常见的是有机物，但是也可以包含吸收范围在激光束波长范围内的纳米颗粒。
为了在样本的MALDI质谱分析中获得令人满意的结果，应当包含非常微量的无机盐，其浓度一般大约在千分之一以下。因此，一般，在进行MALDI质谱分析之前，要将样本进行脱盐处理，这导致了一些额外的步骤，降低了该方法的灵敏度。最常用的技术是在接枝烷链 型的疏水柱上进行脱盐处理。也可以使用一些使用阳离子或者阴离子树脂的特殊脱盐处理。
一般而言，对于针对任何液体的浸润性，不加区别地使用形容词“浸润的”或者“亲水的”；而对于针对任何液体的不浸润性，则说“不浸润”或者“疏水的”。
另外，大部分生物样本都是复杂的，包括数百甚至成千上万种不同的分子。一般，一种组织中包含的蛋白质的胰蛋白酶消化产物(digestat trypsique)包含一万到十万种不同的肽(peptide)。这就是为什么这些样本要象ICAT(Isotope Coded Affinity Tags，同位素编码亲合性标记)技术中那样使用亲合性色谱柱(colonnes d’affinité)，这除了其复杂性之外，还对方法的灵敏度有相当大的损害。另外，这些生物样本可获取的量也非常小，因此有必要设置一个检查范围来进行蛋白质分析(analyse protéomique)，这使得对人体采样的分析不可实现。
MALDI技术的实现最经常地是从金属表面开始的。为了使上面提到的缺点最小化，已经提出了这些金属表面的不同方案。第一种方案的目的是为了改善灵敏度。首先，一些表面或者仅仅是小的区域是金属，这使得样本局部集中。为了消除盐分，一些表面用刷状聚合物(polymère de type brosse)实现，这允许实现样本在原地脱盐。为了实现分离，阳离子或者阴离子树脂类型的表面允许将极性相反的单一化合物族固定下来。最后，结合了一些生物化合物(生物素(biotine)、抗生物素蛋白(卵白素，avidine)、抗体)的表面允许通过对复杂混合物的亲合力进行净化。
所有这些表面都是静态的，不包括任何允许对板上的样本进行移动和处理的流体系统。样本的放置或者是通过手工方式实现的，或者是由具有外部液体的吸附和放置头的自动系统实现的。
微流体技术目前进展迅速，并试图在生物学领域、分析化学领域以及化学工程领域引入新的解决方案，例如使用新的分析方法。系统的尺度的缩小产生许多正面效果，比如空间减小、反应时间或者交换时间变短，以及将多个具有不同功能的模块，比如输送模块、处理模块、分析模块，集成到例如同一片硅晶片上。
可以有两种流体移动方式连续的流体泵吸，以及标定的微量液体的移动。标定微量液体的泵吸需要的量比连续流体的泵吸要小，更容易对流量加以控制。通过控制允许例如对液体加以混合的时间常数，可以更加容易实现。在文献中描述了这种泵吸的多种方式使用气动作用或者表面声波的泵吸，利用双向电泳效应的泵吸，利用电浸润(électromouillage)以及电介质电浸润(électromouillage surdiélectrique，电介质上电浸润)。后一种泵吸方式技术上的实现比较简单，可以控制在微管道网络中的液体循环和流量。
目前，利用电浸润(英文是electrowetting)原理的移动装置需要两个相对的基片或者单个基片(Creating，Transporting，Cutting，and Merging Liquid Droplets by Electromouillage-Based Actuationfor Digital Microfluidic Circuits，Sung Kwon Cho，Hyejin Moon，andChang-Jin Kim，Journal of Microelectromechanical Systems，VOL.12，No.1，Feb.2003，pp.70-80)。
具有两个相对的基片的系统需要在两个基片中的至少一个基片上的叉指型电极，在两个基片中的至少一个基片上的由非金属、金属、过渡金属的无机氧化物、聚合物或者这些不同物质的组合构成的至少一个绝缘层，以及在每一个基片上的疏水层，并有或者没有接地线。所述疏水层是移动的关键。如果没有疏水层，则不可能进行移动，如所引用的文献所述(Electrowetting-based icrofluidic devicesdesignissues，C.Y.Chen，E.F.Fabrizio，A.Nadim and J.D.Sterling，SummerBioengineering Conference 2003，pp.1241-1242)。
所述疏水层是一种表面能低、化学耐性优异的材料。因此，非常难以在不改变和/或破坏疏水层表面的完整性的情况下在疏水层上进行局部表面化学处理、附着或接枝(greffage)。这对于液体的移动来说降低或者消除了电浸润的功效。因此，这种覆盖有疏水层的系统的使用先天地仅仅局限于液体的移动。
因此，为了获得一种例如允许处理生物样本的系统，应有一些与液体相互作用(反应)的功能化区域。既然疏水层阻止了对液体要接触的区域预先进行功能化，为了对此加以弥补，所提出的方案在疏水材料中建立一些亲水的窗口。这些亲水窗口也称作开口区或者开口，因此可以对它们进行化学处理，液体可以与该表面进行相互作用(反应)。
本发明涉及对单独液滴形式的液体样本进行操作以便对其进行化学或者生物化学处理的激光解吸装置。
激光解吸装置包括至少一个装载液体样本的接触片，至少一个由叉指型电极构成的输送轨道(piste)，至少一个化学或者生物化学处理区，以及一个向进行激光解吸的至少一个导体接触片进行引导的系统。
本发明采用绝缘基片的形式，在基片上布置有叉指型电极，叉指型电极以一个可功能化的上部绝缘层与被移动的样本绝缘，该绝缘层是非金属、金属、过渡金属的氧化物，或者是聚合物，或者是这些不同物质的组合。然后设置露出一些浸润区的非浸润层。该所谓的局部浸润的层露出所述可功能化的绝缘层。在经过处理以后，所述非浸润层中的这些开口构成处理模块的功能化区。
所述系统可以是相对的两个基片的形式。在一个基片上设置样本或者试剂的输送轨道。在第二个基片上设置功能化区。这两个基片的组合被一个空间分开，该空间用电绝缘的、与所输送的液体不溶混的的流体填充。
除了处理模块之外，该系统可以包括——允许引入生物样本以及分析所需的液体(漂洗溶液等)的模块；——允许将液体分为多个液滴的模块；——一个或者多个生物化学反应模块。蛋白质分析的例子有亲合力模块，消化(分解，digestion)模块，脱盐模块；——处理区和分析区之间的过渡模块；——分析模块，其例如将要分析的样本置于—些接触片(plot)上，在这里，可以添加基质(matrice)，可以对其进行MALDI质谱分析，或者进行光检测或者荧光检测。
更一般地说，本发明涉及对液体样本进行微流体分析的集成系统，其包括至少一个准备液体样本的装置(100)，该准备装置(100)包括用于引入所述样本和试剂，然后使它们向至少一个处理装置(200)迁移的移动装置(101)，该处理装置(200)对所述液体样本的液滴进行化学或者生物化学处理，其包括用于移动所述样本的液体，然后使其向至少一个分析所述液体样本液滴的分析装置(300)迁移的移动装置(201)，其特征在于，所述分析装置(300)是激光解吸分析装置，包括移动所述样本液滴的装置(301)以及至少一个将所述液滴导向独立的分析接触片的引导装置。
所述液体样本准备装置(100)可以包括至少一个液体装载台。
所述准备装置(100)可以包括至少一个用于放置液体的区域(102)。
移动装置(101、201、301)中的至少一个可以包括至少一个导体接触片，其覆盖有局部浸润层，该局部浸润层包括至少一个对所述导体接触区浸润的区域。
该系统可以包括夹在所述导体接触片和所述局部浸润层之间的绝缘层。
所述浸润区可能会被化学地或者生物化学地功能化。
所述化学或者生物化学处理装置(200)的移动装置(201)可以包括两个相对的基片，以及/或者至少一个将一个液滴分为多个液滴的装置，以及/或者消除多余的或用过的(usagers)试剂的装置。
移动装置(101、201、301)中的至少一个是通过电介质电浸润(électromouillage sur diélectrique)来移动的类型。
所述化学或者生物化学功能化区域是与被移动的液体反应的亲水区域。
所述分析装置(300)包括利用激光解吸-离子化的MALDI类型的分析装置，或者光检测类型的分析装置。
本发明还涉及利用激光解吸的液体样本分析装置(300)，其特征在于其包括移动样本液滴的装置(301)，以及至少一个将液滴向独立的分析接触片引导的装置。
移动装置(301)可以包括至少一个导体接触片，其覆盖有局部浸润层，该局部浸润层包括至少一个对所述导体接触片浸润的区域。
最好，所述装置包括夹在所述导体接触片和所述局部浸润层之间的绝缘层。
所述浸润区可以被化学或者生物化学功能化。这些区域可以是与被移动的液体反应的亲水区。
更好地，所述移动装置(301)是利用电介质电浸润进行移动的类型。
最后，所述装置还可以包括利用激光解吸-离子化(désorption-inoisation par rayonnement laser)的MALDI类型的分析装置，或者光检测类型的分析装置。
阅读下面对实施所述方法以及实现所述装置的各种优选变型的说明，将更加清楚和完整地呈现本发明的其它特征和优点，这些变型都是作为举例结合附图给出的，而不是限制性的。附图中
图1A到1C是具有集成的MALDI对象(靶)的生物样本分析装置的示意图；图2是在两个轨道之间移动液滴的装置的示意图；图3是在两个轨道之间移动液滴，并在上部轨道上具有功能化区的移动装置的示意图；图4是在一个轨道上移动液滴的装置的示意图；图5是利用MALDI质谱分析进行生物样本分析的装置的示意图；图6是MALDI对象(靶，cible)集成有三种分析前生物化学处理(浓缩、消化(分解)和脱盐)的生物样本蛋白质分析装置的示意图。
图1A到1C是生物样本分析装置的示意图，其中在图1A和1B中具有MALDI对象(靶)的立体图示，在图1C中是在垂直于液滴移动方向的方向上的剖面图。
在图1A到1C中，所述装置包括具有基片1的轨道。在该基片1上有叉指型电极2。
在所述电极2上，有例如由氧化物或者聚合物构成的绝缘电介质层3。在该绝缘电介质层3上，是非浸润层4。在层3和层4之间，导线5用作对电极(反电极，contre-électrode)。
与所述第一轨道相对地设置第二轨道，该第二轨道由局部浸润层形成，局部浸润层本身被覆以一个上层7，上层7上可以接枝一些生物化学功能8。该层7在基片9上，基片9可以用作对电极。隔离体10的使用可以使要用电绝缘流体填充的空间11对被传输的液滴保持不溶混。在该基片上，接触片12是导体，允许将携带要分析的物质的液滴在放置(淀积)用于MALDI分析的基质之前固定下来。
在接触片13上放置所述液体(例如样本液滴、试剂液滴等)。这样，所述液体进入基片1和9之间的化学或生物化学处理区，与功能化区8相互作用(反应)。移动接触片2允许将每一个单独的液滴(14)引导到接触片12之一。在放置基质的步骤之后，就是晶化和MALDI分析。
图2是在两个轨道之间移动液滴的装置沿着移动方向的剖面的示意图。该装置包括由层1、2、3、4构成的第一轨道和由层7、基片9以及非浸润层15构成的第二轨道。通过在电极2b和基片9之间施加电势差，液滴被约束在电极2b和基片9之间，使得液滴从电极2a向电极2b移动。
图3是在两个轨道之间移动液滴14的装置的在移动方向的剖面示意图，其中在上轨道上具有功能化区。该装置包括由层1、2、3、4构成的第一轨道和由层6、7、基片9以及功能化区8a到8d构成的第二轨道。通过在电极2b和基片9之间施加电势差，液滴被约束在电极2b和基片9之间，使得液滴从电极2a向电极2b移动。从而，液滴与功能化区8c和8d相互作用。
图4是在一个轨道上移动液滴的装置的示意图。图4A是在垂直于液滴移动方向的方向上的剖面图。图4B是该装置的俯视图。该装置包括由层1、2、3、4和5构成的轨道。通过在电极2c和线5之间施加电势差，使得液滴从电极2b向电极2c移动。
图5是利用MALDI质谱分析进行生物样本分析的装置的立体示意图。通过在电极2a到2h和线5之间依次施加电势差，可以移动液滴14并将其固定在接触片12a到12f之一上。然后是淀积基质、晶化和MALDI分析的步骤。
图6A到6C是生物样本蛋白质分析装置的示意图，其中MALDI对象(靶)集成有在分析之前的三种化学或者生物化学处理(浓缩、分解(消化)和脱盐)。其中，图6A和6B是立体图，图6C是垂直于液滴移动方向的方向上的剖面图。
该装置包括由层1、2、3、4和5构成的第一轨道以及由层6、7、基片9以及隔离体10构成的第二轨道。该装置包括允许消除过量或者已经用过的试剂的接触片16，用于MALDI分析的接触片12以及用于亲合性(affinité)、分解(消化)和脱盐的三个功能区8a、8b和8c。
在接触片13上放置液体(例如样本、试剂、漂洗剂等的液滴)。液体然后借助于施加电势差进入基片1和9之间的生物化学处理区。接触片17a和17b之间的过渡允许将引入的液体分为多个液滴。液滴然后被引导向第一亲合力接触片8a，在这里，所关心的蛋白质将固定下来。所述液滴然后被导向接触片16。漂洗溶液然后可以按照与前面相同的移动原理漂洗接触片8a。然后，专用溶液(比如变性剂缓冲剂混合物)允许释放感兴趣的分子，所述蛋白质被引导向蛋白质分解(消化)接触片8b。在分解(消化)步骤后，液滴被引导向脱盐接触片8c，然后被引向用于进行MALDI类型的分析的接触片之一。
下面的例子举例说明了前述装置的功能化及其使用。
例1允许进行生物样本处理的亲合力反应器。
在该装置中，未被疏水层覆盖的区域会经过表面处理，将其转化为活性表面，例如通过使用包括氨基(NH2)的支持表面，氨基上接枝了抗生蛋白链菌素(Streptavidine)。这样，将沿着电极路径移动的液滴固定在处理区上，对接枝表面具有亲合力的感兴趣的分子(例如蛋白质)将固定在这些表面上。当化学反应结束时，液滴继续其在装置中的行程。然后，专用混合物(例如变性剂缓冲剂混合物)通过这些区域，释放所述感兴趣的分子(例如通过破坏非共价相互作用)并将其带走。这样，该装置就可以将感兴趣的分子分离出来。
例2允许进行生物样本处理的分解(消化)反应器。
在该装置中，未被疏水层覆盖的区域会经过表面处理，将其转化为活性表面，例如通过使用包括氨基(NH2)的支持表面，氨基上接枝了胰蛋白酶(trypsine)。这样，将沿着电极路径移动的液滴固定在处理区上，感兴趣的分子(例如蛋白质)与接枝表面反应，接枝表面将分子分割，获得例如肽(在用胰蛋白酶消化的情况下)。然后，液滴继续其在装置中的行程。该装置允许借助于质谱分析来分析预先用特定的酶进行了分割的长链分子。
例3生物样本处理脱盐模块在该装置中，未被疏水层覆盖的区域经过表面处理，将其转化为活性表面，例如通过接枝18原子的含碳氢链，这相当于称为C18的反相色谱(phase de chromatographie inverse)。这样，将沿着电极路径移动的液滴固定在处理区上，感兴趣的分子(例如蛋白质)与接枝表面反应，接枝表面将分子分割。然后，液滴继续其在装置中的行程。该装置允许在用MALDI质谱分析进行分析之前实施脱盐处理。
权利要求
1.液体样本的激光解吸分析装置(300)，其特征在于包括移动所述样本的液滴的移动装置(301)，以及至少一个将所述液滴向独立的分析接触片引导的引导装置。
2.如权利要求1所述的装置，其特征在于所述移动装置(301)包括至少一个导体接触片，该导体接触片覆有局部浸润层，该局部浸润层包括至少一个对所述导体接触区浸润的区域。
3.如权利要求2所述的装置，其特征在于包括夹在所述导体接触片和所述局部浸润层之间的绝缘层。
4.如权利要求2或3所述的装置，其特征在于，所述浸润区被化学地或者生物化学地功能化。
5.如权利要求4所述的装置，其特征在于所述被化学地或者生物化学地功能化的区域是与被移动的液体相互作用的亲水区。
6.如权利要求1到5之一所述的装置，其特征在于，所述移动装置(301)是借助于电介质电浸润来进行移动的类型。
7.如权利要求1到6之一所述的装置，其特征在于包括利用激光解吸-离子化的MALDI类型的分析装置，和/或光检测类型的分析装置。
8.对液体样本进行微流体分析的集成系统，其特征在于包括至少一个准备液体样本的准备装置(100)，该准备装置(100)包括用于引入所述样本和试剂，然后使它们向至少一个处理装置(200)迁移的移动装置(101)，该处理装置(200)对所述液体样本的液滴进行化学或者生物化学处理，其包括用于移动所述样本的液滴，然后使其向至少一个分析所述液体样本的所述液滴的分析装置(300)迁移的移动装置(201)，其特征在于所述分析装置(300)是激光解吸分析装置，包括移动所述样本液滴的装置(301)以及至少一个将所述液滴导向独立的分析接触片的引导装置。
9.如权利要求8所述的系统，其特征在于所述液体样本准备装置(100)包括至少一个液体装载台。
10.如权利要求8或9所述的系统，其特征在于，所述准备装置(100)包括至少一个用于放置液体的区域(102)。
11.如权利要求8到10之一所述的系统，其特征在于所述移动装置(101、201、301)中的至少一个包括至少一个导体接触片，该导体接触片覆盖有局部浸润层，该局部浸润层包括至少一个对所述导体接触区浸润的区域。
12.如权利要求11所述的系统，其特征在于其包括夹在所述导体接触片和所述局部浸润层之间的绝缘层。
13.如权利要求11或12所述的系统，其特征在于，所述浸润区被化学地或者生物化学地功能化。
14.如权利要求8到13之一所述的系统，其特征在于，所述化学或者生物化学处理装置(200)的所述移动装置(201)包括两个相对的基片，以及/或者至少一个将一个液滴分为多个液滴的装置，以及/或者消除多余的或用过的试剂的装置。
15.如权利要求8到14之一所述的系统，其特征在于，所述移动装置(101、201、301)中的至少一个是通过电介质电浸润来移动的类型。
16.如权利要求13到15之一所述的系统，其特征在于，所述被化学地或者生物化学地功能化的区域是与被移动的液体反应的亲水区域。
17.如权利要求1到16之一所述的系统，其特征在于所述分析装置(300)包括利用激光解吸-离子化的MALDI类型的分析装置，和/或者光检测类型的分析装置。
全文摘要
本发明涉及一种对液体样本进行微流体分析的集成系统，其包括准备液体样本的装置(100)，其包括用于引入所述样本和试剂，然后使它们向对液体样本液滴进行化学或者生物化学处理的第二装置(200)，该处理装置也包括用于移动所述样本的液滴，然后使其向分析所述液滴的分析装置(300)迁移的移动装置(201)。本发明尤其应用于激光解吸装置，该解吸装置包括操纵液滴形式的样本和试剂的系统，该操纵系统具有一个或者多个装载接触片，一个或者多个由叉指型电极构成的输送轨道，一个或多个化学或生物化学处理区，以及至少一个向至少一个导体接触片引导的系统，在所述导体接触片上可进行激光解吸处理。
文档编号F04B19/00GK101035621SQ200580018224
公开日2007年9月12日 申请日期2005年6月6日 优先权日2004年6月4日
发明者让-克里斯托夫·弗利尔, 弗朗西丝·卡伦, 皮埃尔·塔伯利尔, 克里斯蒂安·德伦, 丹尼斯·洛奥克斯, 让-皮埃尔·莱皮森特, 克里斯蒂安·罗兰多 申请人:里尔科学技术大学, 国家科研中心, 赛诺菲-安万特公司