专利名称：对细胞进行膜片钳测定的方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用膜片钳技术对细胞或类似结构进行测定的方法以及进行所述测定的装置。
活细胞通过包围它们的脂膜产生一种内部微环境，从而确保细胞机制的功能。所述脂膜实际上是带电颗粒不能通过的。因此，由特化包埋的转运蛋白携带离子通过所述脂膜。它们体现了多种生理学功能的基础，包括细胞的电兴奋性，物质通过膜或细胞层的转运和细胞中的若干种电信号和化学信号。
Sakmann和Neher在1981年所开发的膜片钳方法，使细胞生物学研究发生了革命性变化。膜片钳技术能够通过离子转运蛋白以高的时间分辨率直接测定电流。实际上，这种方法是能够以几毫秒的时间分辨率实时测定一种特化蛋白分子的构象变化的唯一技术。例如，这种方法可以直接用靶蛋白评估信号分子或药理学制剂的作用。另外，这种技术可以精确控制膜的电和化学环境，并且在所述膜的两侧施加信号传导分子、药物等。
这种技术可以检验多种转运蛋白，包括有机和无机离子的生电离子转运蛋白，选择性和非选择性离子通道和其他孔诱导膜蛋白。离子通道包括电压控制的、配体控制的和储存操纵的通道，这些通道对钠离子、钾离子、钙离子和氯离子具有或不具有选择性。甚至可以测定膜结合蛋白内的电荷运动(门控电荷)。这使得所有膜结合蛋白都适用于所述技术，包括受体、酶、及其与其他蛋白或带电荷分子的相互作用。离子通道以特殊方式分布在组织中，并且以具有多种功能为特征。因此，它们是用于操纵组织专一性功能的药用化合物的理想目标。所述化合物的例子有利尿剂、抗糖尿病药物、抗癫痫药物、局部麻醉剂、抗心律不齐药物、某些抗生素等。膜片钳技术是分析所述化合物的生物学功能的一种非常灵敏的方法。这种方法的主要缺陷是具有复杂的实验程序，需要人工操纵，以及对测定化合物和转运蛋白的较低的处理能力。
膜片钳技术以若干种不同方式存在。所有存在形式都需要显微操作。在显微镜观察控制下，通过机械方式使细胞进入玻璃微量移液管，并且通过吸力结合在移液管上。这会导致在细胞膜和移液管顶端之间形成电紧密结合，这是对微小电流进行低噪音高分辨记录的前提。通过该技术的不同形式，记录了通过移液管顶端膜片或通过相反的膜片层的电流。
细胞膜和玻璃毛细管之间的紧密结合通常被称为“密封”。不同的密封质量，可以对不同类型的细胞和不同大小的离子电流进行实验研究。在1980年，Neher和Sakman披露了一种获得新的密封质量，即所谓的千兆欧密封的方法。这一发现获得了1991年度的诺贝尔奖，并且，千兆欧密封使得人们首次能够在小的哺乳动物、人类、昆虫和其他细胞内以皮安培范围内的电流精确测定离子电流。Neher和Sakman在1981年的文献中写到“细胞外膜片钳技术使得首次能够观察单一离子通道中的电流(Neher和Sakmann，1976)。在该技术中，将一个小的加热抛光的玻璃移液管压在细胞膜上，形成电阻为50兆欧级的电密封(Neher等，1978)。这种密封的高电阻能确保源于小的膜片的大部分电流流入移液管，并从这里进入电流测定电路。该密封的电阻之所以重要还因为它决定着记录中的背景噪音水平。
最近发现，当注意保持移液管表面清洁，并且对移液管内部施加吸力时，可以获得电阻为10-1000千兆欧的紧密的移液管-膜密封(Neher，1981)。我们称这种密封为“千兆欧密封”，以便区别于常规的兆欧密封…千兆欧密封同样是机械稳定的…可以在保持移液管-细胞结合的前提下破坏所述膜片。这样提供了一种进入细胞内部的直接低阻抗方法，它可以对小细胞进行电位记录和电压钳制”(Hamill，Marty，Neher，Sakmann，Sigworth，PflügersArch.39185-100，1981)。
“千兆欧密封”是在细胞到达移液管顶端以后的电阻和吸力达到千兆欧范围时所获得的。常见的数十个千兆欧的电阻表明，即使是诸如质子的小离子也不能从膜和玻璃表面之间通过。以前认为，必须在膜和移液管顶端边缘之间形成这样的千兆欧密封，所述移液管顶端是通过机械力和液压吸力接近所述膜的。采用这种千兆欧密封的新式操纵放大器，可以测定低至100fA(10-13A)范围内的直流电。在任何情况下，所测定的电流都表示通过所述膜的离子转运加上通过所述装置和制剂的峰电流的总和。
膜片钳技术非常缓慢，并且需要高度专业化的人员，特别是因为需要进行显微操作。在显微镜平台上用显微操作器接近单细胞并且施加吸力以便通过特定细胞的机械特性及其显微操作性密封移液管，这需要高水平的灵活性和经验。例如，在抽吸之前施加的机械力对于膜和移液管顶端的结合来说是很关键的。另外，所述密封在机械上是不稳定的，并且可能通过机械扰动和液压紊流(例如，溶液交换)而丧失。显微镜和显微操作器是必需的。这样妨碍了小型化和多个移液管排列的主要理想结构。
以上说明披露了膜片钳技术的多种潜在用途，有可能需要同时检查几种细胞，并且自动获得千兆欧密封。这一愿望受到了以下事实的妨碍，即必须通过机械方式使微量移液管的顶端与细胞膜密切接触。DE-A1-19744649披露了一种用排列的多个移液管检查多种细胞的装置和方法。不过，在该专利申请中，采用了向细胞膜机械转移所述移液管排列的相同原理(如上文所述)。WO99/66329披露了位于薄的平面基质上的一系列孔，这些孔用于施加细胞并且能同时检验多个细胞。这种多孔基质的生产复杂，成本昂贵，并且细胞与多个孔的结合是随机的、难于实现和控制。细胞与平面基质表面的密封在机械上是不稳定的，并且容易通过溶液交换而丧失。另外，在诸如WO99/66329所披露的或本领域技术人员所公知的其他经上皮测定装置(例如，使用腔室)中的孔的所有平面设计中，如果某些孔没有被细胞紧密密封的话，该实验就容易受到干扰。泄露的孔会导致严重的泄露电流，该电流比通过待测定离子转运蛋白的电流高若干个数量级。在这种结构中，会由于孔之间的电干扰，特别是泄露孔之间的电干扰产生严重问题。大的电容能导致电噪音和紊乱，从而降低该测定的时间分辨率。在测定电压控制的离子通道时这一点是特别重要的。
US6048722(相当于WO97/17426)披露了一种细胞生理学工作台，用于自动获取数据并进行灌注控制。该装置将爪蟾卵母细胞保持在巴斯德移液管顶端内，以便在卵母细胞膜和玻璃之间形成密封。这种密封的电阻不超过100-200兆欧。与哺乳动物细胞不同，爪蟾卵母细胞相当大。其外径大于1毫米。因此，它们具有庞大的膜表面积，并且包括比其他细胞高出若干数量级的离子通道，使得离子电流在数百至一千纳安培的范围内。因此，所谓的高阻抗密封(在10-200兆欧的数量级上)足以测定爪蟾卵母细胞中的大的电流。不过，这种细胞来源于两栖动物，并因此在研究哺乳动物和人类细胞的离子通道功能方面具有有限的用途。在直径通常为5-50微米的哺乳动物细胞上，离子电流通常只能达到1至数百个皮安培。为了测定如此小的电流，所述密封的阻抗必须比爪蟾卵母细胞高出若干个数量级，即在1-1000千兆欧，优选10-1000千兆欧范围内。如上文所述，本领域技术人员认为，玻璃移液管的边缘或边沿必须压在细胞膜上，以便获得这种千兆欧密封。从US6048722中也可以证实这一点，该专利披露了生物传感器的其他常规用途，该传感器在记录室内包括膜片钳移液管和注射针头。该技术同样需要在所述记录室内用诸如电极、针头和膜片钳移液管之类的探头进行额外的显微操作，以便固定爪蟾卵母细胞。以上要求导致了上文所述的相同的缺陷。
总之，本领域技术人员以前认为，必须在细胞膜和通过机械力和液压吸力接近所述膜的移液管顶端边缘之间形成千兆欧密封。
因此，本发明的目的是克服现有技术的所述缺陷。它是一种在膜和记录室或膜片钳技术所需要的保持基质之间获得千兆欧密封的新方法，它可以增加那些密封的机械稳定性。可以消除对视觉显微镜控制的需要。本发明可以获得记录制品的小的电容量，导致测定的信号具有小的介电波动(噪音)和高的时间分辨率。它能够通过膜片钳技术对多个细胞同时和/或快速进行测定。该装置可以方便地自动化，并且用简单的或现有的部件进行组装。该装置可以是微型化的，以便并行布置多个记录制品，并且将该装置整合到现有的实验室机械系统中。所述装置应当以如下方式单独安排多个记录制品记录室是以灵活的排列形式排列的，并且装有为了记录而制备的细胞的室可以方便地更换，并移动到所述排列中。多个记录制品之间应当能够形成电屏蔽。
本发明利用权利要求1所限定的方法和权利要求12所限定的装置至少部分解决了上述问题。在权利要求2-11和13-22中披露了所述方法和/或装置的优选实施方案。权利要求23-25披露了毛细管、毛细管和试剂盒的用途。所有权利要求书的文字以参考形式构成本说明书的一部分。
本发明提供了一种方法，其中，将一个细胞放置在毛细管腔内，并且在细胞膜和毛细管内壁之间获得了超过1千兆欧，优选10千兆欧阻抗的足够紧密的密封。在获得了千兆欧密封之后，就可以进行膜片钳实验，所述毛细管是锥形的，以便在该毛细管长度方向上具有至少一个内径小于待测定细胞外径的部位。
锥形表示这样一种形式的毛细管它能保持沿着该毛细管长度移动的细胞，并且避免该细胞的通过。锥形还意味着锥形形式的毛细管内壁，它能周向包围细胞，并且在毛细管的内表面和细胞表面之间形成紧密接触。因此，可以将毛细管设计成具有优选的圆形内部截面，并且沿其长度方向变窄形成锥体或喷嘴，以便保持并定位所述细胞，并且在细胞表面和锥形移液管的内表面之间形成紧密的密封。很显然，所述锥体的内直径、形状和陡度可以改变，以便适应不同的细胞直径。通过在所述锥体上采用非常小的内径，可以定位并保持非常小的细胞或亚细胞膜结构，例如线粒体、溶酶体或细菌。到目前为止，这种结构都是无法用膜片钳方法直接接触的，因为它们太小以至不能进行光学显微和显微机械操作。因此，本发明中的术语“细胞”包括由脂膜包围的任何生物学结构或人造结构。
在本发明中，术语“定位”表示细胞在锥体或毛细管中的足以进行膜片钳实验的任何固定作用，其中，在细胞膜和毛细管壁内表面之间获得了超过1，优选10千兆欧阻抗的足够紧密的结合或密封。
令人吃惊的是，可以在毛细管腔内表面和细胞膜之间获得在小的细胞(例如，哺乳动物细胞、人、植物、昆虫细胞)中测定离子电流所需要的千兆欧密封，并且在透化细胞膜的一侧之后，可以对所述细胞进行膜片钳实验，并且在进行所述实验时不需要诸如膜片钳移液管或注射针头的其他探头。对于本发明来说，只需要将所述细胞定位于毛细管的细小部分就足够了，并且不需要诸如针头、膜片钳移液管或显微操作器的其他装置就能获得千兆欧密封。另外，按照本发明方法获得的千兆欧密封是机械稳定的，并且能抗液压和机械扰动。通常它可以将装有密封细胞的毛细管从毛细管支架上取出，并将其转移到另一个支架上，而又不丧失千兆欧密封。千兆欧密封还能抗机械震动，例如敲打毛细管。可以在不破坏所述密封的前提下，用细小的管将液体注入所述毛细管中。
对于本发明来说，毛细管的长度并不重要。可以使用长度完全不同的毛细管。在一种优选实施方案中，毛细管的长度至少应该和完全放置在该毛细管内部的细胞一样。
以上说明证实，毛细管的变细部分或锥形部分能以不同方式实现。在一种简单的优选实施方案中，整个毛细管是锥形的，以便其内径沿着毛细管的长度逐渐或逐步降低。在本实施方案中，细胞将定位于毛细管锥形部分的内部截面直径接近细胞外径的地方。在另一种优选实施方案中，最小的截面位于毛细管的一端，所述细胞将从另一端导入该毛细管，以便将该细胞定位并密封在毛细管内靠近细的开口部分。
在另一种优选实施方案中，所述锥体位于一端，而所述细胞是从另一端导入所述毛细管，以便所述细胞定位并密封在小的开口中，并且所述细胞的一部分从开口中突出。这样可以快速更换细胞膜突出部分的溶液。
在一种优选实施方案中，所述锥形毛细管可以是类似于用于常规膜片钳实验的各种形式微量移液管的所谓微量移液管。本领域技术人员了解如何制造和生产这种微量移液管。通常，微量移液管是在加热(至少局部加热)之后，通过从熔融的中间部分分离毛细管的两端而从玻璃毛细管拉制而成的。熔融能确保移液管材料所需要的清洁表面，以便获得千兆欧密封。
在一种优选实施方案中，毛细管或移液管可以用诸如塑料(例如，聚苯乙烯)的不同非导电材料制成。在本发明的另一种优选实施方案中，毛细管或微量移液管是用玻璃制成的。业已证实玻璃能紧密密封生物膜，并且具有良好的介电性能。玻璃对于多种化学物来说是惰性的，并且容易清洗。另外，能够以低成本用标准玻璃生产技术生产出具有多种锥形直径的玻璃毛细管和微量移液管。在优选实施方案中，无论是什么样的材料，根据检查的生物学结构或所使用的细胞的直径，所述最细部分的锥形/开口的内径低于50微米，特别是低于10微米(μm)。所述直径的优选下限是50纳米(nm)。
在本发明的一种优选实施方案中，通过用悬浮在溶液中的细胞悬浮液填充或灌注所述毛细管，将细胞导入并定位于该毛细管内。例如，可以将细胞悬浮液填充到微量移液管的大的开口中，并且向细的开口部分施加吸力，导致细胞定位于该移液管的锥形部分。所述定位是通过流体和/或细胞的简单运动而实现的。一旦第一个细胞移动到所述锥体内，细胞表面和毛细管内壁之间的接触，就会将细胞密封在毛细管内，并且阻止液体流动。因此，其他细胞不能移动到所述锥体内。因此，通过一个步骤就实现了将细胞导入毛细管，并且将细胞定位在所述锥体内。根据本发明，优选施加5毫巴(0.5巴)至1巴的压力梯度，特别是5毫巴至500毫巴的压力梯度。
作为替代或补充，在本发明的另一种优选实施方案中，将细胞导入并定位于毛细管中可以通过沉降实现。在这种情况下，将毛细管固定在垂直方向上，并通过重力使细胞定位，优选作为对上述液压流的补充。
作为替代或补充，在本发明的另一种优选实施方案中，细胞在毛细管中的导入和定位可以通过离心实现。在这种情况下，通过离心使细胞悬浮液进入毛细管，并通过离心力对细胞进行定位，优选作为对上述液体流的补充。为了用细胞获得千兆欧密封，优选以2-20g的离心力进行。对于直径低于1微米的细菌和其他小的膜结构来说，优选以10-500g的离心力进行。
作为替代或补充，在本发明的另一种优选实施方案中，细胞在毛细管中的导入和定位可以通过机械震动或通过使用沿着毛细管的纵向施加的电场而实现或完成。另一种实施方案使用与所述细胞结合或包含在所述细胞内的磁性小球，并且使用磁场对所述细胞进行定位。另一种实施方案使用激光(光学镊子)对细胞进行定位。
在本发明的一种优选实施方案中，至少所述毛细管的锥形部分首先用生理溶液填充(优选通过消毒过滤器或通过离心进行净化)。然后将细胞悬浮液铺在所述溶液顶部。然后通过上述重力、离心力等使细胞穿过所述净化溶液层朝向所述锥体运动，如上所述。由于在大多数情况下细胞都重于细胞悬浮液中的膜片段和其他常见的污染性颗粒，这一过程能够在细胞进入毛细管的锥形部分的同时对细胞进行“漂洗”。另外，提高了完整细胞在任何其他颗粒之前进入所述细小的锥体部分的可能性。这样有效降低了能另外防止随后形成千兆欧密封的颗粒污染移液管锥形部分内表面的危险。
一般，对于本发明的优选实施方案来说，特别有利的是毛细管的内表面是非常光洁的，以便提供千兆欧密封，特别是具有非常高的阻抗的千兆欧密封。因此，在生产毛细管时优选使其具有非常光洁的内表面，特别是至少在该毛细管的锥形/细小部分具有非常光洁的内表面。另外，优选在将所述毛细管用于膜片钳实验之前甚至是在进行所述膜片钳实验期间保持所述内表面非常光洁。
根据本发明，为了用细胞在毛细管内产生千兆欧密封，优选满足以下四项技术要求中的至少一项。很明显，更优选能满足所有四项技术要求。
1.在锥形/变细部分的生产期间，熔化，优选完全熔化所述毛细管，以确保任何粉尘颗粒或污染物浸没到内表面以下。
2.在生产之后，通过将所述毛细管保持在非常清洁的环境中，避免污染其内表面，例如，通过在经过过滤(优选0.2微米的孔度)的空气流下将其密封在无菌容器中。
3.在实验期间避免污染其内表面，例如，用一种消毒过滤的溶液例如生理盐溶液填充至少所述锥形部分。
4.通过沉降和/或离心使细胞通过所述消毒过滤溶液层，避免在实验期间来自细胞悬浮液的污染性颗粒污染其内表面。
在优选实施方案中，在所述定位的细胞或膜结构上测定以下参数电压钳中的电流，电流钳中的电压，电阻，阻抗，电容量，光学荧光，胞质基因共振，机械共振，流动性和/或刚性。
在优选实施方案中，可以在进行膜片钳实验之前证实和/或控制细胞的定位。这一目的可以通过光学方法实现，例如通过分析激光对毛细管锥形部分的照明。在这种情况下，可以用染料、染料结合的抗体、配体、脂类等对所述细胞进行染色。可以选择染料，以便指示在细胞内或细胞表面的化学变化，并因此提供除了细胞在毛细管内的定位以外的生物学信息，例如细胞质溶胶的化学变化。优选通过测定通过所述毛细管的压力和/或流量来控制并证实细胞的定位。压力和/或流量的改变表明了细胞在毛细管锥形部分的定位。为了实现细胞的理想定位和细胞膜与毛细管内表面之间的紧密密封，可以调控，优选自动调控压力和流量。另外，优选测定沿毛细管的电阻，以便评估所述细胞相对锥形部分的定位并测定该密封的质量。然后可以调控定位力，以便改善该密封的阻抗。这样，可以控制液压力或离心力，以便获得不同类型细胞的细胞膜和毛细管内表面之间的最佳密封。
根据本发明，可以将一种新的毛细管或微量移液管用于每一个膜片钳实验。这样能确保将一个新的非常光洁的表面用于定位并密封一个新的细胞。在另一种优选实施方案中，所述毛细管在一次膜片钳实验之后可以再利用。为此，通过吸力/冲洗将所述细胞从毛细管中清除。然后对毛细管进行清洗，并准备好用于另一个膜片钳实验。毛细管的清洗优选通过用溶剂或化学物冲洗进行。作为补充或替代，可以将加热和超声波用于清洗毛细管内表面。
对本领域技术人员来说，显而易见的是可以用多种方式改进权利要求书中所限定的方法。例如，在将所述细胞密封在毛细管内壁上之后，溶液交换可以在细胞的两侧进行。溶液交换可以用试管或用于抽吸和/或冲洗等的出口进行。另外，可以在所述密封的一侧对所述细胞膜进行选择性地透化。为了实现这一目的，可以使用压力变化、超声波、电压跃变或透化化学物(例如，离子载体、表面活性剂、酶、溶剂)。可以通过所述溶液交换装置使用上述手段。选择性地透化一个膜表面能够使得其他膜表面的内侧可以接触施加到毛细管中的物质，并降低进入所述其他膜表面的电阻。根据本发明，不需要诸如针头的其他探头或机械移动所述探头使所述细胞膜破裂。
很显然，可以用本发明的方法检查多种不同类型的细胞。根据本发明，优选使用直径低于100微米，优选低于50微米的细胞或亚细胞结构(如上文所述)。更优选使用直径为30-3微米的细胞或结构。
举例来说，可以检查的细胞包括Jurkat淋巴瘤细胞、HEK293细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、来自神经元组织的原代细胞如海马状突起、神经节、神经内分泌细胞等；骨骼肌、平滑肌、心肌、免疫细胞；上皮细胞和内皮细胞等。另外，可以对细胞进行遗传工程改造。例如，离子转运蛋白可以在诸如CHO细胞的细胞系中表达。在一种优选实施方案中，可以在膜片钳实验之后，从所述毛细管中收集诸如DNA或RNA的遗传学材料。
在另一种实施方案中，本发明的方法可用于检查人造或天然脂类小泡。优选将离子转运蛋白，可以是遗传改变过的蛋白插入所述小泡中。另外，可以检查亚细胞膜结构(例如线粒体、溶酶体、内质网、细胞核)，植物细胞和原核细胞(例如细菌)，因为与现有膜片钳技术的状态不同，本发明方法可以对直径远远超越1微米的结构进行定位和密封。
在一种优选实施方案中，材料是从定位的细胞中采集/收获的，它可以是蛋白、脂类、RNA、DNA、酶和其他分子。
本发明还包括一种用于对细胞或其他膜结构进行膜片钳实验的新装置，优选用于上述方法。该装置包括至少一个毛细管，至少一个用于将细胞输送到所述毛细管腔内，并且将所述细胞定位于毛细管内的装置，以及进行膜片钳测定所需要的其他常用装置。所述毛细管以一种方式沿毛细管长度方向变细，至少在一个部位具有小于待测定细胞外径的内部直径。另外，以这种方式设计所述毛细管，以便可以将细胞导入所述毛细管腔并且定位，以便在细胞膜和毛细管内表面之间形成千兆欧密封。所述装置的设计及其优点直接与上文所披露的方法相关，并且该方法的说明是所述装置说明书的明确部分。
在本发明的一种优选实施方案中，所述装置包括可以用至少一种溶液或细胞悬浮液冲洗和排出所述毛细管腔的装置。为此可以采用用于供给和排出所述毛细管的诸如水箱、管的液体容器，以及用于悬浮液和溶液的泵，移液管、阀和压力/流量计。
在本发明的一种优选实施方案中，所述冲洗/排出装置可以用被设计用于将所述细胞离心到毛细管中的装置补充或取代。
所述装置可以包括用于测定电阻的装置(例如电极，优选用氯化银或碳纤维和电缆制成)或用于分析细胞/毛细管系统的光学特性的装置，优选激光源，光学纤维，和光学检测仪。为了控制并调整细胞在毛细管内的定位，可以使用所述装置。
本发明的上述优点在本发明的一种优选实施方案中表现的最明显，其中，使用了多个锥形毛细管，优选微量移液管。所述毛细管优选以规则间隔排列的形式排列。这样可以实现膜片钳方法的自动化，因为密封在毛细管中的细胞可以被同时检查或依次快速检查。
在使用多个毛细管的实施方案中，第一步可以将细胞定位在所述毛细管内。由于定位的细胞受到了机械保护并且是可靠紧密的，第二步可以将装有细胞的毛细管转移到测定装置中。另外，如果密封的努力或打开所述膜的努力失败的话，可以更换装有细胞的毛细管。在本实施方案中，可以组装一系列定位的、密封的和开放的细胞。
在采用多个毛细管的实施方案中，可以方便地实现这种毛细管彼此之间以及毛细管与环境之间的电屏蔽。在这种场合下，优选将金属或任何其他导电材料的接地屏蔽物用于封闭所述毛细管。例如，所述屏蔽物可以是部分或完全包封所述毛细管的圆筒形式。
在采用多个毛细管的实施方案中，优选使用多个液体容器，优选微型孔，这些孔容纳含有细胞和化合物的悬浮液或溶液。所述容器可以是微量滴定板上的孔。容器的数量和排列优选与毛细管排列相关。这样可以将液体从一个特定的孔转移到相应的毛细管中，例如使用活塞移液管。
在上述实施方案中，所述毛细管和液体容器优选以如下方式排列或移动，以便包括细胞悬浮液在内的悬浮液或溶液能够方便地转移到毛细管腔中。附图和
提供了所述结构的例子。
在一种优选实施方案中，所述装置中的至少一个毛细管是沿该毛细管的长度方向变细的，以便至少在一个部位具有小于待测定细胞外径的内径，以便采用在本发明中所披露的方法。所述毛细管优选由玻璃制成，并且优选是微量移液管。
所披露的特征和说明以及其他特征和说明来自以下实验方法和
。可以将不同的特征单独或组合应用于所述实验方法或附图中。
图1是比较用常规膜片钳技术(A)和本发明方法(B)定位细胞的示意图；图2是本发明毛细管的一种实施方案的示意图；图3是分别选择性地透化膜的一侧的示意图；图4是处在密封状态的含有细胞的毛细管的两种其他实施方案的示意图；图5是用于自动化膜片钳的装置的示意图，包括装有细胞的毛细管和其他装置；图6是通过吸力和自动化膜片钳自动定位的多个毛细管排列的示意图；图7是通过离心和自动化膜片钳实现自动化定位的多个毛细管排列的示意图；
图8是随着电压跃变的电流轨迹，证实在细胞定位于毛细管内期间，由于千兆欧密封的形成而导致的阻抗增加；以及图9是定位于玻璃微量移液管顶端内的细胞的显微照片。
图1表示本发明方法和现有常规膜片钳技术的差异。图1A表示通过常规膜片钳方法实现的细胞与微量移液管顶端的结合(密封)。所述密封是在移液管开口边缘和细胞膜之间形成的。箭头表示在将移液管顶端压在细胞上并且对移液管内部施加真空时吸力/流动的方向。图1B表示通过本发明的方法定位并密封细胞。箭头表示在悬浮的细胞向微量移液管顶端移动时细胞的流动和/或移动方向，例如，在图1B中，有三个悬浮的细胞向微量移液管顶端移动。图1B还表示与锥形移液管内壁形成密封的细胞。可以对该细胞进行膜片钳实验。与现有技术的状态不同，本发明的方法不需要朝向所述细胞移动微量移液管。将细胞冲洗到移液管腔中，并且定位于锥形部分。该方法不仅简单，而且还没有必要用显微镜控制定位以及用显微操作器定位微量移液管。这样就能够在任何场合下将该装置微型化和自动化。
图2表示毛细管和用本发明方法定位和密封的细胞。将所述毛细管制成细管(外径1.5毫米，内径1.2毫米)，并且在图中所示例子中它向下收缩成一个小的开口(0.5-1微米)。将细胞(直径大约等于10微米)定位于该锥形部分，并且细胞膜与所述锥形部分的内表面形成密封，该锥形部分优选是由玻璃制成。锥形部分开口上的两条细小的线条指示在右侧对细胞膜进行透化。在所述毛细管两侧插入用于输送冲洗/排出溶液和悬浮液的细管(外径0.2毫米，内径0.1毫米)。箭头表示液体流动方向。所述冲洗/排出装置可用于将细胞悬浮液填充到毛细管中(左侧入口和出口)，或者排出细胞悬浮液，例如在实验之后排出(左侧入口和出口)。另外，可将所述管用于清洗毛细管(左侧和右侧入口和出口)或用于添加药用物质，膜透化化学物和其他化合物(左侧和右侧入口和出口)。另外，将电极插入毛细管腔中(例如氯化银导线，外径0.2毫米)，它对电流和/或电压进行电测定，并且注入电流。可以根据相应的要求调整毛细管、锥形部分和入口和出口的尺寸，例如调整到具有不同大小的细胞类型的直径。
图3表示可以在周向密封的两侧对细胞膜进行透化，即可以在锥形部分的变小的入口一侧或出口一侧对细胞膜进行透化。所述透化作用可以用双线条表示。在以上说明中提供了相关的信息。
图4表示锥形毛细管的两种额外的、替代的模型，细胞分别密封在细小部分。图4的左侧图片表示向后弯折的锥形部分，在毛细管的最细的部分露出一个圆形的边缘或边沿。在图4中的右侧图片表示具有沙漏形状的毛细管，其锥形部分在最细部位的两侧是镜像对称的。在图4中表示的特征在此被明确要求作为本发明说明书的一部分。
图5表示本发明装置的示意图。图5中示出了被制成类似于图2所示模型的微量移液管的玻璃毛细管1。在锥形毛细管1的喷嘴状部分，放置了一个用于实验的细胞。将入口和出口2插入细胞两侧的毛细管腔的两个末端。所述入口和出口与泵和压力/流量计3连接，通过它们在容器5和毛细管1之间转移液体，并且测定压力和/或流率。将电极8插入毛细管1的两侧。所述电极用入口/出口下面的线条表示(图2)。
在图5中示出了激光源6和光线检测仪7。由它们控制细胞在毛细管1中的定位和固定。所有相应的元件都与控制装置4形成电连接，该控制装置包括一台计算机，并且记录数据，进行电压和/或电流钳制(参见下文)，分析数据，以及控制和调节所述装置。
图6和7表示将多个毛细管组装在一起的装置。这些毛细管排列成平的规则的排列，并可以由该装置定位于相应排列的多个容器上方。所述容器可以是在微量滴定板上的微量容器，如图6和7所示。移液管的较大的开口朝向所述微量容器，并可以移动到这些容器内。所述容器中可以填充细胞悬浮液。在图6的下部，所述悬浮液被吸入移液管中。在图7中通过离心使悬浮的细胞向移液管顶端移动。为此，将移液管排列支架安装在一个转子上。通过旋转，离心力能将细胞移向移液管的变细部分。图7的下部表示另一种微量滴定板。在该板上的容器中可以填充药用物质的溶液。可以将保持细胞的移液管排列浸入所述容器中，以便测试药用化合物。作为替代或补充，可以通过液体控制装置，例如移液机构将物质或其溶液从容器中转移到保持细胞的微量移液管中。
图8和9将在下面的实验说明中进行讨论。
实验说明使用微处理器控制的拉伸仪(Zeitz Instrumente，Augsburg，FRG)由硼硅玻璃(Clark Electromedical Ins truments，Reading，UK)拉制具有图2所示尺寸的膜片钳微量移液管。在拉伸仪中对移液管顶端进行火焰抛光，使其在含有150mM氯化钠水溶液中的顶端阻抗降低到2-3兆欧。为了降低电容量，用硅橡胶或石蜡对某些移液管顶端的外表面进行涂覆。
用EPC9膜片钳放大器(HEKA，Lambrecht，FRG)测定电压钳，并且获得数据。以10kHz将所述数据数字化，并且在2kHz下过滤。用HEKA提供的软件进行分析。“电压钳”表示在膜片钳测定中用于控制电参数的常用技术。高阻抗反馈电路将正确数量的电流注入所述生物学制品中，以便将电压保持在理想值上。模拟电路以高时间分辨率为特征，并且能够补偿电容电流、串联阻抗和泄露电流，这些电流有别于流经检查的膜结构的离子电流。
用消毒过滤的改性林格溶液填充所述移液管，该溶液含有145mM氯化钠，5mM氯化钾、2mM氯化钙、1mM氯化镁，10mM葡萄糖和10mM HEPES(pH7.4)。通过用氯化银涂覆的银丝使所述移液管与所述预放大器形成电连接。用细玻璃管将悬浮在大约10μm的RPMI培养基中的100-500个直径大约为5微米的Jurkat T细胞(ATCC，VA，USA)导入所述微量移液管中。然后将移液管顶端浸入装有接地电极的溶液中。通过5mV电压跃变测定电阻(参见图8a)。对所述移液管施加0.5巴的压力，将所述细胞冲向移液管顶端。一旦移液管的电阻增加到表明细胞定位于移液管锥形部分的水平就取消所述压力梯度(图8b)。
这种类型的实验能够再现移液管内部和细胞膜之间的千兆欧密封。与常规膜片钳方法类似，电阻在大于10千兆欧的范围内(参见图8C)。
该实验进一步证实所述细胞定位于移液管的变细的锥形部分，正如在图9所示的显微照片中所表明的。施加短的压力脉冲(1巴，200毫秒)或电压跃变(500mV，0.1毫秒)，能在细胞的一侧对细胞膜进行穿孔。这一点表现在电容电荷移动的增强上(电流瞬变过程)。千兆欧密封通常在长时间内(10-＞60分钟)是稳定的，并且甚至能耐受故意施加在微量移液管上的机械震动。
本文所披露的实验明确表明，通过将细胞导入以具有变细的锥形部分为特征的玻璃毛细管，可以获得细胞膜和移液管壁内表面之间的稳定的千兆欧密封。该密封的阻抗和稳定性高到足以获得上述优点。
权利要求
1.一种用膜片钳技术对细胞或类似结构进行测定的方法，其中，将至少一个细胞引入毛细管内腔中，使得沿着毛细管的长度，至少在一个位置具有小于所述细胞外径的内径；在所述部位将所述细胞定位于所述毛细管内部，在细胞膜和所述毛细管内表面之间形成所谓的千兆欧密封，该密封具有至少1千兆欧，优选至少10千兆欧的电阻；以及然后对所述细胞进行膜片钳实验。
2.如权利要求1所述的方法，其中，通过将含有该细胞的悬浮液或溶液冲洗或抽吸到毛细管中，将所述细胞引入并定位于毛细管内。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，通过对含有所述细胞的悬浮液或溶液施加离心和/或沉降作用，将所述细胞引入并定位于毛细管内。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述毛细管是玻璃毛细管。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述毛细管是所谓的微量移液管。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述较小的内径低于50微米，优选低于10微米。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述细胞的直径低于100微米，优选低于50微米，其中直径更优选为30微米-3微米。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，通过使所述细胞或含有所述细胞的所述悬浮液或溶液通过优选的消毒过滤的液体或溶液特别是生理盐溶液，将所述细胞或含有所述细胞的所述悬浮液或溶液引入所述毛细管内。
9.如权利要求8所述的方法，其中，在通过步骤之前将所述优选的消毒过滤的液体或溶液填充到毛细管中，由此至少覆盖将要产生千兆欧密封的位置。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在膜片钳实验之前或膜片钳实验期间控制所述细胞在毛细管内的位置，优选在细胞定位于毛细管腔内之后，通过测定压力或流动或电阻或者使用光学信号优选激光来进行控制。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在膜片钳实验之后将所述细胞从毛细管中取出，并且清洗毛细管，优选用合适的溶剂或化学物质冲洗该毛细管。
12.一种用于对细胞或类似结构以膜片钳方法进行实验的装置，其特别适用于如前述权利要求中任一项所述的方法，该装置包括至少一个毛细管，沿着该毛细管的长度，至少在一个部位具有小于细胞外径的内径，该毛细管设计成将至少一个细胞保持并且定位在该毛细管腔内，并且使得在细胞膜和所述毛细管内表面之间形成所谓的千兆欧密封，该密封具有至少1千兆欧，优选至少10千兆欧的电阻；至少一个被设计用于将所述细胞引入毛细管腔内并且将所述细胞定位的装置；和最终进行膜片钳实验所需要的其他装置。
13.如权利要求12所述的装置，其中，所述用于引入和定位的装置被设计成将至少一种包含所述细胞的悬浮液或溶液冲入毛细管腔和/或排出毛细管腔。
14.如权利要求13所述的装置，其中，其包括以下装置用于液体、悬浮液和溶液的作为储蓄器的容器；连接储蓄器和毛细管的入口和/或出口；用于液体、悬浮液和溶液的泵、阀和/或管；以及可选的用于测定压力和流动的装置。
15.如权利要求12-14中任一项所述的装置，其中，所述用于引入和定位的装置被设计用于将至少一种含有所述细胞的悬浮液或溶液离心分离到毛细管腔中。
16.如权利要求12-15中任一项所述的装置，其中，所述毛细管是玻璃毛细管。
17.如权利要求12-16中任一项所述的装置，其中，所述毛细管是所谓的微量移液管。
18.如权利要求12-17中任一项所述的装置，其中，所包括的装置用于测定电阻和/或优选利用激光来发光，并且用于在将细胞引入毛细管之后或将细胞引入毛细管期间分析光学信号。
19.如权利要求12-18中任一项所述的装置，该装置被设计成对细胞自动进行膜片钳实验，其中，多个毛细管优选布置成规则间隔的平的阵列。
20.如权利要求19所述的装置，其中，将多个容器优选微量滴定板上的孔设计成保持着含有细胞或化合物的溶液和悬浮液，并且其中容器的数量优选布置成对应于毛细管的数量。
21.如权利要求20所述的装置，其中，毛细管和容器以这种方式布置或定位，使得悬浮液或溶液及其相应的内含物可以从容器转移到毛细管，或者反之亦然。
22.如权利要求19-21中任一项所述的装置，其中，在密封的尝试失败之后可以更换毛细管，并且优选以这种方式使细胞开放，即，产生一毛细管阵列，其中，每一个毛细管包括准备用于膜片钳测定的密封的开放细胞。
23.一种用于实施如权利要求1-11中任一项所述的方法的毛细管，优选玻璃毛细管，优选微量移液管的用途，沿着该毛细管的长度，至少在一个位置具有小于细胞外径的内径。
24.一种毛细管，优选玻璃毛细管，优选微量移液管，该毛细管至少在一个位置具有小于100微米的直径，具有足以在膜片钳实验中提供千兆欧密封的清洁内表面，该毛细管被密封在无菌容器或包装中。
25.一种用于实施如权利要求1-11中任一项所述的方法的试剂盒，其包括至少一个如权利要求24所述的毛细管。
全文摘要
本发明披露了一种用于对细胞或类似结构进行膜片钳实验的方法，其中，将至少一个细胞插入毛细管腔内，并且定位于毛细管内部，以便在细胞膜和所述毛细管内表面之间产生超过1，优选10千兆欧阻抗的足够紧密的密封。在所述毛细管长度方向上具有至少一个部位具有小于所述细胞外径的内径。优选通过对含有所述细胞的悬浮液或溶液进行加压、抽吸、沉降、离心，将述细胞插入并定位于毛细管内。披露了用于使用该方法进行实验的装置。
文档编号G01N33/483GK1466681SQ01816624
公开日2004年1月7日 申请日期2001年7月31日 优先权日2000年7月31日
发明者A·莱普勒－维恩赫斯, A 莱普勒-维恩赫斯 申请人:弗里昂有限责任公司